HD-8陽離子交換樹脂純化灰樹花多糖及其抗氧化活性的研究

韓　偉，滿　寧

(華東理工大學(xué) 藥學(xué)院 中藥現(xiàn)代化工程中心，上?！?00237)

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HD-8陽離子交換樹脂純化灰樹花多糖及其抗氧化活性的研究

韓偉，滿寧

(華東理工大學(xué) 藥學(xué)院 中藥現(xiàn)代化工程中心，上海200237)

摘要：以脫蛋白率、脫色率和多糖保留率為指標(biāo)，篩選出灰樹花多糖純化效果較佳的陽離子交換樹脂HD-8，并對其純化工藝進(jìn)行考察，獲得優(yōu)化的工藝條件為：流速2 BV/h(1 mL/min)、上樣量400 mL(蛋白質(zhì)含量為99.2 mg)、上樣的量做濃度0.248 mg/mL(多糖提取液中蛋白質(zhì)濃度)，多糖純度達(dá)62.66%.與其他工藝相比，采用HD-8樹脂能有效地提高灰樹花多糖的純度且節(jié)約成本、操作高效；同時對灰樹花多糖的體外抗氧化活性進(jìn)行了評價.

關(guān)鍵詞：灰樹花；多糖；樹脂；抗氧化

灰樹花(Grifolafrondosa)，又稱舞茸、蓮花菇、栗子蘑等，屬擔(dān)子菌亞門，層菌綱，多孔菌科[1]，從溫帶到亞熱帶森林均有分布，在我國和日本被廣泛栽培，是一種好氧喜光的大型木腐真菌.灰樹花形態(tài)如蓮花似珊瑚，肉質(zhì)脆嫩，雞絲香味[2]，具有極高的營養(yǎng)價值和多種藥理療效，是近年來熱點(diǎn)研究開發(fā)的珍奇真菌之一.灰樹花的主要生物活性成分有多糖、多酚、核酸、蛋白質(zhì)、脂類等[3]，還富含多種氨基酸、維生素、礦物質(zhì)和有機(jī)酸，膳食纖維高達(dá)33.7%[4].其中灰樹花多糖具有抗腫瘤，抗HIV病毒，增強(qiáng)免疫功能，調(diào)節(jié)血壓、血糖和血脂等生物功能[5]，在醫(yī)療和保健方面具有很高的開發(fā)利用價值及良好的應(yīng)用前景.

多糖的脫蛋白純化方法一般有Sevage法、醇沉法、三氯乙酸法等[6].這些純化方法存在有機(jī)試劑用量大、操作時間長、效果差等缺點(diǎn).本文以灰樹花子實(shí)體為研究體系，脫蛋白率、脫色率、多糖保留率為指標(biāo)，采用動態(tài)法篩選出純化效果較佳的HD-8陽離子交換樹脂，并對其操作工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化；最后選用羥自由基法[7-8]對純化后的灰樹花多糖進(jìn)行體外抗氧化活性評價.

1實(shí)驗部分

1.1實(shí)驗原料與試劑

灰樹花，真菌干品，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院；葡萄糖(標(biāo)準(zhǔn)品>95%)，硫酸，苯酚，醋酸，抗壞血酸(VC)，過硫酸鉀(KS2O4)，過氧化氫(H2O2，質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%)，水楊酸，分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；七水合硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O) 和無水乙醇，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清蛋白(標(biāo)準(zhǔn)品>98%)，BR，上海源聚生物科技有限公司；殼聚糖，分析純，上海偉康生物制品有限公司.

樹脂：大孔吸附樹脂HZ803、HZ806、HZ816、HZ820，大孔型離子交換樹脂D202、D301、D001、DK110、HD-8，凝膠型離子交換樹脂711(201×4)、335、732，選購于上海華震科技有限公司.

1.2實(shí)驗儀器

紫外-可見分光光度計(UV1900PC，上海亞研電子科技有限公司)，集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(DF-101S，鞏義市英峪予華儀器廠)，循環(huán)水真空泵(SHB-Ⅲ型，鞏義市英峪予華儀器廠)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52C，上海予華儀器有限公司)，微波爐(ER-692型，中國電子器件工業(yè)總公司)，電子天平(AL104，梅特勒托利多)，超聲波清洗器(SK3310HP，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)，臺式高速離心機(jī)(RJ-TGL-16C，無錫市瑞江分機(jī)儀器有限公司).

1.3分析方法

1.3.1多糖質(zhì)量的測定方法

最大吸收波長的確定：采用苯酚-硫酸法[9]進(jìn)行顯色反應(yīng)，在400～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長掃描.根據(jù)掃描結(jié)果，確定489 nm作為檢測波長.

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：分別量取0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL于25 mL具塞比色管中，補(bǔ)水至2 mL，按上述的苯酚-硫酸顯色法于489 nm波長處測定吸光度.以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：A=0.004 37+15.978 57C，R=0.999 67.利用該回歸方程計算灰樹花多糖樣品溶液中多糖的含量M=n×C×V，式中：C為樣品中多糖的質(zhì)量濃度(mg/mL)，V為溶劑量(mL)，n為溶液稀釋倍數(shù).

1.3.2蛋白質(zhì)質(zhì)量的測定方法

試劑的配制：精確稱取20 mg牛血清蛋白，去離子水溶解，定容至100 mL容量瓶，即得0.20 mg/mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液；精確稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶解于50 mL 95%乙醇，再加入100 mL 85%磷酸，去離子水定容至1000 mL，靜置一段時間，過濾，濾去不溶物即得.

蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[10]，分別精密量取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL具塞比色管中，補(bǔ)水至1.0 mL，分別加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，搖勻，靜置5 min，于595 nm[11]波長處測定吸光度.以蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為：A=4.800 76C+0.029 08，R=0.999 01.利用方程計算得到蛋白質(zhì)質(zhì)量N=C×V×100%(mg)，式中：C為溶液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，V為溶液體積(mL).

1.3.3多糖保留率、脫蛋白率、脫色率、多糖純度及自由基清除率的計算公式：

式中：M1為過柱前多糖質(zhì)量 (mg)，M2為過柱后多糖質(zhì)量 (mg).

式中：N1為過柱前蛋白質(zhì)質(zhì)量 (mg)，N2為過柱后蛋白質(zhì)質(zhì)量 (mg).

式中：A1為過柱前溶液的吸光度值，A2為過柱后溶液的吸光度值.

式中：C0為灰樹花多糖溶液中多糖的濃度(mg/mL)，V0為灰樹花多糖溶液體積(mL)，M為溶液濃縮后的干膏質(zhì)量 (mg).

式中：K為樣品溶液對自由基的清除率，A0為去離子水代替樣品溶液反應(yīng)的吸光度，A1為樣品溶液清除自由基反應(yīng)液的吸光度，A2為去離子水代替H2O2溶液反應(yīng)的吸光度.

1.4實(shí)驗方法

1.4.1灰樹花多糖的樹脂純化

1)將灰樹花粉碎，選用粒徑范圍10～20目，液固比20 mL/g，在pH為4.71左右的去離子水中微波提取240 s(輸出功率為650 W，微波頻率為2450 MHz).提取液冷卻至室溫后，進(jìn)行稱重補(bǔ)水，再抽濾，即制備得灰樹花多糖提取液.

2)樹脂的預(yù)處理

大孔吸附樹脂：首先用去離子水反復(fù)浸洗樹脂，直至浸洗液無泡沫；再將其用95%乙醇浸泡24 h，之后用去離子水沖洗至無乙醇?xì)馕叮缓笥萌ルx子水浸泡備用.

陽(陰)離子交換樹脂：將樹脂用去離子水反復(fù)浸洗，直至浸洗水澄清無褐色為止；再用1 mol/L 的NaOH溶液(1 mol/L鹽酸溶液) 浸泡，量為樹脂體積的4倍，24 h后用去離子水沖洗，直至浸泡水pH值為6～7；然后用1 mol/L鹽酸溶液(1 mol/L 的NaOH溶液)浸泡，量為樹脂體積的4倍，浸泡24 h后，用去離子水浸洗至pH值為7左右，即可投入使用.

3)裝柱：將預(yù)處理過的樹脂進(jìn)行濕法裝柱，在層析柱內(nèi)(1.5 cm×50 cm)注入一定量去離子水，趕走空氣；再準(zhǔn)確稱取20 g樹脂，加入去離子水混合至適宜稠度，灌注入層析柱內(nèi)，使其自由沉降；沉降結(jié)束形成樹脂床層后，靜置過夜，備用.

4)樹脂柱活化：實(shí)驗前，將100 mL左右的去離子水以適宜的流速流過樹脂柱，重復(fù)操作3遍，即可上樣使用.

5)上樣：取適量灰樹花多糖提取液，以一定的流速流過活化后的樹脂柱，收集流出液，即為純化后的灰樹花多糖提純液.流速考察范圍取1～5 BV/h；上樣量取200、250、300、350、400、450、500 mL；上樣濃度分別取上樣液體積的0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50倍.

6)按“1.3”項的分析方法計算脫蛋白率、脫色率、多糖保留率及純度.

1.4.2灰樹花多糖的絮凝純化和醇沉工藝

研究中還考察了絮凝和醇沉工藝純化灰樹花多糖的效果，方法如下：

1)絮凝純化法

精密量取一定量的灰樹花多糖提取液，按1.0 mL/g (絮凝劑體積/藥材質(zhì)量) 加入絮凝劑(1%殼聚糖乙醇試劑)，液藥比40 mL/g，藥液pH為6，溫度控制在45 ℃；磁力攪拌1 h，離心15 min(5000 r/min)，取上層澄清液，即為絮凝純化后的灰樹花多糖溶液.將純化后多糖溶液濃縮至膏狀，烘干稱重，測定多糖和蛋白質(zhì)含量，計算多糖保留率、脫蛋白率和純度.

2)醇沉工藝

精密量取多糖提取液和無水乙醇，混合使乙醇體積分?jǐn)?shù)保持在80%左右，靜置24 h，離心，沉淀用無水乙醇、丙酮分別洗滌3次，80 ℃干燥12 h，稱重.測定計算多糖保留率、脫蛋白率和純度.

1.4.3灰樹花多糖的抗氧化活性研究

1)反應(yīng)試劑的制備

①灰樹花多糖溶液：按照“1.4.1”項(1)中方法提取灰樹花多糖，再采用本文優(yōu)化的HD-8陽離子交換樹脂純化工藝制備灰樹花多糖(PGF1)，按“1.4.2”項中的殼聚糖絮凝純化法制備灰樹花多糖(PGF2).

②精密配備10 mg/mL的VC試劑(實(shí)驗中稀釋至不同濃度使用)，2 mmol/L FeSO4溶液，6 mmol/L H2O2溶液，6 mmol/L水楊酸溶液.

2)羥基自由基法

精密量取1 mL灰樹花多糖溶液，置于具塞比色管中，加入1 mL FeSO4溶液，再加入1mL H2O2溶液，搖勻，靜置15 min，然后加入1 mL水楊酸溶液，搖勻并開始記時，在510 nm波長處測定吸光度，從第2 min開始，每隔1 min記錄1次，直至吸光度讀數(shù)趨于穩(wěn)定.按公式計算清除率，選用VC作為陽性對照組，VC試劑對OH·的清除反應(yīng)操作同上.

根據(jù)樣品溶液對OH·清除率隨時間變化的結(jié)果，確定VC、PGF1和PGF2組分別靜置反應(yīng)的時間.進(jìn)而考察不同濃度的樣品溶液對羥基自由基的清除率.

2結(jié)果與分析

2.1樹脂篩選

按“1.4.1”項的實(shí)驗方法，對各類型樹脂的動態(tài)吸附純化效果進(jìn)行考察，以脫蛋白率、脫色率及多糖保留率為指標(biāo)，綜合考慮樹脂吸附雜質(zhì) (蛋白質(zhì)、色素) 的能力及多糖的損失情況，結(jié)果見表1.

表1可以看出：在相同的動態(tài)吸附除雜條件下，不同種類、極性、酸堿性、粒徑和含水量的樹脂對蛋白質(zhì)、色素、多糖的吸附能力不同，即對多糖中蛋白質(zhì)和色素的脫除及多糖保留效果有差別.大孔型陽離子交換樹脂HD-8、D001、凝膠型陽離子交換樹脂732的脫蛋白率和多糖保留率均在90%以上，脫色率也較高，多糖純度均達(dá)60%.其中陽離子交換樹脂HD-8純化效果最佳，多糖純度為61.78%.因此，本文選擇陽離子交換樹脂HD-8脫除灰樹花多糖中的雜質(zhì)，同時對其純化工藝做進(jìn)一步研究.

表1　動態(tài)篩選結(jié)果

2.2HD-8型陽離子交換樹脂的純化工藝

2.2.1流速的考察

通常情況下，當(dāng)流出液的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為上樣液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的10%時，認(rèn)為樹脂吸附蛋白質(zhì)飽和，即樹脂脫除多糖溶液中的雜質(zhì)蛋白達(dá)終點(diǎn).此時，將收集的流出液體積稱之為泄漏點(diǎn)[12-13].本實(shí)驗以脫蛋白效果為指標(biāo)，考察HD-8陽離子交換樹脂純化工藝的適宜流速.

從圖1可以看出，流速為1 BV/h時，流出液中蛋白質(zhì)濃度增加最為緩慢，泄漏點(diǎn)出現(xiàn)最遲，隨著流速增大，泄漏點(diǎn)開始提前，脫蛋白效果變差.這是因為流速加快，溶液中蛋白質(zhì)與樹脂接觸不充分，導(dǎo)致樹脂不能有效吸附雜質(zhì)蛋白，故流出液中蛋白質(zhì)濃度增加，樹脂脫蛋白效果變差.因此，應(yīng)該選擇較慢的流速，有利于樹脂充分吸附雜質(zhì)蛋白.由于1 BV/h流速在處理相同體積上樣液的時間是2 BV/h流速的兩倍，綜合考慮工藝的便捷、效率、成本及純化效果，選取動態(tài)純化過柱流速為2 BV/h.

2.2.2上樣量的考察

從圖2可以看出，在流速和上樣濃度相同的條件下，HD-8陽離子交換樹脂對多糖溶液的脫蛋白率隨著上樣量的增加先緩慢降低，上樣量超過400 mL時，脫蛋白率顯著下降；多糖保留率隨上樣量的增加不斷增大；這主要是因為隨著上樣量的增加，樹脂不斷吸附上樣液中的雜質(zhì)蛋白，從400 mL左右開始，對蛋白質(zhì)的吸附量逐漸趨于飽和，繼續(xù)增加上樣量，則脫蛋白率顯著下降，脫蛋白效果變差.同時，樹脂對多糖亦具有一定的吸附作用，不斷增加上樣量，吸附效果逐漸達(dá)飽和，對多糖的吸附率不斷下降，故流出液中多糖保留率不斷增大.綜合考慮脫蛋白率和多糖保留率對純化效果的影響，選擇上樣量為400 mL，經(jīng)測定，其中蛋白質(zhì)質(zhì)量為99.2 mg.

圖1　不同流速對樹脂HD-8脫蛋白效果的影響

圖2　不同上樣量對樹脂HD-8純化效果的影響

2.2.3上樣質(zhì)量濃度的考察

由圖3可知，當(dāng)流速與上樣量相同時，隨著上樣液體積倍數(shù)增大，即上樣質(zhì)量濃度減小，脫蛋白率增大，多糖保留率逐漸下降.這是因為上樣液質(zhì)量濃度較小時，單位體積內(nèi)的蛋白質(zhì)含量較低，與樹脂表面接觸更充分，有利于樹脂對蛋白質(zhì)的吸附，脫蛋白率較大；同理，上樣液質(zhì)量濃度較小時，樹脂對多糖的吸附也更充分，則多糖保留率較低.由于從1.00倍開始，脫蛋白率上升緩慢，而多糖保留率下降較明顯，故選取1.00倍，經(jīng)測定，該多糖溶液中蛋白質(zhì)的濃度為0.248 mg/mL，即最佳上樣濃度為0.248 mg/mL左右.

通過對以上三個因素的考察，獲得HD-8型陽離子交換樹脂動態(tài)脫蛋白純化灰樹花多糖的優(yōu)化工藝為：流速2 BV/h(1 mL/min)、上樣量400 mL(蛋白質(zhì)含量99.2 mg)、上樣質(zhì)量濃度為0.248 mg/mL(多糖提取液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度)，多糖純度達(dá)62.66%.

2.3不同純化工藝的比較

將HD-8型陽離子交換樹脂純化法、殼聚糖絮凝純化法、傳統(tǒng)醇沉法的純化結(jié)果進(jìn)行比較，見表2.

表2　不同純化工藝的比較

從表2可知，與傳統(tǒng)的醇沉法、殼聚糖純化法相比，HD-8陽離子交換樹脂純化效果最好，脫蛋白率和多糖保留率均大大提高，多糖純度達(dá)62.66%，比醇沉法和殼聚糖絮凝法分別提高了36.75%、8.88%；且操作時間較醇沉法大大縮減.由此表明，HD-8陽離子交換樹脂純化工藝是一種高效省時的純化方法.

2.4灰樹花多糖的體外抗氧化活性研究

本文選用羥自由基法評價灰樹花多糖的抗氧化活性，灰樹花多糖清除OH·的研究結(jié)果如圖4.

從圖4可以看出，PGF和VC清除羥基自由基的反應(yīng)在20 min左右，清除率均變化極為平緩，趨于平衡，故本研究中灰樹花多糖溶液與VC清除羥基自由基的反應(yīng)時間均選為30 min.

圖3　不同上樣質(zhì)量濃度對樹脂HD-8純化效果的影響

圖4　羥自由基清除率隨時間變化曲線

圖5　VC、PGF1和PGF2對羥自由基清除率的量效曲線

圖5為VC、PGF1和PGF2對羥自由基清除率的量效曲線圖.結(jié)果表明，陽離子交換樹脂HD-8純化與殼聚糖絮凝純化制備的灰樹花多糖對羥基自由基的清除活力存在一定的差異，同時清除率均較高，具有抗氧化作用效果.從圖中可以看到，陽性對照組VC的質(zhì)量濃度為2 mg/mL時，清除率KVC達(dá)最大，為99.81%；在0.5～2 mg/mL濃度范圍，PGF2對羥基自由基的清除率KPGF2大于PGF1對羥基自由基的清除率KPGF1，濃度為2～6 mg/mL時，KPGF1大于KPGF2；5 mg/mL時KPGF2為44.66%，KPGF1為48.28%，6 mg/mL時，KPGF1可達(dá)55.11%，兩者仍隨濃度的增加呈不斷增大的趨勢.

3結(jié)語

1)以灰樹花子實(shí)體多糖為研究對象，對12種不同類型樹脂進(jìn)行動態(tài)純化研究，篩選出效果最好的HD-8陽離子交換樹脂，多糖純度達(dá)61.78%.

2)對HD-8樹脂吸附進(jìn)行工藝優(yōu)化，得到優(yōu)化的條件為：上柱流速2 BV/h，上樣量400 mL，上樣液濃度0.248 mg/mL，純化后多糖純度達(dá)62.66%.HD-8陽離子交換樹脂動態(tài)純化工藝與醇沉法、殼聚糖絮凝法相比，純度高、操作時間短，除雜效果理想，避免了使用有機(jī)溶劑，樹脂可循環(huán)再利用，工藝經(jīng)濟(jì)環(huán)保，適合連續(xù)化工業(yè)生產(chǎn)，具有開發(fā)應(yīng)用價值.

3)以VC為陽性對照組，結(jié)果表明，在1～6 mg/mL濃度范圍，PGF1、PGF2對OH·的清除率存在一定的差異；同時，PGF1和PGF2對OH·最大清除率均高達(dá)50%左右，表明灰樹花多糖能有效清除羥基自由基，具有抗氧化方面的應(yīng)用潛力，可以作為一種抗氧化真菌進(jìn)行開發(fā)利用.

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(編輯崔思榮)

Study On the Purification and Antioxidant Activity in Vitro of Polysaccharides in

Fruiting Body ofGrifolaFrondosa(PGF) with Cation Exchange Resin HD-8

HAN Wei, MAN Ning

(Engineering Center for Traditional Chinese Medicine Modernization,

School of pharmacy, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)

Abstract:Using removal rate of protein,decolorization ratio,and retention rate of polysaccharides as indexes, cation exchange resin HD-8 was screened out with good purification effect.Optimal parameters of HD-8 purification process were studied as follows:flow rate was 2 BV/h(1mL/min);sampling amount was 400 mL(protein content was 99.2 mg);sample concentration was 0.248 mg/mL(protein concentration in extracting solution); and the purity of polysaccharides was 62.66%.Compared with other methods,PGF purified by cation exchange resin HD-8 can greatly improve the purity with cost-saving,high efficiency.And the antioxidant activity in vitro of polysaccharides was evaluated as well.

Key words:Grifola frondosa; polysaccharides; resin; antioxidant activity

中圖分類號：S985.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1674-358X(2015)04-0018-06

作者簡介：韓偉(1968-)，男，江蘇寶應(yīng)人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事天然產(chǎn)物的提取、分離及功能研究.

基金項目：國家自然科學(xué) (20006003)；上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)項目[瀘農(nóng)科攻字(2012)第2—9號]

收稿日期：2015-05-08