miR-122靶向示蹤載體FA-OCC-QDs的生物學(xué)功能※

李潤樂，廖　瑜，段路路，趙　杰，劉昆梅，湯　鋒**

(1.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧 810001；

2.寧夏醫(yī)科大學(xué)顱腦疾病重點實驗室，寧夏，銀川，750004)

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miR-122靶向示蹤載體FA-OCC-QDs的生物學(xué)功能※

李潤樂1，廖瑜1，段路路1，趙杰1，劉昆梅2*，湯鋒1**

(1.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧 810001；

2.寧夏醫(yī)科大學(xué)顱腦疾病重點實驗室，寧夏，銀川，750004)

摘要目的明確小分子RNA-122(miR-122)靶向示蹤載體FA-OCC-QDs的生物學(xué)功能。方法通過化學(xué)修飾得到了帶有正電荷的葉酸靶向性雙親殼聚糖衍生物N-辛基O-羧甲基殼聚糖(FA-OCC)，并通過其疏水腔包裹CdSe量子點獲得了一種新型靶向性的示蹤殼聚糖衍生物FA-OCC-QDs。通過顯微結(jié)構(gòu)觀察、熒光波長掃描、zeta電位測定等方法考察FA-OCC-QDs的物理及光學(xué)活性，并對其靶向性、細(xì)胞攝取效率、轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞毒性等生物學(xué)活性進(jìn)行考察。結(jié)果FA-OCC-QDS具有靶向性高、轉(zhuǎn)染效率高及細(xì)胞毒性小的特點。結(jié)論小分子RNA靶向示蹤載體FA-OCC-QDs可作為靶向示蹤的miRNA載體，為后續(xù)小分子RNA的基礎(chǔ)研究提供有利的工具。

關(guān)鍵詞N-辛基O-羧甲基殼聚糖靶向載體熒光標(biāo)記

BIOLOGICAL FUNCTION OF TARGETING AND

TRACING DELIVERY FOR miR-122※

Li Runle1，Duan Lulu1，Zhao Jie1，Liu Kunmei2*，Tang Feng1**

(1.Research Center for High Altitude Medicine，Qinghai University，Xining 810001；

2.Ningxia Key laboratory of Cerebrocranial Diseases，School of Clinical Medicine，

Ningxia Medical University，Yinchuan 750004)

Abstract ObjectiveTo character the biological function and tracing delivery for miR-122.Method A novel targeting and biodegradable N-octyl-O，N-carboxymethyl chitosan-folic acid conjugate(OCC-FA)coated Quantum Dots(QDs)FA-OCC-QDs was designed and synthesized.The physicochemical properties of OCC-FA-QDs were investigated in detail.In addition，uptake efficiency，target efficiency and cytotoxicity were carried out in cell level with folate receptor overexpression on its surface.Results The result was shown that FA-OCC-QDS with evident targeting effect and no cytotoxicity.Conclution This research has successfully synthesized a targeting miR-122 carrier，It would provide a powerful tool for microRNA basic research.

KeywordsOCC-FA-QDsTargeting deliveryFluorescence labelin

熒光標(biāo)記物量子點由于其優(yōu)良的熒光性能，目前已在生物工程的各個領(lǐng)域廣泛使用。量子點(Quantum dots，QDs)是一種由Ⅱ-Ⅵ族(如CdSe、CdTe、CdS、ZnSe等)或Ⅲ-Ⅴ族(如InP、InAs等)元素組成的納米顆粒，又稱半導(dǎo)體納米晶體(nanocrystals，NCs)，目前對CdSe、CdTe研究較多[1-2]。QDs一般是直徑為1~10 nm的球狀晶體[3]，具有核殼結(jié)構(gòu)，以CdSe、CdTe等量子點為核，外部使用ZnS、ZnSe、CdS等形成表面的薄膜，此結(jié)構(gòu)具有較好的光化學(xué)穩(wěn)定性和高的發(fā)光產(chǎn)率。熒光標(biāo)記物的光譜性質(zhì)與形成無關(guān)，主要取決于半導(dǎo)體納米粒子的半徑大小，量子點產(chǎn)生光子的波長與其粒徑呈正相關(guān)，改變粒徑的大小可以獲得從紫外到近紅外范圍內(nèi)任意點的光譜[4]。QDs是一類重要的納米材料，經(jīng)過修飾后，其表面帶有活性功能集團(tuán)，能夠連接DNA和蛋白質(zhì)等[5-7]。

殼聚糖(chitosan)是由甲殼素(chitin)脫乙酰化制得的一種聚氨基葡萄糖，是含有(1，4)-2-乙酰胺基-D-葡糖單元和(1，4)-2-氨基-D-葡糖單元的共聚物[8]，后者一般超過65%。殼聚糖無毒，來源豐富，具有良好的可降解性和相容性[9]。近年來隨著給藥系統(tǒng)的發(fā)展，殼聚糖成為一種新型的輔料，在藥物控釋、緩釋、靶向智能釋藥中應(yīng)用廣泛[10-14]。

本課題擬通過雙親化學(xué)集團(tuán)修飾得到帶有正電荷的葉酸靶向性雙親殼聚糖衍生物N-辛基O-羧甲基殼聚糖(FA-OCC)，通過顯微結(jié)構(gòu)觀察、熒光波長掃描、zeta電位測定等方法考察FA-OCC-QDs的物理及光學(xué)活性，并對其腫瘤靶向性、細(xì)胞攝取效率、轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞毒性等生物學(xué)活性進(jìn)行考察。

1材料與方法

1.1材料

殼聚糖(脫乙酰度60%，相對分子量70kd)購自南通雙林生物制品有限公司；氧化鉻(CdO)、十八烷酸stearic acidCAS：57-11-4、氧化三辛基膦TOPO CAS：78-50-2、十六胺CAS：143-27-1、硒粉、二甲基鋅、六甲基二硅硫烷、正己烷、EDC、N，N-二甲基乙二胺、葉酸均購自美國Sigma公司。1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibico公司。乳腺癌MCF-7細(xì)胞株為本實驗室保存品。乙酸、一氯乙酸、冰醋酸、正辛醛、甲醇等常規(guī)試劑均為市場分析純。

1.2實驗方法

1.2.1CdSe量子點的合成

1 mmol氧化鉻溶于1 g十八烷酸并加熱，當(dāng)形成澄清溶液時，加入5 g氧化三辛基膦(TOPO)和5 g十六胺混合物，在氮氣條件下加熱至250 ℃反應(yīng)10 min后升高至350 ℃時加入等摩爾的硒溶液注射至反應(yīng)體系，當(dāng)混合物變?yōu)槌燃t色表明量子點形成，350 ℃反應(yīng)2 min得到綠色熒光量子點，400 ℃反應(yīng)20 min得到紅色熒光量子點，然后加入保護(hù)溶液20 mM二甲基鋅和六甲基二硅硫烷去保護(hù)CdSe core。將量子點冷卻至室溫，加入甲醇和正己烷洗滌并離心。

1.2.2FA-OCC的合成

1.2.2.1合成N-辛基O-羧甲基殼聚糖(OCC)

將O-殼聚糖4 g和正辛醛4 mL加入到120 mL的甲醇中，30 ℃攪拌12 h，少量分批加入KBH4 3 g，持續(xù)攪拌12 h，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)至中性后過濾。分別使用甲醇和水交替洗滌濾餅3～4次，并將濾餅真空干燥，得到中間產(chǎn)物N-辛基殼聚糖[15-16]。

1.2.2.2制備OCC-NH2

準(zhǔn)確稱取2 g OCC溶于濃度為1% 的乙酸溶液，然后借助pH測試儀調(diào)節(jié)溶液pH至5.0(5%NaOH)，室溫下邊攪拌邊加入EDAC活化羧基，繼續(xù)攪拌18 h后加入葉酸，反應(yīng)完成后使用5%NaOH調(diào)節(jié)pH至弱酸性，然后通過高速離心機(jī)離心溶解、超聲細(xì)胞破碎儀超聲、透析袋透析得到終產(chǎn)物FA-OCC[17]。

1.2.2.3修飾葉酸

參照Hou Z等人的方法[18]稱取0.5 g OCC-NH2將其溶于濃度為1% 的乙酸溶液，調(diào)節(jié)pH至5.0，室溫條件下邊攪拌并緩慢加入EDAC活化羧基連續(xù)攪拌18 h后加入葉酸，待反應(yīng)完成后用5% NaOH調(diào)節(jié)溶液體系pH至弱堿性(pH=8.0)，經(jīng)高速離心機(jī)離心溶解、超聲細(xì)胞破碎儀超聲、透析袋透析得到0.27 g最終產(chǎn)物FA-OCC[19]。

1.2.3FA-OCC包裹CdSe量子點

將配置好的FA-OCC溶液和過量的量子點氯仿溶液混合，搖勻后室溫放置，離心后取上清得到相應(yīng)發(fā)光波長的不同熒光強度的水溶性殼聚糖-量子點熒光探針，后用電子顯微鏡、熒光掃描儀等測定量子點標(biāo)記殼聚糖的熒光、粒徑及表面電荷等。

1.2.4葉酸靶向性的FA-OCC-QDs攜帶microRNA

配制2%的水溶性殼聚糖-量子點熒光RNA載體溶液，將殼聚糖溶液與5 μL的20 nM的miR-122-mimics的DEPC水溶液按體積比1：1、1：2、1：3、1：4、1：5混合，混勻，室溫靜置10 min，待殼聚糖與RNA結(jié)合后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5FA-OCC-QDs探針細(xì)胞毒性的檢測

將miR-122-mimics與已經(jīng)過化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾的殼聚糖載體按1：3的計量混合后，室溫靜置30 min，使目的RNA與量子點標(biāo)記靶向性殼聚糖載體充分結(jié)合后分別將0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 μL靶向性殼聚糖載體加入細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔設(shè)3個副孔，培養(yǎng)24 h后加入MTT，用MTT法檢測。

2結(jié)果

2.1CdSe量子點的光學(xué)活性

倒置熒光顯微鏡實驗結(jié)果顯示，在紫外激發(fā)光下，成功獲得了具有綠色熒光和紅色熒光的CdSe量子點，見圖1A、C，其中綠色熒光CdSe量子點的最大發(fā)射為437 nm ，見圖1B，紅色熒光CdSe量子點的最大發(fā)射波長為535 nm，見圖1D。

Figure 1　Optical characteristic of CdSe QDs

2.2N-辛基O-羧甲基殼聚糖FA-OCC-QDs的粒徑

粒徑儀檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)A-OCC粒徑的平均粒徑為257.0 nm，制備的納米粒粒度分析顯示，納米粒大小比較均勻，粒徑分布范圍較窄。

2.3N-辛基O-羧甲基殼聚糖FA-OCC-QDs 的電鏡觀察

電鏡觀察結(jié)果顯示，F(xiàn)A-OCC-QDs的平均粒徑大約為220 nm，并且呈球形分布，見圖2。相比于粒徑檢測儀結(jié)果略小，原因可能是粒徑分析儀顯示的粒徑是FA-OCC-QDs在水溶液中的分布，而電鏡的檢測條件是干燥的，這與先前的研究報道結(jié)果相似[20-21]。

Figure 2　Size distribution and TEM image of FA-OCC-QSs

2.4N-辛基O-羧甲基殼聚糖FA-OCC的Zeta電位

Zeta電位分析儀測定結(jié)果為FA-OCC-QDs的Zeta電位為0.8 mV。Zeta電位測定顯示，F(xiàn)A-OCC-QDs納米粒表面帶有正電荷， 能夠與RNA表面的負(fù)電荷利用正負(fù)電荷相互吸引偶聯(lián)從而進(jìn)行結(jié)合，見圖3。

Figure 3　Zeta potential of FA-OCC-QDs

2.5N-辛基O-羧甲基殼聚糖FA-OCC-QDs的光學(xué)活性

結(jié)果表明，F(xiàn)A-OCC包裹CdSe紅色量子點后熒光強度略微變小，見圖4；激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，F(xiàn)A-OCC-QDs分布均勻，且包裹率達(dá)到了后續(xù)實驗的要求。

Figure 4　Optical characteristic of FA-OCC-QDs

2.6N-辛基O-羧甲基殼聚糖FA-OCC-QDs的細(xì)胞毒性

在FA-OCC-QDs的光學(xué)活性達(dá)到了示蹤的要求后，我們運用MTT實驗進(jìn)一步驗證了FA-OCC-QDs的細(xì)胞毒性。實驗結(jié)果表明，F(xiàn)A-OCC-QDs在低濃度時無明顯的抑制作用，IC50為0.22 μM，見圖5。

Figure 5　Cytotoxicity of FA-OCC-QDs in breast cancer cell lines MCF-7

2.7N-辛基O-羧甲基殼聚糖FA-OCC-QDs的miRNA載體活性

由于FA-OCC-QDs表面帶有正電荷的特性，我們考察了0.05 μM濃度FA-OCC-QDs溶液攜帶小分子RNA的能力，RNA的濃度為20 μM，見圖6，當(dāng)RNA與FA-OCC-QDs的體積比為1：3時，能夠完全攜帶小分子RNA。

Figure 6　The capability of FA-OCC-QDs carrying RNA( RNA：FA-OCC-QDs)

2.8N-辛基O-羧甲基殼聚糖FA-OCC-QDs攜帶小分子RNA的轉(zhuǎn)染效率

在驗證了FA-OCC-QDs攜帶小分子RNA的能力后，我們將其與商業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑lipo-2000攜帶FITC標(biāo)記的小分子RNA進(jìn)行了轉(zhuǎn)染效率的對比，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率與熒光強度均高于商業(yè)化的lipo-2000，見圖7。

攜帶miR-122-mimics與攜帶對照組NC相比，在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中能夠穩(wěn)定上調(diào)miR-122的表達(dá)水平，但是表達(dá)水平略低于lipo-2000，見圖8?？赡茉蚴荈A-OCC部分帶正電荷的-NH2包裹在疏水腔內(nèi)，結(jié)合帶負(fù)電的RNA后起到了緩釋作用而造成。

Figure 7　The transfection efficiency of FA-OCC-QDs compare to Lipo-2000

The normalized miR-122 expression for NC was set 1.Data were present as mean±SEM，n=3，*P<0.05，**P<0.01 vs. NC group， #P<0.05 vs. lipo-2000 group

Figure 8Expression of miR-122 by transfected with lipo-2000 and FA-OCC-QDs

3討論

與傳統(tǒng)的有機(jī)染料熒光物質(zhì)相比較，量子點主要有以下幾個方面的優(yōu)點：(1)量子點是無機(jī)半導(dǎo)體熒光材料，用高于帶隙能量的光均可以激發(fā)，激發(fā)譜為連續(xù)譜帶，具有發(fā)射譜較窄的特點，半峰高寬通常為30 nm左右；(2)其光穩(wěn)定性高于傳統(tǒng)的有機(jī)發(fā)光染料，使得研究人員可以長時間觀察細(xì)胞、分子在組織中的活動；(3)可以通過調(diào)整量子點的尺寸來得到不同顏色的發(fā)射熒光[20，22-23]。

目前應(yīng)用廣泛的RNA載體包括病毒載體系統(tǒng)及非病毒載體系統(tǒng)：病毒載體存在著致瘤或引發(fā)免疫應(yīng)答等安全性問題，且質(zhì)量控制困難、不易大量生產(chǎn)；非病毒載體主要是殼聚糖衍生物、二氧化硅、磁流體、聚乳酸等，由于CdSe量子點的毒性較大，非病毒載體需要在其表面進(jìn)行包裹和修飾，從而降低毒性并引入活性基團(tuán)，利于增強熒光示蹤劑與生物素的親和力和特異性。而殼聚糖是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一天然堿性多糖，分子鏈上豐富的-NH2基和-OH基等活性基團(tuán)有利于其化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾，殼聚糖改性后，顯示出更好的溶解性、穩(wěn)定性、低毒性、生物相容性等多種功能特性，作為載體的應(yīng)用愈來愈具有廣闊的研究前景，尤其是優(yōu)良的生物相容性和生物可降解性，使殼聚糖成為當(dāng)今最具潛力的非病毒性基因載體之一。隨著對殼聚糖的修飾及其生物學(xué)活性不斷地深入研究，殼聚糖作為載體材料的發(fā)展趨勢將更加明朗，其應(yīng)用領(lǐng)域也會不斷趨向多元化。

本課題通過雙親基團(tuán)修飾殼聚糖得到了雙親殼聚糖衍生物FA-OCC-QDs，雙親基團(tuán)的修飾不但增強了殼聚糖水溶性，而且其內(nèi)部的疏水腔可以用來包裹脂溶性藥物或細(xì)胞毒性大的示蹤物質(zhì)；在雙親基團(tuán)修飾的基礎(chǔ)上，通過修飾-NH2可以控制FA-OCC-QDs表面的電位，為小RNA類藥物提供新的藥物載體。

參考文獻(xiàn)

[1]Vanmaekelbergh D，Liljeroth P.Electron-conducting quantum dot solids：novel materials based on colloidal semiconductor nanocrystals[J].Chem Soc Rev，2005，34：299-312.

[2]Doty RC，F(xiàn)ernig DG，Levy R.Nanoscale science：a big step towards the Holy Grail of single molecule biochemistry and molecular biology[J].Cell Mol Life Sci，2004，61：1843-1849.

[3]Li ZH，Peng J，Chen HL.Bioconjugated quantum dots as fluorescent probes for biomedical imaging[J].J Nanosci Nanotechnol，2011，11：7521-7536.

[4]Lu ZS，Li CM.Quantum dot-based nanocomposites for biomedical applications[J].Curr Med Chem，2011，18：3516-3528.

[5]Barroso MM.Quantum dots in cell biology[J].J Histochem Cytochem，2011，59：237-251.

[6]Gao J，Chen X，Cheng Z.Near-infrared quantum dots as optical probes for tumor imaging[J].Curr Top Med Chem，2010，10：1147-1157.

[7]Ma Q，Su X.Near-infrared quantum dots：synthesis，functionalization and analytical applications[J].Analyst，2010，135：1867-1877.

[8]Ray SD.Potential aspects of chitosan as pharmaceutical excipient[J].Acta Pol Pharm，2011，68：619-622.

[9]Kean T，Thanou M.Biodegradation，biodistribution and toxicity of chitosan[J].Adv Drug Deliv Rev，2010，62：3-11.

[10]Zhang J，Xia W，Liu P，et al.Chitosan modification and pharmaceutical/biomedical applications[J].Mar Drugs，2010，8：1962-1987.

[11]Andrade F，Antunes F，Nascimento AV，et al.Chitosan formulations as carriers for therapeutic proteins[J].Curr Drug Discov Technol，2011，8：157-172.

[12]Chan P，Kurisawa M，Chung JE，et al.Synthesis and characterization of chitosan-g-poly(ethylene glycol)-folate as a non-viral carrier for tumor-targeted gene delivery[J].Biomaterials，2007，28：540-549.

[13]Park Y，Kang E，Kwon OJ，et al.Tumor targeted adenovirus nanocomplex ionically crosslinked by chitosan[J].J Control Release，2010，148：e124.

[14]Zu Y，Zhao Q，Zhao X，et al.Process optimization for the preparation of oligomycin-loaded folate-conjugated chitosan nanoparticles as a tumor-targeted drug delivery system using a two-level factorial design method[J].Int J Nanomedicine，2011，6：3429-3441.

[15]張燦，丁婭，平其能.新型兩親性N-辛基-N-PEG化殼聚糖衍生物的合成與表征[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報，2005，36：201-204.

[16]李紅霞，張燦，尤啟東.N-辛基-N'-亞氨基-o-羧甲基殼聚糖衍生物的合成、表征與體外PH敏感性[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報，2009，40(5)：385-388.

[17]Zou A，Huo M，Zhang Y，et al.Octreotide-modified N-octyl-O，N-carboxymethyl chitosan micelles as potential carriers for targeted antitumor drug delivery[J].J Pharm Sci，2012，101：627-640.

[18]Hou Z，Zhan C，Jiang Q，et al.Both FA- and mPEG-conjugated chitosan nanoparticles for targeted cellular uptake and enhanced tumor tissue distribution[J].Nanoscale Res Lett，2011，6：563.

[19]Zhao H，Yung LY.Selectivity of folate conjugated polymer micelles against different tumor cells[J].Int J Pharm，2008，349：256-268.

[20]Cao J，Zhu H，Deng D，et al.In vivo NIR imaging with PbS quantum dots entrapped in biodegradable micelles[J].J Biomed Mater Res A，2012，100：958-968.

[21]Cadena-Nava RD，Hu Y，Garmann RF，et al.Exploiting fluorescent polymers to probe the self-assembly of virus-like particles[J].J Phys Chem B，2011，115：2386-2391.

[22]Thiollet S，Higson S，White N，et al.Investigation and Development of Quantum Dot-Encoded Microsphere Bioconjugates for DNA Detection by Flow Cytometry[J].J Fluoresc，2011.

[23]Chattopadhyay PK.Quantum dot technology in flow cytometry[J].Methods Cell Biol，2011，102：463-477.

收稿日期2015-07-10

DOI：10.13452/j.cnki.jqmc.2015.04.007

中圖分類號R318.08

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

※：國家自然科學(xué)基金項目(No.81360300)；青海省自然科學(xué)基金項目(No.2013-Z-931Q)

李潤樂(1987~)，女，回族，寧夏籍，博士研究生. *：通訊作者，博士，副教授；**：通訊作者，副教授，碩導(dǎo)