檢測癲癇大鼠腦組織中Glu、Gly、GABA含量的異硫氰酸苯酯柱前衍生HPLC技術(shù)的建立

李敏，潘群皖，王海華，王烈成( 皖南醫(yī)學(xué)院，安徽蕪湖400;安徽醫(yī)科大學(xué))

檢測癲癇大鼠腦組織中Glu、Gly、GABA含量的異硫氰酸苯酯柱前衍生HPLC技術(shù)的建立

李敏1，潘群皖1，王海華1，王烈成2
( 1皖南醫(yī)學(xué)院，安徽蕪湖241002;2安徽醫(yī)科大學(xué))

摘要:目的建立檢測癲癇大鼠腦組織谷氨酸( Glu)、γ-氨基丁酸( GABA)、甘氨酸( Gly)含量的異硫氰酸苯酯( PITC)柱前衍生高效液相色譜( HPLC)技術(shù)，并驗(yàn)證其檢測效果。方法將海人藻酸( KA)或等量生理鹽水注射入大鼠海馬CA3區(qū)建立癲癇模型或?qū)φ眨?周后分別取其海馬和皮層組織，采用PITC柱前衍生法處理樣品，采用醋酸鈉緩沖液和乙腈梯度洗脫，Venusil-AA氨基酸分析柱結(jié)合紫外檢測器檢測，計(jì)算Glu、GABA、Gly含量。結(jié)果在30 min內(nèi)3種氨基酸完全出峰。在0.20～12.50 mg/L范圍內(nèi)Glu線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 3，日內(nèi)精密度為1.46%，日間精密度為1.84%，加樣回收率為97.12%±2.98%;在0.01～6.25 mg/L范圍內(nèi)Gly線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.998 4，日內(nèi)精密度為1.17%，日間精密度為1.62%，加樣回收率為96.63%±1.28%;在0.10～6.25 mg/L范圍內(nèi)GABA線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 4，日內(nèi)精密度為1.00%，日間精密度為1.53%，加樣回收率為99.25%±2.98%。模型組海馬和皮層中Glu含量均高于對照組相應(yīng)組織( P均＜0.05)。結(jié)論成功建立了檢測癲癇大鼠腦組織Glu、Gly、GABA含量的PITC柱前衍生HPLC技術(shù)檢測效果較好。

關(guān)鍵詞:癲癇;高效液相色譜;異硫氰酸苯酯;柱前衍生;谷氨酸;甘氨酸;γ-氨基丁酸;大鼠

Establishment of HPLC technology of precolumn derivatization with PITC in determining contents of Glu，Gly and GABA in brain tissues of rats with epilepsy

LI Min1，PAN Qun-wan，WANG Hai-hua，WANG Lie-cheng
( 1 Wannan Medical College，Wuhu 241002，China)

Abstract:Objective To establish high-performance liquid chromatography ( HPLC) technology of precolumn derivatization with phenyl isothiocyanate ( PITC) to determine the contents of glutamic acid ( Glu)，glycine ( Gly) and γ-aminobutyric acid ( GABA) in the brain tissues of rats with epilepsy，and to verify the results.Methods Kainic acid ( KA) was injected into the hippocampus CA3 region of rats to make the epilepsy models.Two weeks later，we obtained the hippocampus and cortex tissues，respectively.The diluted samples were precolumn derivatizated with PITC.The mobile phase consisted of sodium acetate and acetonitrile gradient elution.We calculated the contents of Glu，Gly and GABA in hippocampus and cortex by venusil-AA column combined with UV detector.Results The amino acids were separated within 30 min.A good linearity was obtained from ( 0.20-12.50) mg/L of Glu，the correlation coefficient was 0.999 3，the intraday RSD was 1.46%，interday RSD was 1.84%，and the average recovery rate was 97.12%±2.98%.A good linearity was obtained from ( 0.01-6.25) mg/L of Gly，the correlation coefficient was 0.998 4，the intraday RSD was 1.17%，interday RSD was 1.62%，and the average recovery rate was 96.63%±1.28%.A good linearity was obtained from ( 0.10-6.25) mg/L of GABA，the correlation coefficient was 0.999 4，the intraday RSD was 1.00%，interday RSD was 1.53%，and the average recovery rate was 99.25%±2.98%.Conclusion The HPLC technology of precolumn derivatization with PITC in determining the contents of Glu，Gly and GABA in the brain tissues of rats with epilepsy is successfully established.

Key words:epilepsy; high-performance liquid chromatography; phenyl isothiocyanate; precolumn derivatization; glutamic acid; glycine;γ-aminobutyric acid; rats

癲癇是臨床常見的一種難治性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)興奮性氨基酸和抑制性氨基酸含量的變化，特別是兩者比例的失衡可能是導(dǎo)致癲癇反復(fù)發(fā)作的直接原因［1］。因此，快速精準(zhǔn)地測定腦內(nèi)氨基酸類遞質(zhì)含量，對癲癇的臨床診斷和防治具有重要意義。目前，通常采用柱前衍生結(jié)合高效液相色譜( HPLC)技術(shù)進(jìn)行氨基酸測定，鄰苯二甲醛( OPA)、丹磺酰氯( Dansyl-Cl)、氯甲酸芴甲酯( FMOC-Cl)、2，4-二硝基氟苯( DNFB)是常用的柱前衍生試劑［2～5］。OPA衍生反應(yīng)迅速，靈敏度高，但其衍生產(chǎn)物極不穩(wěn)定，且不與二級氨基酸反應(yīng); Dansyl-Cl雖衍生產(chǎn)物穩(wěn)定，但需要在加熱條件下衍生，時(shí)間較長，生成1、2代衍生混合物會(huì)干擾分析; FMOC-Cl幾乎可以和所有氨基酸迅速反應(yīng)，衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性高，但過量FMOC與其水解產(chǎn)物會(huì)干擾測定; DNFB屬劇毒易爆物質(zhì)，有強(qiáng)致癌性，且極易損壞色譜柱。因此，建立一種安全、高效、高靈敏度的腦內(nèi)氨基酸遞質(zhì)檢測方法尤為重要。異硫氰酸苯酯( PITC)衍生產(chǎn)物單一穩(wěn)定，紫外吸收強(qiáng)度大，檢測限可達(dá)10－9mol［6］。本研究擬建立檢測癲癇大鼠腦組織氨基酸含量的PITC柱前衍生HPLC技術(shù)，并驗(yàn)證其檢測效果。

1　材料與方法

1.1材料雄性Wistar大鼠16只，220～260 g，清潔級，南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SCXK(蘇) 2002-0031］。谷氨酸( Glu)、γ-氨基丁酸( GABA)、甘氨酸( Gly)、PITC均購自Sigma公司。Agilent 1100 HPLC儀(美國Agilent公司)，F(xiàn)SH-Ⅱ型電動(dòng)勻漿器(江蘇金壇國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)，TGL-18R高速冷凍離心機(jī)(珠海Hema醫(yī)學(xué)儀器有限公司)，F(xiàn)Lexi-DryTM冷凍干燥機(jī)(美國FTS系統(tǒng)公司)，MODEL 828 pH計(jì)(美國ORION公司)，SK5200HP超聲波清洗器(上海歡奧科貿(mào)有限公司)。

1.2色譜條件及試劑配制色譜條件:①色譜柱: Venusil-AA氨基酸分析柱( 4.6 mm×250 mm，5 μm) ;②流動(dòng)相A為50 mmol/L乙酸鈉( pH 5.5，含5%甲醇)，流動(dòng)相B為100%乙腈，進(jìn)樣量為50 μL，流速為1 mL/min，柱溫為40℃，最大壓力為250 bar，紫外檢測波長為254 nm;③梯度洗脫程序:流動(dòng)相A在0、20、30、40、40.01、50.00、50.01 min時(shí)分別為100%、90%、82%、70%、0%、0%、100%，流動(dòng)相B分別為0、10%、18%、30%、100%、100%、0。試劑配制:①三乙胺乙腈溶液:三乙胺1.4 mL，乙腈8.6 mL，混勻，避光保存于4℃冰箱;②PITC乙腈溶液: PITC 25 μL，乙腈2 mL，混勻，充氮密封于－20℃冰箱;③氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:精密稱取Glu、 Gly、GABA粉末各10 mg，用2 mL 100 mmol/L HCl充分溶解，稀釋成濃度為5×10－2mg/mL儲(chǔ)備液，于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3癲癇模型建立及腦組織樣品預(yù)處理大鼠經(jīng)水合氯醛( 350 mg/kg)腹腔麻醉后，固定于立體定位儀上，暴露顱骨，依據(jù)大鼠立體定位圖譜［7］確定右側(cè)海馬CA3中心區(qū)為注射靶點(diǎn)( AP:－4.0 mm，ML: 4.40 mm，DV:3.8 mm)。將2.5 μL海人藻酸( KA，0.4 μg/μL)注射入海馬CA3區(qū)，術(shù)后縫合頭皮，建立癲癇大鼠模型(模型組，n =8)［8，9］。另取8只大鼠采用同樣方法注射生理鹽水，作為對照組。2周后，將兩組迅速斷頭取腦，冰上快速分離海馬和皮層，稱質(zhì)量;加入預(yù)冷的生理鹽水，冰上電動(dòng)勻漿( 25 000 r/min 10 s) ;勻漿液經(jīng)4℃離心( 12 000 r/min、20 min)，取上清; 加3倍體積乙腈，混勻，4℃離心( 12 000 r/min、10 min)，取上清;經(jīng)冷凍干燥后，流動(dòng)相A液充分溶解，4℃離心( 12 000 r/min、10 min)，取上清，流動(dòng)相A液稀釋，保存于4℃冰箱。

1.4大鼠腦組織中Glu、Gly、GABA含量檢測采用PITC柱前衍生HPLC技術(shù)檢測腦組織中Glu、Gly、GABA含量。具體步驟:①衍生化反應(yīng):取混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液或稀釋腦組織樣品200 μL，置于1 mL離心管中，加入三乙胺乙腈溶液100 μL，PITC乙腈溶液100 μL，混勻，室溫放置1 h;加入正己烷400 μL，振搖后放置10 min，將上層正己烷去除;再加入400 μL正己烷，振搖后放置10 min，取下層溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，收集在進(jìn)樣管中，待測。②Glu、Gly、GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:精確量取混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液1 mL，采用倍比稀釋法配制以下濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液( mg/mL) : 2.50×10－2、1.25× 10－2、6.25×10－3、3.13×10－3、1.56×10－3、7.81× 10－4、3.90×10－4、1.95×10－4、9.77×10－5、4.88× 10－5、2.44×10－5、1.22×10－5、0.61×10－6。衍生化后，依據(jù)1.2色譜條件進(jìn)樣分析，以峰面積對標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度( X)進(jìn)行線性回歸。③衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性測定:已知濃度的混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液( 1.56×10－3mg/mL)衍生化后于第0、2、4、8、12、24、48、72小時(shí)進(jìn)樣分析，計(jì)算Glu、Gly及GABA衍生產(chǎn)物峰面積的日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。④精密度測定:已知濃度的混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液( 1.56× 10－3mg/mL)衍生化后同日內(nèi)平行進(jìn)樣5次，測定Glu、Gly及GABA峰面積，同時(shí)計(jì)算其日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差;混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分5 d、5次衍生化后進(jìn)樣，測定Glu、Gly及GABA峰面積，同時(shí)計(jì)算其日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。⑤加樣回收率測定:各取1份預(yù)

處理后的已測定濃度的癲癇大鼠海馬和皮層樣品，分成3份，分別加入等體積0.78、1.56、3.13 μg/mL混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，衍生化后進(jìn)樣分析，分別計(jì)算Glu、Gly及GABA加樣回收率。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示，比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 PITC柱前衍生HPLC色譜檢測結(jié)果空白試劑色譜圖中可見除雜質(zhì)峰外，無其他色譜峰;氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖中Glu的保留時(shí)間為16.58 min、Gly為19.52 min、GAGA為29.70 min;大鼠海馬組織樣品氨基酸分離色譜圖的雜質(zhì)峰和試劑峰與Glu、Gly、GABA峰完全分離。見圖1。

圖1　PITC柱前衍生HPLC色譜檢測結(jié)果

2.2線性范圍和最低檢測限在0.20～12.50 mg/L范圍內(nèi)，Glu標(biāo)準(zhǔn)溶液線性方程為Y = 1.5× 104X +2.7×103( r =0.999 3) ;在0.01～6.25 mg/L范圍內(nèi)，Gly標(biāo)準(zhǔn)溶液線性方程為Y =1.0×105X + 1.6×103( r = 0.998 4) ;在0.10～6.25 mg/L范圍內(nèi)，GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液線性方程為Y = 1.1×105X－6.1×103( r =0.999 4)。在上述條件下，Glu的最低檢測濃度為0.012 mg/L，Gly為0.006 mg/L，GABA 為0.006 mg/L。

2.3衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性測得同一混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中Glu、Gly、GABA衍生產(chǎn)物色譜峰峰面積的日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.64%、2.48%、1.52%，日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.38%、5.03%、3.71%。

2.4精密度和加樣回收率同一混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中Glu、Gly、GABA保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜1%，峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜2%。Glu加樣回收率為97.12%±2.98%，Gly為96.63%±1.28%，GABA為99.25%±2.98%。

2.5兩組大鼠海馬和皮層Glu、Gly、GABA含量模型組海馬和皮層中Glu含量均高于對照組相應(yīng)組織( P均＜0.05)，Gly、GABA組間比較差異不明顯( P均＞0.05)。見表1。

3　討論

柱前衍生HPLC技術(shù)是檢測腦內(nèi)氨基酸含量的常用方法。但是，氨基酸不具有紫外和熒光吸收基團(tuán)，并且腦內(nèi)含量很低;此外，腦組織中除了氨基酸類遞質(zhì)外還存在許多其他復(fù)雜的成分。因此，若要實(shí)現(xiàn)癲癇患者或動(dòng)物腦組織中氨基酸含量的快速精

表1　兩組大鼠海馬和皮層組織中Glu、Gly、GABA含量( mg/g，±s)

表1　兩組大鼠海馬和皮層組織中Glu、Gly、GABA含量( mg/g，±s)

注:與對照組同組織比較，*P＜0.05。

組別　n Glu　Gly　GABA模型組8海馬　1.19±0.35*　0.14±0.02　 0.07±0.01皮層　1.11±0.19*　0.13±0.01　 0.07±0.01對照組　8海馬　0.28±0.04　 0.09±0.02　 0.03±0.01皮層0.12±0.02　 0.07±0.01　 0.02±0.00

準(zhǔn)檢測，同時(shí)保證其有足夠的分離度，選擇合適的色譜條件、優(yōu)化的衍生反應(yīng)、合理的樣品預(yù)處理是關(guān)鍵。

3.1色譜條件的選擇本實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相A選用醋酸鈉緩沖液，考察不同濃度( 100、75、50、25 mmol/L)醋酸鈉緩沖液對氨基酸分離的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著緩沖液濃度的增大，氨基酸分離度有所增大，但過高濃度會(huì)破壞色譜柱鍵合相的穩(wěn)定性，降低柱效［10］。綜合考慮，選擇緩沖液濃度為50 mmol/L。PITC氨基酸衍生物分離通常采用pH 5.0～7.0醋酸鹽緩沖液。本實(shí)驗(yàn)考察了不同pH條件( 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)對氨基酸分離效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pH為7.0時(shí)分離度較差;隨pH減小，保留時(shí)間延長，但分離度有所改善。綜合考慮，選擇pH為5.5。但單純采用醋酸鈉緩沖液3種氨基酸未能得到良好的分離，因此，本實(shí)驗(yàn)在流動(dòng)相A中加入有機(jī)溶劑甲醇( 5%)，對比使用甲醇前后的色譜圖，發(fā)現(xiàn)加入甲醇后氨基酸分離度明顯提高。在此基礎(chǔ)上對色譜分離的洗脫梯度進(jìn)行分析，最終確定洗脫梯度。提高柱溫能縮短保留時(shí)間，但過高的柱溫會(huì)降低分離度，使GABA與其他色譜峰重合。因此，實(shí)

際操作時(shí)柱溫保持在40℃為最佳。在梯度洗脫過程中，100%乙腈沖洗10 min后，若色譜柱平衡時(shí)間較短，連續(xù)進(jìn)樣則會(huì)影響保留時(shí)間，故每次進(jìn)樣后設(shè)定色譜柱平衡30 min后再次進(jìn)樣。

3.2衍生反應(yīng)的優(yōu)化衍生反應(yīng)是決定氨基酸重現(xiàn)性和檢測效果的決定步驟。PITC作為衍生試劑在測定氨基酸含量時(shí)在室溫進(jìn)行，具有穩(wěn)定、不易發(fā)生水解反應(yīng)、不形成多級衍生產(chǎn)物的優(yōu)點(diǎn)［11］，但有時(shí)過量試劑會(huì)使色譜柱填料過早老化，連續(xù)使用會(huì)導(dǎo)致柱效顯著下降［12］。本實(shí)驗(yàn)在衍生反應(yīng)中重復(fù)兩次用正己烷萃取去除過量衍生試劑，同時(shí)，在柱前增加1根具有C18填料的保護(hù)柱，以延長色譜柱的使用壽命，為準(zhǔn)確分析近500個(gè)樣品提供了可能性。

在衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性檢測過程中發(fā)現(xiàn)，PITC氨基酸衍生產(chǎn)物至少在24 h內(nèi)保持較高的穩(wěn)定性。其穩(wěn)定性主要受溫度及pH影響，室溫下衍生產(chǎn)物在pH 5.0～7.5比較穩(wěn)定，在pH 7.5時(shí)穩(wěn)定性最高;過高的pH會(huì)使色譜柱受到損害;而酸性狀態(tài)下衍生產(chǎn)物極易分解［13］。本實(shí)驗(yàn)事先采用鹽酸溶液處理標(biāo)準(zhǔn)品，然后在衍生體系中加入適量三乙胺乙腈溶液，利用三乙胺的堿性來保證衍生化反應(yīng)的順利進(jìn)行，同時(shí)維持衍生產(chǎn)物在一定時(shí)間內(nèi)保持較高的穩(wěn)定性，為精準(zhǔn)測定提供了可能。

3.3樣品預(yù)處理的改良為避免活性下降，處理癲癇大鼠腦組織時(shí)應(yīng)快速、準(zhǔn)確，取樣、勻漿、離心都要在0～4℃進(jìn)行，樣品－80℃冷凍保存。樣品預(yù)處理的好壞與分析結(jié)果的準(zhǔn)確性與重現(xiàn)性關(guān)系很大，測定氨基酸含量時(shí)，為了將更多的氨基酸游離出來，蛋白質(zhì)的去除很關(guān)鍵。去除蛋白的方法包括無機(jī)酸或有機(jī)溶劑沉降法，血漿、尿液標(biāo)本常采用磺基水楊酸沉淀蛋白，組織標(biāo)本則常用高氯酸、三氯乙酸和苦味酸;有機(jī)溶劑主要是70%～90%甲醇(或乙腈)［14］。本研究中腦組織樣品中蛋白的去除以100%乙腈效果最為理想。此外，為了防止溶液中微小顆粒阻塞色譜柱導(dǎo)致柱效下降，各種溶液在使用前都要進(jìn)行純化處理。采用超純水，現(xiàn)配現(xiàn)用，并用0.22 μm濾膜過濾;每次檢測完成后要及時(shí)徹底沖洗整個(gè)系統(tǒng)。本研究欠妥之處在于，回收率測定時(shí)未選用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行樣本萃取回收實(shí)驗(yàn)，而是利用外標(biāo)法直接進(jìn)樣定量測定，可能會(huì)存在一定誤差，在以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步改進(jìn)。

本實(shí)驗(yàn)選擇了合適的流動(dòng)相緩沖液及pH值，設(shè)定了合理的梯度洗脫程序，調(diào)整了衍生反應(yīng)體系pH，優(yōu)化了樣品預(yù)處理的過程，癲癇大鼠腦組織中Glu、Gly、GABA在上述分離條件下分離效果良好，其標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)分別為0.999 3、0.998 4及0.999 4，平均回收率均＞95%; Glu含量較對照組增加，Gly、GABA含量與對照組差異不顯著，與早期研究結(jié)果一致［9］。以上結(jié)果說明，本研究成功建立了檢測癲癇大鼠腦組織氨基酸含量的PITC柱前衍生HPLC技術(shù)。

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收稿日期:( 2015-03-29)

通信作者簡介:王烈成( 1969-)，男，教授，主要研究方向?yàn)樯窠?jīng)電生理。E-mail: wangliecheng@ ahmu.edu.cn

作者簡介:第一李敏( 1985-)，女，助教，主要研究方向?yàn)樯窠?jīng)電生理與藥理。E-mail: limin851022@163.com

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目( 81071075) ;安徽省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( 090413096) ;皖南醫(yī)學(xué)院中青年科研基金資助項(xiàng)目( WK201201)。

文章編號:1002-266X( 2015) 28-0008-04

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號:O657.72; R338.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.28.003