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    蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)在診斷白血病四種分型中的應(yīng)用

    2016-01-20 02:02:14陳林興林美冊黃靖宇
    檢驗醫(yī)學(xué) 2015年2期
    關(guān)鍵詞:白血病分型

    黃 華, 陳林興, 林美冊, 黃靖宇

    (汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院,廣東 汕頭 515041)

    蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)在診斷白血病四種分型中的應(yīng)用

    黃華,陳林興,林美冊,黃靖宇

    (汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院,廣東 汕頭 515041)

    摘要:目的對白血病典型的4種分型血清樣本進(jìn)行檢測分析,建立白血病分型的蛋白質(zhì)指紋圖譜診斷模型。方法應(yīng)用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)檢測16例急性粒細(xì)胞白血病M2a、18例慢性粒細(xì)胞白血病、14例急性淋巴細(xì)胞白血病及16例急性粒細(xì)胞白血病M3,采用Biomarker Wizard 及Biomarker Patterns 5.0軟件進(jìn)行標(biāo)記物的比較判別,建立決策樹診斷模型。結(jié)果由m/z 3 376、8 055及9 421建立決策樹診斷模型,其中16例急性粒細(xì)胞白血病M2a檢出率為75.0%(12/16)、9例慢性粒細(xì)胞白血病檢出率為100.0%(18/18)、14例急性淋巴細(xì)胞白血病檢出率71.4%(10/14)、16例急性粒細(xì)胞白血病M3檢出率為87.5%(12/14)。結(jié)論由3個蛋白標(biāo)記峰構(gòu)成的蛋白質(zhì)指紋圖譜診斷模型為白血病4種分型的診斷提供了新的借鑒和參考。

    關(guān)鍵詞:白血??;分型;蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)

    中圖分類號:

    文章編號:1673-8640(2015)02-0173-04R446.11

    文獻(xiàn)標(biāo)志碼:碼:A

    DOI:10.3969/j.issn.1673-8640.2015.02.017

    Abstract:ObjectiveTo establish protein fingerprinting model for the diagnosis of leukemia through determining 4 typical types of leukemia. MethodsA total of 16 acute myeloblastic leukemia M2a samples, 18 chronic myelocytic leukemia samples, 14 acute lymphoblastic leukemia samples and 16 acute myeloblastic leukemia M3 samples were determined by protein fingerprinting technology. The comparison of biomarkers was performed by Biomarker Wizard and Biomarker Patterns 5.0 to establish a diagnosis tree model. ResultsThe diagnosis tree model combined with 3 biomarkers ( m/z: 3 376, 8 055 and 9 421) could detect 75% acute myeloblastic leukemia M2a (12/16),100.0% chronic myelocytic leukemia (18/18), 71.4% acute lymphoblastic leukemia (10/14) and 87.5% acute myeloblastic leukemia M3 (12/14). ConclusionsThe protein fingerprinting model established by 3 protein features maybe a novel method for diagnosing 4 types of leukemia.

    基金項目:廣東省科技計劃項目(2010B031600272)

    作者簡介:黃華,女,1975年生,本科,副主任技師,主要從事骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)工作。

    收稿日期:(2014-08-14)

    Application of protein fingerprinting technology in diagnosing 4 types of leukemiaHUANGHua,CHENLinxing,LINMeice,HUANGJingyu.(TheSecondHospitalAffiliatedtoShantouUniversitySchoolofMedicine,GuangdongShantou515041,China)

    Key words: Leukemia; Typing; Protein fingerprinting technology

    白血病是一類造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病,具有分化程度的差異性和細(xì)胞形態(tài)的多形性等特點,其診斷需進(jìn)行明確分型[1]。國內(nèi)、外在白血病分型診斷從細(xì)胞水平進(jìn)展到分子水平,但僅靠形態(tài)學(xué)、免疫組化、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等,并未達(dá)到理想的檢出率[2-3]。

    本研究利用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)對白血病典型4種分型血清樣本進(jìn)行檢測分析,建立白血病分型的蛋白質(zhì)指紋圖譜診斷模型,為白血病的分型診斷提供幫助。

    材料和方法

    一、材料

    收集白血病4種分型血清樣本,其中16例急性粒細(xì)胞白血病M2a、18例慢性粒細(xì)胞白血病、14例急性淋巴細(xì)胞白血病及16例急性粒細(xì)胞白血病M3、白血病患者入選標(biāo)準(zhǔn):樣本均來自汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院初診患者,男30例,女34例,年齡4~83歲。所有患者均未接受任何治療方案,診斷經(jīng)臨床、骨髓形態(tài)學(xué)、免疫組化染色、流式細(xì)胞學(xué)、染色體檢查,按世界衛(wèi)生組織(WHO)白血病診斷標(biāo)準(zhǔn)確診。

    蛋白質(zhì)指紋圖譜試劑盒及蛋白指紋圖譜儀I型為湖州賽爾迪生物醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品,All-in-one標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)芯片為美國Ciphergen公司。

    二、方法

    1. 樣本收集患者外周血采集后立即放入4 ℃冰箱靜置1~2 h內(nèi),4 ℃離心232×g離心5 min分離血清后,4 ℃離心1 000×g離心5 min,去除所有殘留細(xì)胞碎片。在冰上將血清轉(zhuǎn)移到新的離心管中,放入-80 ℃冰箱分裝保存,限凍融一次[4]。

    2. 樣本處理(1) 樣本蛋白裂解:離心管中依次加入20 μL U9裂解液(9 mol/L Urea,2% CHAPS,50 mmol/L Tris-HCl,1% DTT,pH9.0),和冰浴溶解的10 μL血清樣本,混勻,靜置30 min;(2) 磁珠活化:WCX納米磁珠與100 μL 清洗液(50mmol/L NaAC,pH 4.0)反應(yīng)5 min,重復(fù)2次;(3) 磁珠捕獲樣本目的蛋白:取360 μL清洗液稀釋已裂解的血清樣本,取100 μL稀釋液加至活化后的磁珠,室溫反應(yīng)30 min;(4) 目的蛋白洗脫及上樣:取100 μL 清洗液清洗反應(yīng)后的磁珠5min,重復(fù)2次后棄除液體,加入10 μL洗脫液(1%的TFA)混勻, 靜置10 min,取4 μL上清液與4 μL能量吸附分子(Sinapinic acid)飽和溶液充分混勻,吸取2 μL混合液點樣到鋼芯片上,待干后采用蛋白指紋圖譜儀Ⅰ型和賽爾迪蛋白芯片軟件讀取芯片信息。

    三、數(shù)據(jù)采集和標(biāo)準(zhǔn)化處理

    采用加有All-in-one標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)芯片(含有bovine insulin β chain 3 495.9 m/z,human insulin recombinant 5 807.6 m/z,hirudin 7 033.6 m/z 3種蛋白)校正蛋白指紋圖譜儀,使相對分子質(zhì)量的誤差范圍至0.1%內(nèi)。蛋白質(zhì)指紋圖譜儀參數(shù)設(shè)置為激光強(qiáng)度220,檢測靈敏度7,優(yōu)化范圍為m/z為2 000 m/z~35 000 m/z,最高50 000。用6 634 m/z對圖譜進(jìn)行相對分子質(zhì)量校準(zhǔn),激光粒子流強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)為1。

    四、統(tǒng)計學(xué)方法

    采用Biomarker Wizard 軟件及Biomarker Patterns 5.0軟件進(jìn)行標(biāo)記物的比較判別,建立白血病分型決策樹診斷模型。

    結(jié)果

    一、白血病4種分型蛋白質(zhì)指紋圖譜診斷模型的建立

    16例急性粒細(xì)胞白血病M2a、18例慢性粒細(xì)胞白血病、14例急性淋巴細(xì)胞白血病及16例急性粒細(xì)胞白血病M3,用Biomarker Wizard及Biomarker Patterns 5.0軟件進(jìn)行標(biāo)記物的比較判別,建立由m/z為3 376、8 055及9 421的決策樹模型(圖1)。模型診斷規(guī)則為當(dāng)M 3 376~28 7.319 2且 M 9 421~83≤9.441 81 且M 8 055~09 ≤11.286 4判讀為急性粒細(xì)胞白血病M2a組;當(dāng)M3 376~28 > 7.319 2判讀為慢性粒細(xì)胞白血病組;當(dāng)M 3 376~28≤7.319 2且M 9 421~83≤9.441 81 且M 8 055~09 > 11.286 4 判讀為急性淋巴細(xì)胞白血病組,當(dāng)M 3 376~28≤7.319 2 且M 9 421~83 > 9.441 81判讀為急性粒細(xì)胞白血病M3組。該模型判讀16例急性粒細(xì)胞白血病M2a,12例正確,4例錯誤;18例慢性粒細(xì)胞白血病均正確;14例急性淋巴細(xì)胞白血病,10例正確,4例錯誤;16例急性粒細(xì)胞白血病M3,14例正確,2例錯誤(表2)。圖2為決策樹模型3個差異性峰在白血病4種分型的比較。

    圖1 決策樹診斷模型

    分組例數(shù)準(zhǔn)確率0組(16例)1組(18例)2組(14例)3組(16例)0組1675.000120401組18100.000018002組1471.429201023組1687.50020014

    注:0組為急性粒細(xì)胞白血病M2a,1組為慢性粒細(xì)胞白血病,2組為急性淋巴細(xì)胞白血病,3組為急性粒細(xì)胞白血病M3。

    注:橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)峰質(zhì)荷比,縱坐標(biāo)為蛋白質(zhì)峰強(qiáng)度

    圖2m/z為3 376、8 055及9 421蛋白峰表達(dá)差異的比較

    討論

    目前,國內(nèi)、外在白血病分型診斷從細(xì)胞水平進(jìn)展到分子水平,但僅依靠形態(tài)學(xué)、免疫組化、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等,未達(dá)到理想檢出率。

    蛋白質(zhì)反映了一個細(xì)胞真實狀態(tài),且差異蛋白質(zhì)表達(dá)更有助于鑒定健康和疾病狀態(tài)。蛋白組學(xué)研究能表現(xiàn)一個既定細(xì)胞的所有或特定蛋白質(zhì)表達(dá)特征。分析蛋白質(zhì)的改變不僅可直接獲得功能相關(guān)的標(biāo)志物,且更適于標(biāo)準(zhǔn)化和臨床應(yīng)用[5]。近年,蛋白組學(xué)結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)鑒定腫瘤生物標(biāo)志物的嘗試結(jié)果讓人們看到了希望,給腫瘤標(biāo)志物的研究帶來新的思維模式。傳統(tǒng)的研究方式一次只能分析一個單個的生物標(biāo)志物,而蛋白組學(xué)結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)可一次獲得上百個蛋白質(zhì)譜峰,通過一定的分析處理,建立決策樹診斷模型,使得多個生物標(biāo)志物聯(lián)合檢測診斷疾病或疾病的分型成為可能[6-7]。

    蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)是繼基因芯片技術(shù)之后新一代生物芯片技術(shù),已成為當(dāng)前臨床蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)研究中較為理想技術(shù)平臺,其診斷具有快速、早期、簡便、準(zhǔn)確、靈敏等特點。在國內(nèi)、外已有利用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)診斷胃癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、乳腺癌等腫瘤的報道[8-12],也取得了重大的突破。ADAM等[13]發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)不僅能正確區(qū)分前列腺癌、前列腺肥大與正常前列腺,而且能從存放5年的前列腺癌患者臨床發(fā)病前血清中檢出與前列腺癌相關(guān)的標(biāo)志物。2013年浙江大學(xué)應(yīng)用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù),建立了肺結(jié)核癥候分型蛋白決策診斷模型。

    本研究通過對16例急性粒細(xì)胞白血病M2a、18例慢性粒細(xì)胞白血病、14例急性淋巴細(xì)胞白血病及16例急性粒細(xì)胞白血病M3檢測分析,用Biomarker Wizard及Biomarker Patterns 5.0軟件進(jìn)行標(biāo)記物比較判別,建立由m/z為3 376、8 055、9 421決策樹模型,對白血病4種分型的檢出率均在70%以上。(4種類型白血病,單從形態(tài)上就能區(qū)分大多數(shù)類型,結(jié)合細(xì)胞化學(xué)、免疫組織化學(xué)基本上均能做出正確的鑒別診斷,不知道蛋白質(zhì)指紋的價值究竟在哪兒?能否對未明確診斷的白血病也進(jìn)行相關(guān)的研究,以發(fā)現(xiàn)其價值?)。

    隨著生活水平的不斷提高,人們對身體的健康越來越重視,利用蛋白質(zhì)譜技術(shù)對體驗人群進(jìn)行指紋圖譜的分析也成為趨勢,本研究也通過健康對照樣本和白血病樣本進(jìn)行標(biāo)記物比較判別,發(fā)現(xiàn)白血病樣本有22個差異顯著的蛋白峰。由于研究樣本例數(shù)較少,對此模型診斷效能的穩(wěn)定性有待在今后的研究中進(jìn)一步擴(kuò)大樣本數(shù)對模型進(jìn)行驗證,并從分子生物學(xué)水平分析研究模型中標(biāo)記蛋白的性質(zhì),證實這些標(biāo)記蛋白與白血病的關(guān)聯(lián)性,一旦建立起穩(wěn)定的診斷模型,依據(jù)其標(biāo)記蛋白表達(dá)的高、低,可以在臨床發(fā)病前預(yù)測其是否會發(fā)展成為白血病,對可能患病的人群加強(qiáng)監(jiān)護(hù)和預(yù)防性治療,真正發(fā)揮SELDI-TOF-MS技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)中的作用,使白血病的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療變?yōu)榭赡堋?/p>

    本研究建立了白血病4種分型的蛋白質(zhì)指紋圖譜診斷模型,具有較高的診斷效能。由于研究樣本例數(shù)較少,且只針對急性粒細(xì)胞白血病M2a、慢性粒細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、急性粒細(xì)胞白血病M3這4種白血病分型。因此,在今后的研究中還需擴(kuò)大樣本數(shù),進(jìn)一步完善不同類型白血病之間的鑒別診斷,并從分子生物學(xué)水平分離分析研究模型中標(biāo)記蛋白的性質(zhì),證實這些標(biāo)記蛋白與白血病不同分型的關(guān)聯(lián)性,希望能建立不同臨床分型的白血病診斷模式以指導(dǎo)臨床診療,為白血病的臨床診斷研究提供新的思路和方法。

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    (本文編輯:儲怡星)

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