青南高原人體棘球蚴mtDNA基因多態(tài)性分析*

趙海龍，曹得萍，黃　欣，白海燕，李　偉，廖　博

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)教研室；

3.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院；4.重慶醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院)

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青南高原人體棘球蚴mtDNA基因多態(tài)性分析*

趙海龍1，曹得萍1，黃欣2，白海燕1，李偉3，廖博4

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)教研室；

3.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院；4.重慶醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院)

摘要目的檢測(cè)分析青南高原人體棘球蚴mtDNA基因型。方法對(duì)從青海玉樹(shù)、果洛、海南、黃南藏族自治州收集的63個(gè)人體棘球蚴分離株，運(yùn)用線粒體DNA的cox Ⅰ、nad Ⅰ、atp6 基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)線粒體DNA特異目的片段進(jìn)行序列分析鑒定。結(jié)果1)63個(gè)人體細(xì)粒棘球蚴分離株均為普通羊株(G1)；2)結(jié)果所得的9個(gè)基因型中有3個(gè)為青南高原地區(qū)所特有的基因型。結(jié)論本研究結(jié)果顯示青南地區(qū)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)具有廣泛性和普遍性的流行病學(xué)特征；同時(shí)青南高原又存在細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)獨(dú)特的核苷酸變異。

關(guān)鍵詞青南地區(qū)高原人體棘球蚴基因多態(tài)性

ANALYSIS ON mtDNA POLYMORPHISM OF HUMAN

ECHINOCOCCOSIS IN SOUTHERN QINGHAI PLATEAU*

Zhao Hailong1，Cao Deping1，Huang Xin2，Bai Haiyan1，Li Wei3，Liao Bo4

(1.Department of pathogenic biology，Qinghai University Medical College，Xining 810001，China；

2.Department of experimental diagnostics，Qinghai University Medical College，Xining 810001，China；

3.Animal husbandry and Veterinary College of Qinghai University，Xining 810016，China；

4.The second clinical college of Chong Qing Medical University，401331，China)

Abstract ObjectiveDetection and analysis of the human Echinococcus mtDNA genotype in southern plateau of Qinghai Province.Methods The sample were collected fromYushu，Guoluo，Hainan and Huangnan Tibetan Autonomous Prefecture of Qinghai Province.63 cases of human hydatid isolated strains were amplified by PCR using primers specific for the mitochondrial DNA(mtDNA cox Ⅰ，nad Ⅰ，Atp6 )and the mitochondrial DNA specific fragment sequence was analysed and identificated.Results1)63 human Echinococcus granulosus isolates were common sheep strain(G1)；2)Among nine genotypes there were three specific genetypes in southern Qinghai Plateau.Conclusion The results of this study show that there have the general epidemiological characteristics of Echinococcus granulosus in south Qinghai area.At the same time，Echinococcus granulosus in southern Qinghai Plateau has its unique nucleotide variations.

KeywordsSouthern QinghaiPlateauHumanEchinococcosisGenetic polymorphism

在細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)蟲(chóng)株鑒定和系統(tǒng)發(fā)生研究中，線粒體DNA(mtDNA)基因被廣泛應(yīng)用，而且mtDNA也用于檢測(cè)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)屬的遺傳變異[1]。細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)線粒體基因組為13588 bp，包括cox Ⅰ-cox Ⅲ基因，nad Ⅰ-nad Ⅵ基因和atp6基因[2，3]。將采自不同地區(qū)棘球蚴的mtDNA測(cè)序，得到10個(gè)基因型不同的地理株(G1-G10)，各蟲(chóng)株的宿主類別和地理分布存在差異[4]。

青海南部高原區(qū)位于昆侖山脈和唐古拉山脈之間，占青海省總面積的52%，屬典型的高原大陸型氣候，大部分地區(qū)海拔在4000～5000 m以上。區(qū)域內(nèi)河流從多，冰川廣布，耕地極少，草原廣闊，植被多由高寒灌叢草甸、高寒草甸、高寒草原、高寒荒漠草原組成，當(dāng)?shù)鼐用?5%以上是藏族，主要從事牧業(yè)生產(chǎn)。以往調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，該地區(qū)人和動(dòng)物棘球絳蟲(chóng)感染嚴(yán)重，屬重度流行區(qū)[5][6]。

對(duì)于青海省細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)基因多態(tài)性的分析，1994年，McManus，D.P.et al[7]運(yùn)用PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)技術(shù)對(duì)收集的青南地區(qū)10個(gè)人體棘球蚴分離株和38個(gè)牦牛棘球蚴分離株檢測(cè)，沒(méi)觀察到任何核苷酸位點(diǎn)突變；2005年，Yang，Y.R.et al[8]運(yùn)用線粒體DNA的atp6基因?qū)κ占那嗄系貐^(qū)12個(gè)牛棘球蚴分離株和13個(gè)綿羊棘球蚴分離株檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)少量基因突變位點(diǎn)，但此項(xiàng)研究未涉及人體棘球蚴分離株的基因多態(tài)性檢測(cè)。為全面了解青海青南地區(qū)人細(xì)粒棘球蚴基因多態(tài)型，本研究收集了63個(gè)人體棘球蚴分離株，運(yùn)用線粒體DNA的cox Ⅰ、nad Ⅰ、atp6基因，對(duì)線粒體DNA特異目的片段進(jìn)行序列分析鑒定。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本的采集

從2008年至2013年，研究組從玉樹(shù)、果洛、海南、黃南藏族自治州醫(yī)院收集細(xì)粒棘球蚴病人手術(shù)后標(biāo)本，以同一個(gè)宿主的包囊為1個(gè)分離株樣品，無(wú)菌條件下用注射器抽取囊液，顯微鏡下觀察有無(wú)原頭蚴，若有，用95%的酒精固定，-20 ℃保存；若無(wú)，則取少量囊壁組織，用95%的酒精固定，-20 ℃保存?zhèn)溆?。共收集?biāo)本63份，女性37份，男性26份；玉樹(shù)21份，果洛18份，黃南11份，海南13份；藏族58份，漢族5份；牧民49份，干部7份，學(xué)生4份，農(nóng)民2份，僧侶1份； 年齡最大者72歲，最小者14歲。

1.1.2試劑與儀器

1.1.2.1試劑

DNA提取試劑盒(TIANamp Genomic Kit，TIANGEN，Mennheim)，脫氧核苷三磷酸(dNTPs)(Thermo Scientific)，Taq DNA聚合酶(Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO，USA)，引物(Invitrogen LifeTechnologies，Paislay，Scotland)。

1.1.2.2儀器

電泳儀(Power PAC 300 )，電泳槽(DYCP-31DN)，PCR擴(kuò)增儀(SelectCycler II)。

1.2方法

1.2.1DNA提取

按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行操作。

1.2.2引物選擇(表1)

(1)線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞單位Ⅰ(cox Ⅰ)基因；(2)線粒體NADH脫氫酶Ⅰ(nad Ⅰ)基因；(3)線粒體 (atp6)基因。

表1線粒體DNA引物序列及反應(yīng)條件

Table 1 Primer sequences and PCR conditions for the amplification of the three mitochondrial markers

1.2.3PCR的擴(kuò)增和測(cè)序

設(shè)置體積為25 μL的反應(yīng)體系：10×Taq PCR MasterMix 2 μL，100 μmol的dNTP 2 μL，20 pmol·μL-1的S1、S2引物各1 μL，Taq 聚合酶2.5 μL，基因組DNA 2 μL，蒸餾水補(bǔ)足體積。cox Ⅰ、nad Ⅰ基因擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，51 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。atp6基因擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。

1.2.4DNA序列的測(cè)定、排序與比較

對(duì)三種引物擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物純化回收，委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。用DNAstar軟件的Bioedit software程序?qū)λ肈NA序列排序，對(duì)同一基因序列做比較和分析，將獲得的cox Ⅰ、nad Ⅰ、atp6基因序列與GenBank中的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)普通羊株(G1)線粒體完整的DNA序列(AF297617)、多房棘球絳蟲(chóng)的線粒體完整的DNA序列(AB018440)中的相應(yīng)區(qū)域作同源性比較。

1.2.5系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

將同一個(gè)分離株的cox Ⅰ 和nad Ⅰ相加后，同細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)完整的mtDNA序列(AF297617)、多房棘球絳蟲(chóng)完整的mtDNA序列(AB018440)一起輸入MEGA.3.1，利用Neighbor-joining 法[9]獲取距離矩陣。依據(jù)各距離值間的內(nèi)在關(guān)系構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，鑒定分離株基因型。

2結(jié)果

所測(cè)的63個(gè)細(xì)粒棘球蚴分離株均為普通羊株(G1型)。同GenBank中的普通羊株(G1型)比對(duì)，其基因同源性達(dá)到90%以上。

2.1coxⅠ基因序列

將擴(kuò)增出的長(zhǎng)度為396 bp的cox Ⅰ基因序列同GenBank中的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)普通羊株(G1型)完整的mtDNA序列(AF297617)的cox Ⅰ基因序列對(duì)應(yīng)區(qū)域比對(duì)，發(fā)現(xiàn)有5個(gè)位點(diǎn)的核苷酸發(fā)生置換(表2)。將63個(gè)分離株的cox Ⅰ DNA序列在BioeDit中歸類為4個(gè)基因型；cox Ⅰ A：6個(gè)分離株在7220位點(diǎn)T被C置換，7355位點(diǎn)G被T置換；cox Ⅰ B：37個(gè)分離株在7220 位點(diǎn)T被C置換；cox Ⅰ C：12個(gè)分離株在7220 位點(diǎn)T被C置換，在7175位點(diǎn)C被T置換，在7366位點(diǎn)T被C置換；cox Ⅰ D：8個(gè)分離株分別在7175位點(diǎn)C被T置換和7220位點(diǎn)T被C置換，顯示了基因突變。

表2青南高原63個(gè)人體細(xì)粒棘球蚴分離株cox Ⅰ基因序列與普通羊株(G1)基因型線粒體DNA完整序列

(Genbank 收錄號(hào)為：AF297617)比較結(jié)果

Table 2 Comparison of the Cox Ⅰ sequences obtained from 63 human isolates of Echinococcus granulosus

2.2nad Ⅰ基因序列

將擴(kuò)增出的長(zhǎng)度為418 bp的nad v基因序列同GenBank中的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)普通羊株(G1型)完整的mtDNA序列(AF297617)的nad Ⅰ基因序列對(duì)應(yīng)區(qū)域比對(duì)，發(fā)現(xiàn)有2個(gè)位點(diǎn)的核苷酸發(fā)生置換(表3)。將63個(gè)分離株的nad Ⅰ DNA序列在BioeDit中歸類為以下4個(gè)基因型；nad Ⅰ A：30個(gè)分離株的核苷酸序列與GenBank中的G1基因型完整的mtDNA序列(AF297617)nad Ⅰ基因相應(yīng)區(qū)域完全一致；nad Ⅰ B：14個(gè)分離株在5068位點(diǎn)T被C置換；nad Ⅰ C：12個(gè)分離株在4883位點(diǎn)A被G置換；nad ⅠD：7個(gè)分離株在4883位點(diǎn)A被G置換和5068位點(diǎn)T被C置換。

2.3atp6基因序列

將擴(kuò)增出的長(zhǎng)度為513bp的atp6基因序列同GenBank中的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)普通羊株(G1型)完整的mtDNA序列(AF297617)的atp6基基因序列對(duì)應(yīng)區(qū)域比對(duì)，發(fā)現(xiàn)有3個(gè)位點(diǎn)的核苷酸發(fā)生置換(表4)。將63個(gè)分離株的atp6的DNA序列在BioeDit中歸類為以下3個(gè)基因型：atp6 A：37個(gè)分離株的核苷酸序列與GenBank中檢索到的G1基因型線粒體DNA完整序列(AF297617)atp6基因相應(yīng)區(qū)域完全一致；atp6 B：14個(gè)人分離株在3438位點(diǎn)G被A所置換；atp6 C：12個(gè)分離株在3420位點(diǎn)T被C置換和3457位點(diǎn)G被A置換。

表3青南高原63個(gè)人體細(xì)粒棘球蚴分離株nad Ⅰ基因序列與普通羊株(G1)基因型線粒體DNA完整序列

(Genbank收錄號(hào)為：AF297617)的比較

Table 3 Comparison of the Nad Isequences obtained from 63 human isolates of Echinococcus granulosus

表4青南高原63個(gè)人體細(xì)粒棘球蚴分離株atp6基因序列與普通羊株(G1)基因型線粒體DNA完整序列

(Genbank 收錄號(hào)為：AF297617)的比較結(jié)果

Table 4 Comparison of the Atp6 Isequences obtained from 63 human isolates of Echinococcus granulosus

把相同突變位點(diǎn)分離株的cox Ⅰ、nad Ⅰ和atp6基因序列相加，共計(jì)1327 bp。在普通羊株(G1)種內(nèi)得到了9個(gè)基因型G1Q1、G1Q2、G1Q3、G1Q4、G1Q5、G1Q6、G1Q7、G1Q8和G1Q9，(圖1)。利用Neighbor-joining 法得到9個(gè)基因型與G1線粒體DNA序列(AF297617)和多房棘球絳蟲(chóng)線粒體DNA序列(AB018440)之間的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

本研究對(duì)63個(gè)人體棘球蚴分離株測(cè)序比對(duì)，共得到9個(gè)基因型。經(jīng)過(guò)與GenBank上已發(fā)表的序列相比，其中G1Q3、G1Q4、G1Q5、G1Q6、G1MQ8和G1Q96個(gè)基因型已見(jiàn)報(bào)道[10，11]。其余的3個(gè)基因型G1Q1、G1Q2和G1Q7，在GenBank中沒(méi)有一條DNA序列與它們有100%的同源性，基因型為青南高原地區(qū)所特有。

圖1青南高原細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)G1型種內(nèi)9個(gè)基因型(G1Q1-G1Q9)的線粒體DNA基因序列與GenBank發(fā)表的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)普通羊株(G1型)線粒體DNA完整序列(AF297617)和多房棘球絳蟲(chóng)線粒體DNA完整序列(AB018440)的比較圖

Figure 1The dendrogram shows the genetic distances separating the 9 genotypes (G1Q1 to G1Q9) identified in this study using coxI， nadI and atp6. EgG1 is the complete mitochondrial genome of the E. granulosus sheep strain (AF297617) and outgroup Em is the complete mitochondrial genome of E. multilocularis (AB018440)

3討論

本研究結(jié)果顯示流行于青南地區(qū)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的基因型既具有其他流行地區(qū)的普遍性，又存在本地區(qū)獨(dú)特的變異基因型特征，細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)mtDNA在青南地區(qū)呈現(xiàn)出多態(tài)性分布的特點(diǎn)。通過(guò)基因水平對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的測(cè)序分型，為今后棘球蚴病診斷試劑、疫苗及抗蟲(chóng)藥物的研發(fā)奠定了分子生物學(xué)基礎(chǔ)，并對(duì)制定合理的預(yù)防措施具有一定意義。

細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)在青南高原地區(qū)廣泛流行，是一種常見(jiàn)的危害嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲(chóng)病。青南高原地處青藏高原腹地，位于昆侖山脈和唐古拉山脈之間，平均海拔在4000～5000 m之間，該地區(qū)有著獨(dú)特的地理地貌，由山系和河川形成了與其它地域明顯的地理隔離。青南高原地域廣袤，存在完成棘球絳蟲(chóng)生活史的多種動(dòng)物，而且數(shù)量繁多，形成兩種棘球絳蟲(chóng)生活史型，即在人類居住區(qū)以家養(yǎng)食肉動(dòng)物(犬、流浪犬)動(dòng)物和家養(yǎng)食草動(dòng)物(牦牛、藏羊)間形成畜牧型生活史；在人跡罕至的荒漠地區(qū)以野生食肉動(dòng)物(狼、狐)動(dòng)物和野生食草(多為偶蹄類)動(dòng)物間形成荒漠型生活史。兩種類型的生活史可各自獨(dú)立循環(huán)，偶有交叉。由此推測(cè)，青南高原特有的地理隔離，形成的生殖隔離為細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的基因變異提供了條件，而當(dāng)?shù)刎S富的動(dòng)物資源為棘球絳蟲(chóng)的基因變異提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

本次測(cè)序的人體棘球蚴分離株來(lái)源于畜牧型生活史中的一個(gè)環(huán)節(jié)，相對(duì)于種類和數(shù)量龐大的荒漠型生活史，或其中存在更多的未知變異，有待今后進(jìn)一步的工作證實(shí)。

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收稿日期2015-03-09

DOI：10.13452/j.cnki.jqmc.2015.04.003

中圖分類號(hào)R38

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

*：教育部春暉計(jì)劃項(xiàng)目(No．Z2010064)

趙海龍(1970~)，男，漢族，山西籍，碩士，副教授