青南藏區(qū)多房棘球絳蟲系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析※

李超群，張耀剛，曹得萍

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

?

青南藏區(qū)多房棘球絳蟲系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析※

李超群，張耀剛，曹得萍※※

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

摘要目的對(duì)青南藏區(qū)流行的多房棘球絳蟲基因多態(tài)性及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行初步分析。方法利用線粒體DNA細(xì)胞色素氧化酶亞單位Ⅰ(COX Ⅰ)行分子標(biāo)記，以COX Ⅰ為基因marker設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增COX Ⅰ部分基因序列，將得到的11條堿基序列通過Clustal X軟件進(jìn)行多重序列分析比對(duì)，與13條來自GenBank的棘球絳蟲COX Ⅰ序列共同構(gòu)建貝葉斯進(jìn)化樹。結(jié)果用于分析的標(biāo)本序列與來源于亞洲的中國(guó)(四川，內(nèi)蒙古)、哈薩克斯坦和歐洲的法國(guó)、斯洛伐克的多房棘球絳蟲型聚于一枝，位于發(fā)育樹的冠部，并在這一枝內(nèi)部形成梳齒狀分支。結(jié)論流行于青南藏區(qū)的多房棘球蚴標(biāo)本存在基因多態(tài)性，其系統(tǒng)發(fā)育復(fù)雜。

關(guān)鍵詞青南藏區(qū)多房棘球絳蟲細(xì)胞色素氧化酶亞單位Ⅰ系統(tǒng)發(fā)育

PRELIMINARY PHYLOGENETIC ANALYSIS OF

EchinococcusmultilocularIN QINGHAI SOUTHERN

PLATEAU INFERRED BY CYTOCHROME OXIDASE

SUBUNIT I GENE SEQUENCE※

Li Chaoqun，Zhang Yaogang，Wu Defang，Cao Deping※※

(Department of Joint，Qinghai University Affiliated Hospital，Xining 810001，China)

Abstract ObjectiveTo analysis the phylogeny and genetic polymorphism of Echinococcus multilocular in Qinghai southern plateau.Methods We designed and synthesized the primers of COX Ⅰ gene，and used PCR to cloned 11 sequences from hepatic sample which infected byEchinococcusmultilocular.The sequences were aligned using Clustal X，and then，Bayesian analyses were performed with 13 sequences of COX Ⅰ gene from the GenBank.Results In the phylogenetic tree，all ofEchinococcusmultilocularisolates belongs toEchinococcusmultilocularwhich originate from different places，such as China(Sichuan，Inner Mongolia )，Kazakhstan of Asia，F(xiàn)rance and Slovakia of Europe，they located on the phylogenetic tree crown，and form a comb shaped branch in this branch of internal.Conclusion There are many gene polymorphism concerningEchinococcusmultilocularisspecimens which specially popular in the southern regions of Qinghai province.

KeywordsThe south region of Qinghai provinceEchinococcusmultilocularisCytochrome oxidase subunitⅠPhylogeny

泡球蚴病(Alveolar Echinococcosis，AE)是多房棘球絳蟲(Echinococcus multilocularis，Em)的繼絳期幼蟲寄生于人體內(nèi)(多見于肝臟部位)引起的疾患。在利用DNA序列特征對(duì)蟲株確定研究中，因線粒體DNA具有其母系遺傳、突變率高、極少發(fā)生重組等特性，所以在分子遺傳學(xué)和人類學(xué)研究上都有重要的意義[1]。本文利用COXⅠ分子標(biāo)記，通過對(duì)收集的11份流行于青海省多房棘球蚴標(biāo)本和GenBank下載的13條絳蟲COXⅠ基因序列行比對(duì)、堿基分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究。

1材料與方法

1.1標(biāo)本采集

標(biāo)本采集于青海大學(xué)附屬醫(yī)院和解放軍第四陸軍醫(yī)院，共11例，類型為AE手術(shù)標(biāo)本。

1.2 基因組DNA提取

使用細(xì)胞/組織提取基因組試劑盒[離心柱型，天根生化科技(北京)有限公司]，從標(biāo)本中提取多房棘球蚴基因組DNA。

1.3PCR擴(kuò)增、純化以及測(cè)序

引物以細(xì)胞色素氧化酶 I(COXⅠ)基因?yàn)橐罁?jù)設(shè)計(jì)，序列[2]為F：5′-TATTGGAGATTATGGATCTG-3′和R：5′-AAAGCGGGCGCGCGGTGCTG-3′。反應(yīng)體系：50 μL 的2×PCR Master緩沖液，10 pmol/μL的COXⅠ F和COXⅠ R各4 μL，所提取的基因組DNA 6 μL，用ddH2O補(bǔ)足100 μL。置于PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。擴(kuò)增條件：在溫度為94 ℃時(shí)行預(yù)變性，時(shí)長(zhǎng)為8 min，同等溫度下變性30 Sec，于54 ℃復(fù)性30 Sec，72 ℃下延伸1 min，變性、復(fù)性和延伸三個(gè)過程經(jīng)歷35 個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸8 min。反應(yīng)結(jié)束后，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收擴(kuò)增產(chǎn)物。完成純化后每個(gè)樣本取5 μL產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳(觀察目的片段)，將剩余的回收產(chǎn)物送上海生工公司進(jìn)行DNA單向測(cè)序。

1.4系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

將擴(kuò)增得到的COXⅠ基因序列在Genbank上進(jìn)行Blast比對(duì)，選取與標(biāo)本同源性高，且具有代表性的13條序列下載(表1)，將這13條序列與測(cè)序所得的11條基因序列，在默認(rèn)參數(shù)下，用Clustal X[3]軟件進(jìn)行比對(duì)，后續(xù)使用Seqvis v.1.3[4]、PAUP*4.0B10[5]和MEGA v.4.1[6]三個(gè)軟件對(duì)24條序列的異質(zhì)性、堿基組成和變異位點(diǎn)、遺傳距離以及轉(zhuǎn)化和顛換比率進(jìn)行檢驗(yàn)。使用軟件DAMBE[7]對(duì)COXⅠ序列進(jìn)行單倍型分析。最后建貝葉斯樹：用Modeltest3.7[8]軟件依據(jù)Akaike信息量準(zhǔn)則(AIC)和PAUP*4.0B10軟件運(yùn)行得到最適于貝葉斯算法分析的核酸進(jìn)化模型之后，用Mrbayes-3.1.2[9]軟件構(gòu)建最后的Bayesian系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

表113株棘球絳蟲信息表

Table 1 Information of 13 Echinococcus spp

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用Win-paup*4.0B10軟件對(duì)序列堿基的組成進(jìn)行分析，采用χ2檢驗(yàn)對(duì)序列所有位點(diǎn)堿基組成的穩(wěn)定情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR產(chǎn)物在凝膠電泳檢測(cè)中得到11例樣本PCR擴(kuò)增片段的位置相同(圖1)。

圖1　泡球蚴標(biāo)本COXⅠ基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)圖

2.2堿基組成和飽和檢驗(yàn)分析

測(cè)序得到的11條序列在GeneBank進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示其與多房棘球絳蟲基因的同源性高。利用SeqVis程序?qū)?4條序列(11條為樣本序列，13條為GenBank下載序列)行異質(zhì)性分析，顯示異質(zhì)性好(圖2)。且經(jīng)過DAMBE軟件的單倍型分析，從24條序列中找出23個(gè)單倍型。用于分析的序列長(zhǎng)度在778 bp(ZB40)到787 bp(ZB47)之間。在792個(gè)位點(diǎn)中共有276個(gè)變異位點(diǎn)、137個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。4種堿基頻率(表2)是A=0.172、C=0.100、G=0.235、T=0.493(堿基總和為1)，A+T(0.665)>C+G(0.335)。樣本的全部編碼位點(diǎn)的堿基頻率檢測(cè)結(jié)果(χ2= 26.275df=69P=0.999)具有同質(zhì)性。經(jīng)MEGA v.4.1軟件分析得出，用于分析的全部序列的轉(zhuǎn)換與顛換比的平均似然估計(jì)值(R值)大小為1.611，全部序列平均遺傳距離是0.073，兩兩遺傳距離研究：樣本蟲株(ZB43)與豬帶絳蟲(AB086256)之間遺傳距離最大為0.265。

圖2　SeqVis 程序得到的24條序列異質(zhì)性圖

表224條序列堿基組成情況

Table 2 the base composition rates in 24 sequence

2.3系統(tǒng)發(fā)育分析

把從GenBank下載所得的豬帶絳蟲(AB086256)的COXⅠ基因序列作為外群，構(gòu)建Bayesian系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。系統(tǒng)發(fā)育顯示：青南地區(qū)的11例多房棘球絳蟲標(biāo)本均與來源為亞洲中國(guó)(四川，內(nèi)蒙古)、哈薩克斯坦和歐洲的法國(guó)、斯洛伐克的多房棘球絳蟲型，即均與AB477010(A8)、AB461417、AB461415、AB461420、AB461413和AB461414聚在一支[后驗(yàn)概率(PP)=1.00]，位于發(fā)育樹的冠部，但因存在較大的基因多態(tài)性，故在這一枝內(nèi)部形成梳齒狀分支。且蟲株之間形成姐妹枝(PP>0.60)。AB745463(G10)和AB235848(G8)聚在一枝與AB235846(G5)形成姐妹枝。而所收集的青南地區(qū)多房棘球絳蟲蟲株標(biāo)本與E.shiqucius(AB208064)蟲株之間親緣性較遠(yuǎn)。

ZB：Sample NumberAB、AF：GenBank accession Number

3討論

青海位于中國(guó)的西北部，因其具有的特殊高原氣候環(huán)境，代表性的少數(shù)民族的生活方式和生活習(xí)慣，使當(dāng)?shù)厝撕蛣?dòng)物棘球絳蟲的感染十分普遍，囊型包蟲和泡型包蟲在該地區(qū)廣泛流行和擴(kuò)散[10]，人體包蟲病在六個(gè)牧業(yè)州均有較重流行，尤其青南各縣，如稱多縣、甘德縣、瑪沁縣、河南縣和澤庫(kù)縣其平均患病率高達(dá)6. 81%[11]。故對(duì)青南地區(qū)棘球絳蟲的研究有著重要的意義。付永[13]、朵紅[14]等對(duì)青南地區(qū)狐、犬分離株進(jìn)行同源蟲株的研究中顯示，青海省藏犬、野狐中存在有E.G1、Em、Echinococcusshiguicus(E.S)三種絳蟲的感染，其中以細(xì)粒棘球絳蟲(G1)型流行較廣，但在野生狐貍中常見的絳蟲感染類型是多房棘球絳蟲的感染，也有部分病例是石渠棘球絳蟲感染。同時(shí)由朵紅等人在應(yīng)用COXⅠ基因?qū)λ占募蚪{蟲基因多態(tài)性進(jìn)行分析時(shí)，得出32條基因序列，證實(shí)了棘球絳蟲存在核苷酸變異以及具有基因的多態(tài)性。本研究以人體為分離株，利用COXⅠ對(duì)多房棘球絳蟲的發(fā)育學(xué)進(jìn)行研究。多房棘球絳蟲主要分布于北半球的高寒地帶，遍及北美、歐洲、亞洲這三洲。本研究結(jié)果顯示，所收集標(biāo)本與來源為亞洲的中國(guó)(四川，內(nèi)蒙古)、哈薩克斯坦和歐洲的法國(guó)、斯洛伐克地方的多房棘球絳蟲型聚于一支。說明青南地區(qū)的多房棘球絳蟲與這些地方的多房棘球絳蟲蟲株間具有很高的同源性。在這枝內(nèi)部，青南地區(qū)樣本蟲株ZB30、ZB31、ZB45和中國(guó)四川地方的AB477010(A8)蟲株間形成姐妹枝(PP=0.67)，證明這三個(gè)標(biāo)本蟲株與四川的多房棘球絳蟲的(A8)型的親緣性相近。此外，青南地區(qū)樣本蟲株ZB43和ZB47聚于一枝(PP=1.00)與樣本ZB32形成姐妹枝(PP=1.00)，可看出這3例蟲株標(biāo)本之間具有良好的親緣性。而其他蟲株也形成有不同的小分枝或成梳齒狀，這些小分枝的形成證實(shí)了蟲株間存在有基因的多態(tài)性。這種多態(tài)性的形成可能是由于青南地區(qū)獨(dú)特的地理環(huán)境和氣候條件，造成絳蟲形成地理隔離和生殖隔離，從而導(dǎo)致多房棘球絳蟲核苷酸變異形成。而在發(fā)育樹下半部分可以看到除豬帶絳蟲外從Genbank上下載的蟲株E.canzdensis(G10)- AB745463、E.ortleppi(G5)- AB235846、E.sp(G8)- AB235848、E.granulosus(G1)- AF297617和E.equinus-AF346403聚于一大枝，同時(shí)也根據(jù)親緣性遠(yuǎn)近形成姐妹枝，但都與我們的標(biāo)本蟲株間具有相對(duì)較遠(yuǎn)的親緣性。說明他們之間存在著一定的種屬差異、基因多態(tài)性。擬了解青南地區(qū)的多房棘球絳蟲蟲株標(biāo)本是否和北美洲或其他州流行的蟲株具有同源性或更為特殊的基因多態(tài)性，還需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行更進(jìn)一步的分析。

總之，由于棘球絳蟲有很多中間宿主和終宿主，且生活史復(fù)雜，較易受環(huán)境影響，種株分離也將越來越細(xì)。2005年肖寧等[14]為一個(gè)新種系統(tǒng)描述，命名為石渠棘球絳蟲(Echinococcusshiquicus)，已知青南高原存在藏狐石渠棘球絳蟲及高原鼠兔石渠棘球蚴感染，且可觀察到石渠棘球蚴具體形態(tài)[15]。而在本研究中可以看到下載所得的E.shiquicus(AB208064)蟲株在系統(tǒng)發(fā)育樹中獨(dú)成一枝，與我們的多房棘球絳蟲株、細(xì)粒棘球絳蟲株和標(biāo)本蟲株間遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)，親緣性相對(duì)不高，所以初步推斷其具有自己的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)特點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

[1]White DJ，Wolff JN，Pierson M，et al．Revealing the hidden complexities of mtDNA inheritance[J]．Mol Ecol．2008，17(23)：4925-4942．DOI：10.1111/j.1365-294X.2008.03982.x．

[2]Nakao M，SaKo Y，Yokoyama N，et al．Mitochondrial genetic code in cestodes[J]．Mol Biochem Parasitol，2000，111(2)：415-24．

[3]Thompson JD，Gibson TJ，Plewniak F，et al．The CLUSTAL-X windows interface：flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]．Nucleic Acids Research，1997，25(24)：4876 -82．

[4]Ho JW，Adams CE，Lew JB，et al．SeqVis：visualization of compositional heterogeneity in large alignments of nucleotides[J]．Bioinformatics，2006，22(17)：2162-2163．

[5]Swofford DL．PAUP*：Phylogenetic Analysis Using Parsimony(and Other Methods)4.0 Beta[M]．version 4．Sunderland：Sinauer Associates，2002，1-142．

[6]Tamura K，Dudley J，Nei M，et al．MEGA4：Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA)software version 4.0[J]．Mol Bio Evol，2007，24(8)：1596-1599．

[7]Xia X，Xie Z．DAMBE：Software Package for Data Analysis in MolecularBiology and Evolution[J]．J Hered，2001，92(4)：371 -373．DOI：10.1093/jhered/92.4.371．

[8]Posada D，Crandall KA．MODELTEST：testing the model of DNA substitution[J]．Bioinformatics，1998，14(9)：817 -818．DOI：10.1093/bioinformatics/14.9.817．

[9]Ronquist F，Huelsenbeck JP．MrBayes 3：Bayesian phylogenetic inference under mixed models[J]．Bioinformatics，2003，19(12)：1572-1574．

[10]王虎，Peter M Schantz，劉鳳潔，等．青海省人與動(dòng)物多房棘球絳蟲的感染[J]．中國(guó)寄生蟲病防治雜志，2000，13(2)：121-122．DOI：10.3969/j.issn.1673-5234.2000.02.015．

[11]何多龍．青海省包蟲流行與防治[J]．中國(guó)人獸共患病雜志，2000，16(4)：101-102．DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2000.04.037．

[12]付永．青海省稱多縣野生狐貍棘球絳蟲COⅠ基因多態(tài)性分析[J]．青海大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2013，31(5)：65-68．

[13]朵紅，黃福強(qiáng)，馮凱，等．青海省藏犬和野生狐貍棘球絳蟲感染調(diào)查及蟲種分子鑒定[J]．寄生蟲與醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)報(bào)，2012，19(4)：220-227．

[14]Xiao Ning，Qiu Jiamin，Nakao Minoru，et al．Echinococcus shiquicus n．sp．，a taeniid cestode from Tibetan Fox and plateau pika in China[J]．Int J Parasitol，2005，35(6)：693-701．DOI：1 0.1016/j.ijpara.2005.01.003．

[15]曾誠(chéng)．青海省青南高原棘球絳蟲新種-石渠棘球絳蟲的形態(tài)學(xué)觀察[J]．現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2013，40(7)：1354-1356.

收稿日期2015-01-05

DOI：10.13452/j.cnki.jqmc.2015.04.004

中圖分類號(hào)R383.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

※：國(guó)家自然基金地區(qū)項(xiàng)目(No81360255)；春暉計(jì)劃項(xiàng)目(No2012-Z082)

李超群(1992~)，女，漢族，河南籍，青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院2014級(jí)科學(xué)班研究生.※※：通訊作者，教授，博士，Email：qhmccdp@163.com