粗飼料體外發(fā)酵特性及對(duì)微生物細(xì)胞膜界面物理化學(xué)特性的影響

黨 坦方 俊蔣紅梅譚支良湯少勛?（．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，長(zhǎng)沙408；．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙408；．中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，中國(guó)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生態(tài)過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙405）

粗飼料體外發(fā)酵特性及對(duì)微生物細(xì)胞膜界面物理化學(xué)特性的影響

黨 坦1方 俊2蔣紅梅1譚支良3湯少勛3?
（1．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，長(zhǎng)沙410128；2．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128；3．中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，中國(guó)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生態(tài)過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙410125）

摘 要：本試驗(yàn)旨在研究不同來(lái)源粗飼料發(fā)酵特性及對(duì)微生物細(xì)胞膜界面物理化學(xué)特性的影響。以小麥秸、玉米秸、水稻稈、苜蓿和桂牧一號(hào)為試驗(yàn)材料，采用體外發(fā)酵技術(shù)，研究不同粗飼料發(fā)酵48 h時(shí)體外發(fā)酵特性及發(fā)酵液微生物界面物理化學(xué)特性。結(jié)果表明：1）5種粗飼料體外發(fā)酵產(chǎn)氣量及產(chǎn)氣動(dòng)力學(xué)參數(shù)［最大產(chǎn)氣量（Vf）、產(chǎn)氣曲線(xiàn)常數(shù)（b）、產(chǎn)氣分率（k）、達(dá)到最大產(chǎn)氣量1／2時(shí)所用時(shí)間（T0．5）、初始發(fā)酵產(chǎn)氣分率（FRD0）和達(dá)到最大產(chǎn)氣量1／2時(shí)的發(fā)酵產(chǎn)氣分率（FRDt0．5）］存在差異；Vf以桂牧一號(hào)最高，顯著高于水稻稈（P＜0．05），極顯著高于小麥秸（P＜0．01）；b、k及T0．5以小麥秸最高，T0．5按小麥秸＞水稻稈＞玉米秸和桂牧一號(hào)＞苜蓿的順序顯著降低（P＜0．05）；苜蓿的FRD0和FRDt0．5顯著或極顯著高于桂牧一號(hào)、水稻稈和玉米秸（P＜0．05或P＜0．01）。2）苜蓿干物質(zhì)消失率顯著或極顯著高于水稻稈、小麥秸（P＜0．05或P＜0．01），氨態(tài)氮含量顯著高于桂牧一號(hào)、水稻稈（P＜0．05）。不同粗飼料間發(fā)酵液微生物細(xì)胞膜通透性按玉米秸＞小麥秸＞水稻稈＞桂牧一號(hào)和苜蓿的順序顯著降低（P＜0．05）。由此可見(jiàn)，不同品種粗飼料間在發(fā)酵特性以及微生物部分界面物理化學(xué)特性間存在差異，利用不同粗飼料發(fā)酵不同步的特性進(jìn)行組合，可能有利于提高粗飼料的利用。

關(guān)鍵詞：粗飼料；體外發(fā)酵特性；瘤胃微生物；界面物理化學(xué)特性

農(nóng)作物秸稈及牧草等飼料在草食畜牧業(yè)生產(chǎn)中占有很重要的地位。農(nóng)作物秸稈因纖維含量高而致使消化利用率低，優(yōu)質(zhì)牧草消化利用率高，但其種植量不能滿(mǎn)足草食畜牧業(yè)的需求。而農(nóng)作物秸稈及牧草的化學(xué)成分與組成不同，導(dǎo)致微生物對(duì)其分解利用的過(guò)程也不相同，將兩者進(jìn)行組合有可能改變降解過(guò)程，從而有助于提高粗飼料的利用率。有研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)作物秸稈間或秸稈與牧草間進(jìn)行組成后可產(chǎn)生正組合效應(yīng)，其干物質(zhì)消失率（DMD）等要高于單一秸稈或牧草［1－3］。因此，深入認(rèn)識(shí)秸稈及牧草降解過(guò)程的機(jī)理是充分利用高纖維含量飼料的基礎(chǔ)。反芻動(dòng)物對(duì)粗飼料高效利用的前提是瘤胃微生物對(duì)纖維素的降解。微生物表面或界面的一些特性如表面電荷、細(xì)胞表面疏水性（CSH）及其細(xì)胞膜通透性（CMP）也可能對(duì)微生物的吸附過(guò)程及胞內(nèi)酶的釋放產(chǎn)生影響［4－6］。同時(shí)，任何影響瘤胃微生物活性的因素都可能影響微生物對(duì)纖維的降解與利用，如碳水化合物在微生物的作用下分解生成的短鏈脂肪酸會(huì)改變瘤胃微生物的界面特性，瘤胃微生物界面特性的改變進(jìn)而會(huì)影響微生物的活性。因此，本文通過(guò)開(kāi)展不同粗飼料的體外發(fā)酵特性和瘤胃微生物界面物理化學(xué)特性的研究工作，比較不同粗飼料的降解過(guò)程差異及微生物界面特性差異，以期為深入理解纖維降解機(jī)理提供理論根據(jù)，為提高粗飼料利用效率提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1．1 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

選取3頭年齡（2年）和體重相近［（20．00± 2．20）kg］、體況良好的成年去勢(shì)瀏陽(yáng)黑山羊作為瘤胃液供體動(dòng)物。試驗(yàn)動(dòng)物飼糧非纖維性碳水化合物／中性洗滌纖維比（NFC／NDF）為40∶60，精料組成為玉米47．00%，豆粕24．00%，麩皮22．00%，食鹽0．77%，石粉2．23%，預(yù)混料4．00%。粗飼料為水稻稈，自由飲水。整個(gè)試驗(yàn)每頭瘺管羊每天飼喂精料200 g，粗飼料300 g。

1．2 發(fā)酵底物的制備

所選的飼料底物與鄒瑤等［7］試驗(yàn)中的材料一致，包括小麥秸、玉米秸、水稻稈、苜蓿和桂牧一號(hào)雜交象草（簡(jiǎn)稱(chēng)桂牧一號(hào)），并經(jīng)粉碎機(jī)粉碎并過(guò)1 mm篩，不同粗飼料的主要化學(xué)成分如表1所示。

表1　不同粗飼料的主要化學(xué)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 1 Main chemical components of different roughages（air?dry basis）　%

1．3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，比較不同粗飼料（小麥秸、玉米秸、水稻稈、苜蓿和桂牧一號(hào)）的體外發(fā)酵特性以及發(fā)酵液中微生物細(xì)胞膜的界面化學(xué)特性。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2個(gè)平行。

1．4 體外發(fā)酵程序

參照盧德勛等［8］的方法配制人工唾液，鄒瑤等［7］的方法進(jìn)行體外發(fā)酵并稍作改進(jìn)，發(fā)酵瓶中添加（400±5）mg底物粗飼料和40 mL瘤胃液濾液與人工唾液（1∶4）的混合液。發(fā)酵瓶放入39℃恒溫震蕩水浴鍋中，通過(guò)帶針頭的塑料管將發(fā)酵瓶與壓力傳感器相連。記錄0～48 h的產(chǎn)氣量，記錄時(shí)間間隔為1 h，數(shù)據(jù)自動(dòng)保存在壓力傳感器中。發(fā)酵完畢，取一定量的發(fā)酵液于離心管中保存，備用。同時(shí)過(guò)濾發(fā)酵殘?jiān)?，用于測(cè)定DMD。

1．5 化學(xué)分析

1．5．1 發(fā)酵液中氨態(tài)氮（NH3?N）含量與DMD的測(cè)定

發(fā)酵結(jié)束之后，取1 mL上清液于2 mL離心管中，經(jīng)3 500～4 000 r／min離心10 min，另取上清液0．1 mL于1．9 mL、0．2 mol／L的鹽酸溶液中，搖勻（稀釋20倍），用比色法［9］測(cè)定NH3?N含量。DMD計(jì)算方法如下：

式中：M2和M1分別表示發(fā)酵前和發(fā)酵后底物干物質(zhì)質(zhì)量。

1．5．2 瘤胃微生物界面物理化學(xué)指標(biāo)的測(cè)定

參照Pelletier等［10］的方法測(cè)定微生物表面電荷，取2 mL上清液，12 000 r／min離心10 min，得細(xì)胞沉淀。用1 mmol／L KNO3溶液洗滌2次（漩渦震蕩2 min，12 000 r／min再次離心），將細(xì)胞沉淀懸浮在5 mL、1 mmol／L KNO3溶液中，放于冰盒中靜置30 min。用Zeta Potential Analyzer （Brookhaven Instruments Company）測(cè)定細(xì)胞表面zeta電位（zeta potential，ZP）和電子遷移率（elec?trophoretic mobility，EM）。

參照Bellon?Fontaine等［11］和Hori等［12］陳述的微生物黏附溶劑法（MATS）來(lái)測(cè)定微生物細(xì)胞CSH，取一定量的上清液，4℃、12 000 r／min再次離心10 min，得細(xì)胞沉淀溶液。用0．1 mol／L磷酸鹽（PBS）緩沖溶液（pH 6．6）洗滌2次（同上），制成細(xì)胞懸浮液。取少量細(xì)胞懸浮液，用紫外分光光度計(jì)（日本島津，UV2450）測(cè)定其吸光度（OD）400 nm（A0）；再向每個(gè)樣品管中加入十六烷，室溫孵育10 min，再旋渦震蕩2 min，待混合物完全兩相分離，移出水相并測(cè)定其OD400 nm（A1），則CSH（%）＝［（A0－A1）／A0］×100。

CMP參照王福遠(yuǎn)等［13］的方法測(cè)定。在分液加入?yún)捬跗恐?，取混合液?0 000 r／min離心10 min，取上清液。加入100 mg／L熒光劑FITC?Dextran溶液配成熒光劑濃度分別為0、10、20、30、40、50 mg／L的溶液，其中0 mg／L為空白對(duì)照，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

發(fā)酵結(jié)束后，取上清液，加入的FITC?Detran溶液使其初始濃度為25 mg／L。37℃、避光、厭氧培養(yǎng)1 h后取發(fā)酵液，經(jīng)4℃、10 000 r／min、10 min，取上清液用于熒光分光光度計(jì)檢測(cè)（激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)520 nm）。另取瘤胃液經(jīng)4℃、10 000 r／min離心10 min，取上清液加雙蒸水使其濃度為25 mg／L，搖勻，測(cè)定其熒光分光光度值，以去除瘤胃原液的影響。

1．6 數(shù)據(jù)計(jì)算與統(tǒng)計(jì)分析

將壓強(qiáng)換算成為室溫標(biāo)準(zhǔn)氣壓下的氣體體積，換算公式為：

式中：0．037 4和0．926 1分別為實(shí)測(cè)發(fā)酵瓶?jī)?nèi)的壓強(qiáng)與體積之間的換算系數(shù)，x為壓強(qiáng)（kPa），y為氣體量（mL）。

將各時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的總產(chǎn)氣量運(yùn)用LE體外發(fā)酵產(chǎn)氣模型［14］進(jìn)行擬合，計(jì)算動(dòng)態(tài)發(fā)酵產(chǎn)氣參數(shù)。模型公式如下：

式中：y表示t時(shí)間點(diǎn)底物的產(chǎn)氣量（mL）；Vf表示最大產(chǎn)氣量（mL）；k表示產(chǎn)氣分率。b和d表示產(chǎn)氣曲線(xiàn)常數(shù)，b＞0表示曲線(xiàn)為S形，b＜0表示曲線(xiàn)為非S形。

采用以下計(jì)算公式計(jì)算產(chǎn)氣動(dòng)力學(xué)參數(shù)：

式中：FRD0表示初始（＜12 h）發(fā)酵產(chǎn)氣分率；T0．5表示達(dá)到最大產(chǎn)氣量1／2時(shí)所用時(shí)間，F(xiàn)RDt0．5表示達(dá)到最大產(chǎn)氣量1／2時(shí)的發(fā)酵產(chǎn)氣分率。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 8．2的MIXED過(guò)程統(tǒng)計(jì)，不同粗飼料間的差異采用Tukey選項(xiàng)進(jìn)行多重比較，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0．05表示差異顯著，P＜0．01表示差異極顯著。

2　結(jié)果與分析

2．1 不同粗飼料對(duì)體外發(fā)酵產(chǎn)氣參數(shù)和48 h總產(chǎn)氣量的影響

由圖1－A可知，隨著時(shí)間的增加，5種粗飼料產(chǎn)氣量逐漸增加。在發(fā)酵30 h時(shí)，產(chǎn)氣量以苜蓿最高，超過(guò)32 h之后，產(chǎn)氣量則以桂牧一號(hào)最高。從產(chǎn)氣量曲線(xiàn)來(lái)看，在發(fā)酵早期，苜蓿與桂牧一號(hào)產(chǎn)氣量迅速增加，而小麥秸在發(fā)酵早期產(chǎn)氣量上升很慢。由圖1－B可知，48 h總產(chǎn)氣量以桂牧一號(hào)最高，極顯著高于水稻稈和小麥秸（P＜0．01），但與玉米秸和苜蓿之間差異不顯著（P＞0．05）；玉米秸和苜蓿48 h總產(chǎn)氣量分別比水稻稈高16．0%和16．5%（P＜0．05），分別比小麥秸高63．8%和64．6% （P＜0．01），水稻稈產(chǎn)氣量顯著高于小麥秸（P＜0．05）。

由表2可知，Vf以桂牧一號(hào)最高，顯著高于水稻稈（P＜0．05），極顯著高于小麥秸（P＜0．01），但與玉米秸及苜蓿間差異不顯著（P＞0．05）。玉米秸與苜蓿Vf分別比小麥秸高58%和51%（P＜0．05）。對(duì)于b、k、T0．5，均是小麥秸最大，最小值分別是苜蓿、稻稈和桂牧一號(hào)。麥秸的b值極顯著高于其余4種粗飼料（P＜0．01），而桂牧一號(hào)及玉米秸間b值差異不顯著（P＞0．05），但均極顯著高于苜蓿（P＜0．01）。k值以水稻稈最低，極顯著低于桂牧一號(hào)、小麥秸和苜蓿（P＜0．01）。FRD0以苜蓿最高，顯著高于桂牧一號(hào)、水稻稈及玉米秸（P＜0．05），后三者又極顯著高于小麥秸（P＜0．01）。FRDt0．5則也是以苜蓿最高，顯著高于桂牧一號(hào)、小麥秸及玉米秸（P＜0．05），極顯著高于水稻稈（P＜0．01），桂牧一號(hào)與玉米秸的FRDt0．5顯著高于水稻稈（P＜0．05）。T0．5則按小麥秸＞水稻稈＞玉米秸和桂牧一號(hào)＞苜蓿的順序顯著降低（P＜0．05），但桂牧一號(hào)與玉米秸之間沒(méi)有顯著差異（P＞0．05）。

圖1　不同粗飼料體外發(fā)酵產(chǎn)氣曲線(xiàn)（A）及48 h總產(chǎn)氣量（B）Fig．1 Gas production curve（A）and 48 h gas production（B）of different forages of in vitro fermentation

表2　不同粗飼料體外發(fā)酵產(chǎn)氣參數(shù)及48 h總產(chǎn)氣量Table 2 In vitro gas production parameters and 48 h total gas production of different forages

2．2 不同粗飼料對(duì)DMD和發(fā)酵液中NH3?N含量的影響

由表3可知，DMD以苜蓿（63．7%）最高，苜蓿與桂牧一號(hào)（60．94%）和玉米秸（59．26%）間無(wú)顯著差異（P＞0．05），但顯著高于水稻稈（52．32%）（P＜0．05），極顯著高于小麥秸（46．86%）（P＜0．01）。桂牧一號(hào)與玉米秸DMD相對(duì)水稻稈分別高16．4%和13．4%，相對(duì)小麥秸則分別高30．0%和26．4%。不同粗飼料發(fā)酵液NH3?N含量存在顯著差異（P＜0．05）。苜蓿NH3?N含量（23．15 mg／dL）顯著高于桂牧一號(hào)（15．17 mg／dL）和水稻稈（13．08 mg／dL）（P＜0．05），但與玉米秸（19．25 mg／dL）及小麥秸（17．98 mg／dL）間無(wú)顯著差異（P＞0．05）。玉米秸和小麥秸NH3?N含量與桂牧一號(hào)及水稻稈之間差異不顯著（P＞0．05）。

2．3 不同粗飼料對(duì)瘤胃微生物的界面物理化學(xué)特性的影響

由表3可知，不同粗飼料發(fā)酵后微生物的EM、ZP差異不顯著（P＞0．05），EM和ZP具有相同的變化規(guī)律，其絕對(duì)值均是小麥秸最大，然后依次為苜蓿、水稻稈、玉米秸和桂牧一號(hào)。5種粗飼料發(fā)酵后發(fā)酵液微生物CSH在17．43%～21．70%之間，CSH以苜蓿最高，然后依次是小麥秸、玉米秸、水稻稈、桂牧一號(hào)，但5種粗飼料間沒(méi)有顯著差異（P＞0．05）。5種粗飼料體外發(fā)酵48 h后CMP以玉米秸最高（51．83%），比小麥秸高11．27%（P＜0．05），而小麥秸比水稻稈高5．7%（P＜0．05），水稻稈分別比桂牧一號(hào)和苜蓿高9．8%和10．9%（P＜0．05），桂牧一號(hào)和苜蓿間沒(méi)有顯著差異（P＞0．05）。

表3　不同底物對(duì)干物質(zhì)消失率、氨態(tài)氮含量及瘤胃微生物界面物理化學(xué)指標(biāo)的影響Table 3 Effects of different substrates on dry matter disappearance，ammonia nitrogen content and interface physical and chemical characteristics of ruminal microbe

3　討 論

3．1 粗飼料體外發(fā)酵與DMD

在體外發(fā)酵試驗(yàn)中，研究者往往根據(jù)其試驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的發(fā)酵時(shí)間。在粗飼料發(fā)酵特性評(píng)價(jià)中，很多研究者一般將發(fā)酵時(shí)間設(shè)定在72 h甚至72 h以上，但也有研究者將發(fā)酵時(shí)間設(shè)定在48 h以?xún)?nèi)。有研究認(rèn)為，粗飼料在反芻動(dòng)物瘤胃中的正常消化時(shí)間在30 h左右，將培養(yǎng)時(shí)間由48 h縮短至30 h或更能比較客觀(guān)地反映高產(chǎn)奶牛消化纖維的能力［16］。因此，在本研究中，將粗飼料的發(fā)酵時(shí)間選定為48 h。

瘤胃樣品中碳水化合物在微生物的作用下分解產(chǎn)生氣體，氣體產(chǎn)量的多少與碳水化合物降解量直接相關(guān)，因此，發(fā)酵產(chǎn)氣量一定程度上可以反映出發(fā)酵底物為瘤胃微生物所利用的程度［17］，通過(guò)測(cè)定5種不同粗飼料體外發(fā)酵產(chǎn)氣量，可以粗略地估計(jì)其干物質(zhì)的降解程度。從結(jié)果來(lái)看，除苜蓿外，其他粗飼料的產(chǎn)氣量越高，其DMD也越高。但由于飼料中粗蛋白質(zhì)在微生物作用下分解時(shí)，所產(chǎn)氣體很少，飼料中粗蛋白質(zhì)含量越高，其產(chǎn)氣量也會(huì)越低。如Cone等［18］對(duì)酪蛋白和淀粉的體外發(fā)酵研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵72 h后蛋白質(zhì)發(fā)酵的產(chǎn)氣量?jī)H為碳水化合物的30%。姜海林等［19］研究發(fā)現(xiàn)，不同牧草產(chǎn)氣量與其粗蛋白質(zhì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。這可能就是苜蓿的產(chǎn)氣量比桂牧一號(hào)低，但DMD要高于桂牧一號(hào)的主要原因。另外，中性洗滌可溶物（NDS）的含量在粗飼料體外發(fā)酵中對(duì)產(chǎn)氣量的貢獻(xiàn)也占很高的比例。高巍等［20］對(duì)玉米秸稈及苜蓿干草的體外發(fā)酵研究表明，青貯玉米秸稈及苜蓿干草NDS的產(chǎn)氣量占飼草累積產(chǎn)氣量的絕大部分；粗飼料DMD的高低不僅與粗飼料的纖維降解有關(guān)，而且與其中NDS含量也密切相關(guān)。如在本研究中，NDS含量高的粗飼料（苜蓿與桂牧一號(hào)），其DMD也比較高。這可能是因?yàn)榭扇苄苑墙Y(jié)構(gòu)性碳水化合物是為瘤胃內(nèi)微生物提供營(yíng)養(yǎng)的主要來(lái)源，NDS含量越高，干物質(zhì)（DM）被分解的越多，為微生物提供的營(yíng)養(yǎng)也越多，從而促進(jìn)了微生物的增殖，進(jìn)而更進(jìn)一步促進(jìn)了碳水化合物及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解，故DMD也越高。

b值大于0時(shí)表示產(chǎn)氣曲線(xiàn)為S形，小于0則為非S形，非S形曲線(xiàn)表示底物接種瘤胃細(xì)菌后很快就開(kāi)始產(chǎn)氣，而S形曲線(xiàn)則表示底物在接種瘤胃細(xì)菌后的初始發(fā)酵階段有一個(gè)延滯期。苜蓿b值為負(fù)，而小麥秸和玉米秸都為正，說(shuō)明苜蓿在接種細(xì)菌后可快速開(kāi)始降解，而低質(zhì)粗飼料（如小麥秸）的發(fā)酵啟動(dòng)時(shí)間相對(duì)來(lái)說(shuō)要更長(zhǎng)。這從FRD0以及T0．5也可得到相同的結(jié)果，F(xiàn)RD0越高或T0．5越低，說(shuō)明底物初始發(fā)酵產(chǎn)氣速度越快或達(dá)到最大產(chǎn)氣量1／2時(shí)所用時(shí)間最短。如苜蓿的FRD0最高而T0．5最低，而小麥秸的FRD0最低而T0．5最高。這說(shuō)明優(yōu)質(zhì)牧草與低質(zhì)粗飼料的發(fā)酵模式存在差異，優(yōu)質(zhì)牧草的消化主要在發(fā)酵前期，而低質(zhì)粗飼料主要在發(fā)酵后期（＞12 h）才進(jìn)入降解的主要階段。由結(jié)果可以推測(cè)，將低質(zhì)粗飼料與優(yōu)質(zhì)牧草進(jìn)行組合，有可能通過(guò)利用優(yōu)質(zhì)牧草與低質(zhì)牧草發(fā)酵特性的差異，彌補(bǔ)低質(zhì)粗飼料在發(fā)酵初始階段微生物增殖慢，從而對(duì)纖維降解緩慢的不足。Tang等［21］研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿與農(nóng)作物秸稈（玉米秸、小麥秸及水稻稈）按75∶25的比例組合時(shí)，產(chǎn)氣量的正組合效應(yīng)最為顯著。

瘤胃NH3?N含量在一定程度上反映了特定飼糧組成下蛋白質(zhì)降解與微生物對(duì)氨氮利用之間所達(dá)到的平衡狀況［22］，NH3?N是瘤胃微生物合成微生物蛋白的主要原料，瘤胃NH3?N適宜含量為6．3～27．5mg／dL［23－24］。從5種粗飼料的發(fā)酵結(jié)果來(lái)看，其N(xiāo)H3?N含量適宜于微生物的生長(zhǎng)。發(fā)酵液的NH3?N含量不僅與粗飼料的蛋白質(zhì)含量有關(guān)，可能也與粗飼料的可利用性有關(guān)。粗飼料DMD越高，意味著粗飼料分解后給微生物提供的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也越多，從而促進(jìn)微生物的增殖，進(jìn)而使NH3?N維持在一定的水平。當(dāng)粗飼料降解后的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能滿(mǎn)足微生物的進(jìn)一步增殖時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致微生物自身的分解，從而也會(huì)導(dǎo)致NH3?N含量的升高。這可能就是苜蓿為發(fā)酵底物時(shí)，發(fā)酵液中NH3?N含量是5種底物中最高的，以及小麥秸為底物時(shí)發(fā)酵液中NH3?N含量要高于水稻稈和桂牧一號(hào)的原因。

3．2 瘤胃微生物界面物理化學(xué)特性

微生物表面含有磷?；Ⅳ然桶被裙倌軋F(tuán)，正是由于這些基團(tuán)的電離才使生物表面帶靜的負(fù)電荷，且隨著環(huán)境pH的改變，基團(tuán)發(fā)生不同程度的電離［25］。細(xì)胞表面ZP在維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性上扮演極其重要的角色，能影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能以及胞內(nèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)［26］，在細(xì)菌對(duì)底物的吸附過(guò)程中起到一定的作用［27］。5種粗飼料發(fā)酵48 h后發(fā)酵液中微生物的EM和ZP間沒(méi)有顯著差異，表明粗飼料的差異在發(fā)酵時(shí)不影響的微生物表面電荷量，也意味著微生物對(duì)不同粗飼料的黏附特性可能沒(méi)有差異。

細(xì)菌由于其表面結(jié)構(gòu)組成特異性而具有疏水性的物理特性，細(xì)菌細(xì)胞CSH是影響細(xì)菌非特異性黏附到各種生物和非生物表面及界面的重要物理因素，也是影響細(xì)菌吸附和降解聚合物的主要因素之一［5，28－29］。本研究中不同粗飼料培養(yǎng)時(shí)處于相同的培養(yǎng)液條件，瘤胃微生物的數(shù)量和種類(lèi)及其所處的環(huán)境基本一致，這可能導(dǎo)致不同粗飼料間發(fā)酵液微生物CSH沒(méi)有差異。

瘤胃微生物降解纖維類(lèi)物質(zhì)的活動(dòng)過(guò)程涉及到很多生理過(guò)程，在實(shí)現(xiàn)這些重要的生理功能過(guò)程中，CMP占有很重要的地位［6］。CMP受很多因素的影響，如非離子表面活性劑本身所具有的疏水結(jié)構(gòu)可作用于細(xì)菌細(xì)胞膜，增加細(xì)胞膜的流動(dòng)性及滲透性，從而使胞內(nèi)酶更容易流向胞外［30］。在生物催化技術(shù)中，常常在不破壞細(xì)胞有機(jī)整體結(jié)構(gòu)的情況下，通過(guò)改善CMP，使得小分子物質(zhì)和一些較大分子物質(zhì)能夠自由進(jìn)出細(xì)胞，從而提高細(xì)胞催化效率［31］。如生產(chǎn)常用非離子表面活性劑Trition X?100改善細(xì)胞被膜通透性［32－33］。在粗飼料發(fā)酵過(guò)程中，纖維物質(zhì)被微生物分解所產(chǎn)生的短鏈脂肪酸也是一種表面活性物質(zhì)，而表面活性物質(zhì)有可能通過(guò)改變降解微生物細(xì)胞表面性質(zhì)，調(diào)節(jié)細(xì)胞在發(fā)酵底物表面的吸附狀況，促進(jìn)它們之間的相互作用［34］。

此外，瘤胃微生物增殖過(guò)程中自身也會(huì)產(chǎn)生一些生物表面活性物質(zhì)，這些生物表面活性物質(zhì)具有降低發(fā)酵液表面張力的作用。本研究中，不同粗飼料發(fā)酵后，微生物CMP存在顯著差異，其主要原因可能是不同粗飼料發(fā)酵后產(chǎn)生的短鏈脂肪酸量不同所致。農(nóng)作物秸稈的主要成分為中性洗滌纖維，其降解產(chǎn)物主要為短鏈脂肪酸，干物質(zhì)降解率越高，其短鏈脂肪酸產(chǎn)量也越高。從鄒瑤［35］的研究結(jié)果來(lái)看，玉米秸、小麥秸及水稻稈的短鏈脂肪酸產(chǎn)量分別為19．39、12．49和12．30 mmol／L。粗飼料短鏈脂肪酸產(chǎn)量越高，其降低表面張力的效果越明顯，從而引起CMP增大的效果也越明顯。在圖2中，粗飼料干物質(zhì)降解率與微生物CMP的增高呈二次曲線(xiàn)變化。這可能與這2種牧草其化學(xué)成分不同于農(nóng)作物秸稈，其發(fā)酵產(chǎn)物也相應(yīng)發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致CMP變化不一致有關(guān)。但這有待更多的研究予以證實(shí)。

圖2　粗飼料DMD與CMP關(guān)系Fig．2 Correlation between dry matter disappearance and cell membrane permeability

4　結(jié) 論

粗飼料體外產(chǎn)氣及發(fā)酵特性受粗飼料品種的影響，較低纖維含量的牧草具有比農(nóng)作物秸稈具有更快的FRD0及FRDt0．5，其T0．5也更短。瘤胃微生物表面ZP及CSH不受粗飼料品種的影響，但微生物CMP則受粗飼料品種的影響。利用不同粗飼料發(fā)酵動(dòng)力學(xué)不同步的特性進(jìn)行組合利用可能有利于提高粗飼料的利用率。

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（編輯 武海龍）

Fermentation Characteristics of Forage and Its Effects on Interfacial Physical and Chemical Characteristics of Microbes Surface in Vitro

DANG Tan1FANG Jun2JIANG Hongmei1TAN Zhiliang3TANG Shaoxun3?
（1．College of Science，Hunan Agriculture University，Changsha 410128，China；2．College of Life Science and Technology，Hunan Agriculture University，Changsha 410128，China；3．Key Laboratory of Agro?Ecological Processes in Subtropical Region，Institute of Subtropical Agriculture，Chinese Academy of Sciences，Changsha 410125，China）

?Corresponding author，associate professor，E?mail：shaoxuntang＠163．com

Abstract：This experiment was conducted to investigate the effects of the species of forages on fermentation characteristics and the physical and chemical characteristics of microbes surface．The forages including wheat straw，corn stover，rice straw，alfalfa and Guimu?1 were selected as the substrate．The characteristics of forage fermentation and the physical and chemical characteristics of rumen microbes surface at 48 h fermentation time were recorded in an in vitro fermentation．The results showed as follows：1）there was difference in gas pro?duction and gas production kinetic parameters［the maximum gas production（Vf），dimensionless constant （b），the fractional rate of gas production（k），the time as a half of maximum gas production reached（T0．5），the initial fractional rate of degradation（FRD0）and the fractional rate of degradation as a half of maximum gas production reached（FRDt0．5）］．The Guimu?1 had the highest Vf，which were significantly higher than that of rice straw and wheat straw（P＜0．05 or P＜0．01）．The parameters of b，k，and T0．5were the highest in wheat straw，and the value

Key words：forages；fermentation characteristics in vitro；rumen microbe；interfacial physical and chemical characteristics

通信作者：?湯少勛，副研究員，碩士生導(dǎo)師，E?mail：shaoxuntang＠163．com

作者簡(jiǎn)介：黨 坦（1987—），男，河南商丘人，碩士研究生，應(yīng)用化學(xué)專(zhuān)業(yè)。E?mail：352394963＠qq．com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31172234）；湖南省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（12JJ3025）

收稿日期：2014－07－15

doi：10．3969／j．issn．1006?267x．2015．01．016

文章編號(hào)：1006?267X（2015）01?0124?09

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類(lèi)號(hào)：S816