酶促DHA乙酯甘油解制備DHA甘三酯的工藝研究

李子睦， 畢艷蘭，程亞鵬

(河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，鄭州450001)

二十二碳六烯酸(DHA，C22∶6ω3)具有許多重要的生理作用，如抑制血液凝聚、降血脂、預(yù)防心腦血管疾病及阿爾茲海默病等[1-5]。目前市場(chǎng)上DHA以簡(jiǎn)單脂質(zhì)的銷售形式主要有脂肪酸型、乙酯型、甘油酯型3種。脂肪酸型的DHA產(chǎn)品吸收率高但極易氧化，而且適口性差，難以直接食用。乙酯型的DHA產(chǎn)品較穩(wěn)定，但在人體內(nèi)的消化分解產(chǎn)物有乙醇，可能會(huì)對(duì)肝臟尤其是嬰幼兒肝臟造成損傷。甘三酯型的DHA產(chǎn)品在保持其生理和營(yíng)養(yǎng)功能的同時(shí)，有良好的適口性以及較好的氣味，具有最佳的生物利用度[6]，同時(shí)具備良好的氧化穩(wěn)定性[7]，所以生產(chǎn)高純度的甘三酯型DHA產(chǎn)品越來(lái)越受到制藥公司和保健品公司的重視。

由于DHA在高溫下易氧化，所以目前生產(chǎn)DHA甘三酯多采用反應(yīng)條件溫和的酶法合成，主要有酯化法、酸解法、轉(zhuǎn)酯法及甘油解法。酶促酯化法原料一般為多不飽和脂肪酸。陳小娥等[8]以Novozym 435酶催化DHA與甘油在正己烷體系中酯化合成DHA甘三酯，在最優(yōu)條件下酯化率為94.5%，甘三酯得率為88.1%，但是該方法所需反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)且均需要進(jìn)行脫溶處理。酶促酸解法一般為多不飽和脂肪酸與油進(jìn)行酯交換反應(yīng)。Akimoto等[9]以Lipozyme IM催化從沙丁魚油中制得的富含DHA的脂肪酸與大豆油酯交換制備DHA甘三酯，最佳條件下分離后得到的甘三酯純度極高，但是DHA含量?jī)H為14.2%。酶促轉(zhuǎn)酯法一般為富含DHA的乙酯與甘油酯進(jìn)行酯交換。Zhang等[10]以Novozym 435酶催化魚油甘油酯與魚油乙酯酯交換制備DHA甘三酯，最優(yōu)條件下產(chǎn)物經(jīng)分子蒸餾后甘三酯含量可以達(dá)到95.9%，但是DHA含量?jī)H為17.4%。酶促單酯甘油解制備DHA甘三酯，目前多為DHA乙酯甘油解。楊春芳等[11]以2%(以總底物質(zhì)量計(jì))的Novozym 435 酶催化富含DHA的隱甲藻油乙酯甘油解制備DHA甘三酯，在DHA乙酯與甘油摩爾比4∶1、反應(yīng)溫度50℃、真空度100 Pa條件下反應(yīng)24 h后乙酯轉(zhuǎn)化率達(dá)到了80.9%，但其甘三酯含量不高于80.9%。Moreno-Pereza等[12]用16.7%(以乙酯質(zhì)量計(jì))的以Sepabeads-C18為載體的CALB酶催化DHA乙酯甘油解，在DHA乙酯與甘油摩爾比3∶0.2、50℃、攪拌速率200 r/min的真空條件下反應(yīng)6 h，產(chǎn)品中的甘三酯含量為82%。Sun等[13]以3%(以乙酯質(zhì)量計(jì))的Lipozyme 435酶催化DHA乙酯甘油解，在DHA乙酯與甘油摩爾比3∶1、反應(yīng)溫度60℃、真空條件下反應(yīng)24 h后甘三酯含量為75%，其中DHA含量為82.2%，但是反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)且原料乙酯需經(jīng)三級(jí)分子蒸餾。酶促甘油解法生產(chǎn)DHA甘三酯是一種高效的方法，所得產(chǎn)品中甘三酯含量高，可以省略或簡(jiǎn)化純化步驟，具有良好的發(fā)展前景，但是目前研究中所合成的產(chǎn)物中DHA含量與甘三酯含量沒(méi)有同時(shí)處于較高水平的，需進(jìn)一步進(jìn)行工藝優(yōu)化。

藻油是一種極佳的DHA來(lái)源，其中的DHA含量高達(dá)40%，遠(yuǎn)超過(guò)魚油中的DHA含量，所以用藻油為基礎(chǔ)原料經(jīng)過(guò)處理生產(chǎn)高純度DHA產(chǎn)品具有可行性。當(dāng)前商品DHA藻油的生產(chǎn)原料一般是藻油經(jīng)分提得到的液體組分。本研究為了提高藻油的附加值，以未分提的藻油乙酯化后經(jīng)過(guò)尿素包合法純化得到的高純度DHA乙酯為原料，與甘油在Novozym 435酶的催化作用下合成高純度DHA甘三酯?？疾旆磻?yīng)溫度、底物摩爾比、加酶量、反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)的影響，優(yōu)化制備高純度DHA甘三酯的條件，為推廣工業(yè)化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

DHA乙酯，參考王海東[14]、程亞鵬[15]等的方法，由藻油(DHA含量>40%)自制得到。苯、氯仿、正己烷、丙三醇、乙醚、甲酸、冰乙酸、2′,7′-二氯熒光素，均為分析純；薄層層析硅膠，化學(xué)純；乙酯及甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品為自制(純度均大于98%)；脂肪酸標(biāo)品均為GC級(jí)，購(gòu)于Sigma-Aldrich公司；Novozym 435固定化脂肪酶，購(gòu)于丹麥諾維信公司。

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；BSA224S分析天平(0.000 1 g)；MK-6S棒狀薄層色譜分析儀；TK-8干燥箱，日本雅隆特公司；Agilent 7890B氣相色譜分析儀，美國(guó)安捷倫公司；TDL-80-2B低速臺(tái)式離心機(jī)；CHROMAROD-SⅢ專用燒結(jié)薄層棒。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DHA甘三酯的制備

稱取2 g DHA乙酯，加入一定質(zhì)量的甘油和Novozym 435固定化脂肪酶于一定溫度的磁力攪拌(400 r/min)油浴中，真空狀態(tài)(10 Pa)下反應(yīng)一定的時(shí)間，反應(yīng)完畢后分析其組成。

1.2.2 產(chǎn)物組成分析

產(chǎn)物經(jīng)溶劑溶解，點(diǎn)樣后進(jìn)行兩次展開(kāi)。第一次展開(kāi)至刻度線為70 mm處，第二次展開(kāi)至100 mm處。第一次展開(kāi)展開(kāi)劑配比為正己烷、乙醚、甲酸體積比70∶30∶1，第二次展開(kāi)展開(kāi)劑配比為苯與正己烷體積比50∶50，兩次展開(kāi)結(jié)束后放入100℃干燥箱烘10 min，進(jìn)棒狀薄層色譜儀檢測(cè)樣品的組成。

TLC-FID的檢測(cè)條件參考Yang等[16]方法。

用峰面積歸一化法計(jì)算產(chǎn)品中甘一酯、甘二酯、甘三酯、乙酯的含量。

乙酯轉(zhuǎn)化率=(1-B/∑Ai)×100%

式中：B為乙酯峰面積；∑Ai為甘一酯、甘二酯、甘三酯、乙酯及脂肪酸峰面積之和。

1.2.3 脂肪酸組成分析

取70 mg樣品加1 mL正己烷溶解，進(jìn)行簡(jiǎn)易堿式甲酯化(具體操作參考文獻(xiàn)[17])，然后進(jìn)氣相色譜分析。

氣相分析條件參考林虬等[18]方法。

使用面積歸一化法計(jì)算各脂肪酸相對(duì)含量。

1.2.4 理化指標(biāo)的測(cè)定

酸價(jià)的測(cè)定參考GB 5009.229—2016，過(guò)氧化值的測(cè)定參考GB 5009.227—2016，水分及揮發(fā)物含量的測(cè)定參考GB 5009.236—2016。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

使用線性擬合軟件Origin 8.5分析數(shù)據(jù)之間的線性關(guān)系。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”形式表示，每組實(shí)驗(yàn)都至少有兩個(gè)平行樣，并且進(jìn)行方差分析。平行樣品間的差異用SPSS 16.0 Duncan 軟件進(jìn)行顯著性分析確定，P<0.05時(shí)則認(rèn)為是差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 原料的分析

2.1.1 DHA乙酯的理化指標(biāo)

DHA乙酯的酸價(jià)(KOH)為(0.42±0.02)mg/g，過(guò)氧化值為(3.04±0.04)mmol/kg，水分及揮發(fā)物含量為(0.23±0.01)%，原料各項(xiàng)理化指標(biāo)良好，可以用于后續(xù)研究。

2.1.2 DHA乙酯的純度

采用DHA乙酯、甘一酯、甘二酯、甘三酯標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)不同物質(zhì)進(jìn)行定位，由此得到DHA乙酯中乙酯的含量達(dá)到了(99.6±0.2)%，原料DHA乙酯可以用于后續(xù)研究。

2.1.3 DHA乙酯的脂肪酸組成(見(jiàn)表1)

表1 DHA乙酯的脂肪酸組成

由表1可知，DHA乙酯的脂肪酸組成中DHA占78.7%，多不飽和脂肪酸含量達(dá)到了94.8%，可以用于后續(xù)研究。

2.2 DHA乙酯甘油解制備DHA甘三酯的反應(yīng)條件優(yōu)化

2.2.1 底物摩爾比的選擇

乙酯與甘油的比例對(duì)于合成甘三酯工藝的影響很大，DHA乙酯甘油解制備DHA甘三酯的理論摩爾比為3∶1，所以選擇底物摩爾比分別為2∶1、3∶1、4∶1，考察底物摩爾比對(duì)反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1～圖4。

注：反應(yīng)溫度60℃，加酶量為DHA乙酯質(zhì)量的8%；不同的字母代表差異顯著(P<0.05)，下同。

圖1 底物摩爾比為2∶1時(shí)對(duì)反應(yīng)結(jié)果的影響

由圖1可知，在底物摩爾比為2∶1時(shí)，反應(yīng)進(jìn)行至24 h達(dá)到平衡。乙酯在0～8 h內(nèi)顯著減少，從(100±0.0)%降低至(0.8±1.1)%(P<0.05)，8～24 h內(nèi)無(wú)顯著性變化(P>0.05)，24 h時(shí)乙酯轉(zhuǎn)化率高達(dá)(99.8±0.2)%；甘一酯在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中的生成量均較少，平衡時(shí)所占比例為(2.8±1.0)%；甘二酯在0～8 h內(nèi)顯著上升至(38.7±1.1)%(P<0.05)，在8～12 h顯著下降至(34.5±1.0)%，12～20 h顯著上升至(37.8±0.1)%，20～24 h顯著降低至(33.3±0.9)%，此后甘二酯的生成量無(wú)顯著性變化；甘三酯的生成量在0～8 h內(nèi)快速增加至(56.6±0.4)%(P<0.05)，之后隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，甘三酯含量有小幅波動(dòng),24 h時(shí)甘三酯含量為(63.3±1.0)%，這是由于原料乙酯量不足，所以有較多的甘二酯未能轉(zhuǎn)化為甘三酯。

注：反應(yīng)溫度60℃，加酶量為DHA乙酯質(zhì)量的8%。

由圖2可知，在底物摩爾比為3∶1時(shí)，反應(yīng)進(jìn)行到28 h時(shí)達(dá)到平衡狀態(tài)。乙酯在0～28 h內(nèi)顯著減少(P<0.05)，之后延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間無(wú)顯著性變化，28 h時(shí)乙酯轉(zhuǎn)化率高達(dá)(98.7±0.1)%；甘一酯在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中的生成量均較少，平衡時(shí)甘一酯所占比例為(0.7±0.1)%；甘二酯在0～4 h內(nèi)顯著上升至(15.5±0.7)%(P<0.05)，在4～28 h內(nèi)甘二酯的生成量由(15.5±0.7)%降低至(5.4±1.8)%；甘三酯在0～28 h內(nèi)顯著增加(P<0.05)，28 h時(shí)甘三酯含量為(92.8±1.8)%。

注：反應(yīng)溫度60℃，加酶量為DHA乙酯質(zhì)量的8%。

由圖3可知，在底物摩爾比為4∶1時(shí)，反應(yīng)進(jìn)行至28 h達(dá)到平衡。乙酯含量在0～28 h內(nèi)顯著減少(P<0.05)，之后延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間無(wú)顯著性變化，28 h時(shí)乙酯轉(zhuǎn)化率為(73.1±1.4)%，由于此時(shí)原料乙酯過(guò)量所以有較多乙酯未轉(zhuǎn)化；甘一酯在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中的生成量均較少，平衡時(shí)甘一酯所占比例為(0.2±0.1)%；甘二酯在0～20 h顯著上升至(11.7±1.2)%(P<0.05),在20～28 h內(nèi)顯著下降，28 h時(shí)甘二酯所占比例為(4.1±3.6)%；甘三酯生成量在0～28 h內(nèi)顯著增加(P<0.05)，之后延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間無(wú)顯著性變化，28 h時(shí)甘三酯含量為(68.7±2.2)%。

注：反應(yīng)溫度60℃，加酶量為DHA乙酯質(zhì)量的8%，底物摩爾比為2∶1、3∶1、4∶1時(shí)反應(yīng)達(dá)到平衡的時(shí)間分別為24、28、28 h。

圖4 反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)底物摩爾比對(duì)乙酯轉(zhuǎn)化率和
甘三酯含量的影響

由圖4可知，反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，底物摩爾比為4∶1時(shí)的乙酯轉(zhuǎn)化率遠(yuǎn)低于底物摩爾比為2∶1和 3∶1 時(shí)的，底物比摩爾比為2∶1和3∶1時(shí)乙酯轉(zhuǎn)化率無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但是其甘三酯含量有顯著性差異(P<0.05)，平衡時(shí)，底物摩爾比為3∶1時(shí)甘三酯的含量為(92.8±1.8)%，遠(yuǎn)大于另外兩者。在底物摩爾比從2∶1增至4∶1時(shí)促進(jìn)了甘二酯轉(zhuǎn)化為甘三酯，但是乙酯過(guò)量時(shí)乙酯轉(zhuǎn)化率顯著降低，這一趨勢(shì)與劉太宇等[19]合成甘三酯的趨勢(shì)一致，所以選擇3∶1作為最佳底物摩爾比。

2.2.2 加酶量的選擇

考慮到生產(chǎn)成本及酶的價(jià)格較高，選擇4%、6%、8%的加酶量(以DHA乙酯質(zhì)量計(jì))，考察加酶量對(duì)反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5、圖6。

注：反應(yīng)溫度60℃，底物摩爾比3∶1。

由圖5可知，加酶量為4%～8%時(shí)，反應(yīng)達(dá)到平衡的時(shí)間不同，加酶量為6%和8%時(shí)，反應(yīng)在28 h即可達(dá)到平衡，而在加酶量為4%時(shí)，則至少需36 h才達(dá)到平衡。另外，無(wú)論加酶量多少，在0～8 h內(nèi)甘三酯的含量均顯著性上升，且加酶量越多，生成的甘三酯就越多。加酶量多少對(duì)于反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)的甘三酯含量影響不大。

注：反應(yīng)溫度60℃，底物摩爾比3∶1。

圖6 反應(yīng)28 h時(shí)加酶量對(duì)乙酯轉(zhuǎn)化率和
甘三酯含量的影響

由圖6可知，反應(yīng)28 h時(shí)，加酶量不同時(shí)的乙酯轉(zhuǎn)化率沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)，均在97%左右，甘三酯含量則是在加酶量為4%的時(shí)候最少，僅有(82.9±1.6)%，在加酶量為6%和8%時(shí)無(wú)顯著性差異(P<0.05)，為92%左右。這是因?yàn)楫?dāng)加酶量較少時(shí)，雖然乙酯基本轉(zhuǎn)化完全，但是仍有部分的甘二酯和甘一酯沒(méi)有轉(zhuǎn)化成甘三酯，仍需時(shí)間進(jìn)一步反應(yīng)。

由圖5可知加酶量為4%時(shí)達(dá)到平衡的反應(yīng)時(shí)間比其他二者長(zhǎng)，這一現(xiàn)象與Linder等[20]的研究類似，又因?yàn)榧用噶?%和8%時(shí)的合成效果均十分良好，綜合考慮反應(yīng)速率以及酶價(jià)格，選擇加酶量6%為最優(yōu)加酶量。

2.2.3 反應(yīng)溫度的選擇

溫度對(duì)于酶活性的影響較大，選擇40、60、80、100、120、140℃研究反應(yīng)溫度對(duì)反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7、圖8。

注：底物摩爾比3∶1，加酶量為DHA乙酯質(zhì)量的6%。

圖7 反應(yīng)溫度對(duì)甘三酯含量的影響

由圖7可知，反應(yīng)溫度不同乙酯甘油解制備甘三酯達(dá)到平衡的時(shí)間不同，反應(yīng)溫度分別為40、60、80、100、120、140℃時(shí)甘三酯含量達(dá)到平衡的時(shí)間分別為36、28、20、12、8、12 h。這說(shuō)明在一定溫度范圍內(nèi)適當(dāng)提高溫度可以縮短平衡需要的時(shí)間。適當(dāng)提高溫度不僅可以促進(jìn)反應(yīng)正向進(jìn)行，還可以從體系中去除反應(yīng)的副產(chǎn)物之一即乙醇，避免乙醇降低酶的活性。

注：加酶量為DHA乙酯質(zhì)量的6%，底物摩爾比3∶1。

圖8 反應(yīng)12 h時(shí)反應(yīng)溫度對(duì)乙酯轉(zhuǎn)化率和
甘三酯含量的影響

由圖7和圖8可知：在40～140℃范圍內(nèi)，0～12 h體系內(nèi)甘三酯含量均顯著上升(P<0.05)；在12 h時(shí)，40、60、80℃下的甘三酯含量與100、120、140℃下的甘三酯含量有顯著性差異(P<0.05)，前三者分別為(47.9±4.0)%、(66.7±1.7)%、(90.8±0.2)%，后三者之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，均為96%左右。80℃下的乙酯轉(zhuǎn)化率與100、120、140℃之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但是其仍有部分甘二酯和甘一酯未轉(zhuǎn)化為甘三酯，這可能是由于溫度較低造成部分甘二酯很難轉(zhuǎn)化為甘三酯。Kralovec等[21]研究表明，升高溫度可以得到較多的甘三酯。綜合考慮，選擇100℃為最佳反應(yīng)溫度。

由圖7可以看出，當(dāng)?shù)孜锬柋?∶1、加酶量6%(以DHA乙酯質(zhì)量計(jì))、反應(yīng)溫度在100℃以上時(shí)，反應(yīng)12 h已經(jīng)達(dá)到平衡，乙酯轉(zhuǎn)化完全，甘三酯含量已無(wú)顯著性變化，所以選擇12 h作為最佳反應(yīng)時(shí)間。

單因素優(yōu)化得到DHA乙酯甘油解制備DHA甘三酯最佳條件為DHA乙酯與甘油摩爾比3∶1、加酶量為DHA乙酯質(zhì)量的6%、反應(yīng)溫度100℃、反應(yīng)時(shí)間12 h，在此條件下乙酯轉(zhuǎn)化率為(97.0±0.2)%。

2.3 產(chǎn)物的組成、脂肪酸組成及理化指標(biāo)

測(cè)定優(yōu)化條件下得到的終產(chǎn)物組成、理化指標(biāo)和脂肪酸組成如表2所示。

由表2可知， 產(chǎn)物的各項(xiàng)理化指標(biāo)良好，符合GB 2716—2018規(guī)定，且產(chǎn)物中甘三酯純度為(95.6±0.1)%，DHA含量為(76.2±0.0)%，達(dá)到了預(yù)期的實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)。產(chǎn)物中DHA含量與原料中不一致，可能的原因是產(chǎn)物中除了甘三酯外還有生成的少量的甘一酯、甘二酯以及極少量未反應(yīng)的乙酯，所以導(dǎo)致有所差異。

表2 產(chǎn)物的組成、理化指標(biāo)和脂肪酸組成

3 結(jié) 論

本研究采用高純度DHA乙酯為原料，以Novozym 435酶催化甘油解制備DHA甘三酯，得到的最佳反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度100℃、加酶量為DHA乙酯質(zhì)量的6%、DHA乙酯與甘油摩爾比3∶1、反應(yīng)時(shí)間12 h，在此條件下甘三酯的含量為(95.6±0.1)%，乙酯轉(zhuǎn)化率為(97.0±0.2)%。通過(guò)分析產(chǎn)物的脂肪酸組成發(fā)現(xiàn)其中DHA含量為(76.2±0.0)%。由于所用酶的價(jià)格較貴，所以后續(xù)需要對(duì)酶的重復(fù)利用進(jìn)行研究，產(chǎn)物甘三酯中DHA的分布情況也有待進(jìn)一步研究。