UPLC-DAD法測(cè)定鳳岡鋅硒茶酒中的咖啡因

馬 瑩 周勝菊

（貴州省食品藥品檢驗(yàn)所，550004） (貴州醫(yī)科大學(xué)神奇民族醫(yī)藥學(xué)院）

茶酒是以茶葉為主要原料，經(jīng)過(guò)發(fā)酵、直接浸提或者過(guò)濾勾兌而得的一種具有特殊口味和保健功能的飲料酒，屬于保健酒的一個(gè)類(lèi)別。隨著國(guó)內(nèi)外茶酒研究逐漸深入，茶酒產(chǎn)品已有20多個(gè)品種被開(kāi)發(fā)。以貴州省鳳岡縣特產(chǎn)有機(jī)鋅硒茶為原料釀造而成的鳳岡鋅硒茶酒就是眾多茶酒中獨(dú)具特色的一種。茶與酒經(jīng)過(guò)特殊的工藝操作配制，感官上不僅具有酒的醇柔還保留了茶的清香，風(fēng)味優(yōu)雅、口感柔和，且能使其中的營(yíng)養(yǎng)成分集于一體，所以深受人們關(guān)注，并被越來(lái)越多的人接受和喜愛(ài)，逐漸成為保健酒的一個(gè)重要的類(lèi)別。咖啡因是茶酒的重要品質(zhì)指標(biāo)，也是茶酒中的重要安全性指標(biāo)。目前，茶酒中咖啡因含量測(cè)定方法尚未見(jiàn)報(bào)道。本文首次建立了鳳岡鋅硒茶酒中咖啡因含量測(cè)定的超高效液相色譜法，可有效監(jiān)控鳳岡鋅硒茶酒中咖啡因的含量，也為今后針對(duì)茶酒進(jìn)行的各類(lèi)質(zhì)量研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

一、儀器與材料

1.儀器

UPLC-HClass超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；XS105DU電子天平（德國(guó)METTLER TOLEDO公司）。

2.試劑

甲醇（分析純：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；色譜純：美國(guó)Tedia公司）；水（去離子水：實(shí)驗(yàn)室自制）。

3.對(duì)照品與樣品

咖啡因?qū)φ掌罚ㄖ袊?guó)食品藥品檢定研究院提供，含量100%，批號(hào)：171215-201010）；鳳岡鋅硒茶酒樣品（貴州鳳岡文土鋅硒開(kāi)發(fā)有限公司提供；凈含量750mL，酒精度40%Vol，原料為泉水、大米、茶葉、蔗糖、酒曲）。

二、試驗(yàn)方法

1.溶液的制備

（1）對(duì)照品溶液的制備。精密稱(chēng)取咖啡因?qū)φ掌?.01017g，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取5mL，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL含咖啡因0.5085mg的對(duì)照品溶液。

（2）供試品溶液的制備。取鳳岡鋅硒茶酒適量，混勻，用0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

（3）陰性溶液的制備。取原料含水、大米、蔗糖、酒曲而不含茶的白酒作為陰性樣品溶液，取適量，混勻，用0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為陰性溶液。

2.色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（美國(guó)Waters公司，1.7μm，2.1×100mm，柱號(hào)021933135156 06）；流動(dòng)相：甲醇-水（35∶65）；檢測(cè)波長(zhǎng)272nm，掃描范圍190～400nm；流速0.1mL/min；柱溫30℃。分別精密吸取制備好的3種溶液各1μL注入U(xiǎn)PLC，在上述色譜條件下進(jìn)行分析，記錄色譜峰，計(jì)算分離度、理論塔板數(shù)等參數(shù)，考察系統(tǒng)適應(yīng)性。

3.方法學(xué)考察

（1）線(xiàn)性關(guān)系實(shí)驗(yàn)。精密稱(chēng)取咖啡因?qū)φ掌?.01017g，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取1、2、3、4、5、6mL，分置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)系列溶液。分別精密吸取上述溶液各0.5μL，注入U(xiǎn)PLC，記錄色譜圖，以峰面積A為縱坐標(biāo)，咖啡因的量c（μg）為橫坐標(biāo)，繪制線(xiàn)性回歸曲線(xiàn)，計(jì)算線(xiàn)性方程及相關(guān)系數(shù)。

（2）儀器精密度試驗(yàn)。精密吸取咖啡因?qū)φ掌啡芤?.5μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算6次峰面積值的RSD。

（3）重復(fù)性試驗(yàn)。按照“對(duì)照品溶液的制備”方法，制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣0.5μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算樣品中咖啡因的含量，并計(jì)算含量平均值及RSD。

（4）穩(wěn)定性試驗(yàn)。取重復(fù)性試驗(yàn)中的第1份供試品溶液，分別于0、5、10、15、20、24h進(jìn)樣共6次，測(cè)定咖啡因峰面積，計(jì)算6次峰面積值的RSD。

（5）回收率試驗(yàn)。采用加樣回收法進(jìn)行試驗(yàn)。精密稱(chēng)取咖啡因?qū)φ掌?.02023g，置50mL容量瓶中，加甲醇適量溶解，用甲醇定容至刻度，搖勻，作為回收率對(duì)照品溶液。取鳳岡鋅硒茶酒適量，混勻，精密吸取9份溶液各5mL，分別置10mL容量瓶中，其中，第1、2、3份分別精密加入咖啡因回收率對(duì)照品溶液2mL、第4、5、6份分別精密加入咖啡因回收率對(duì)照品溶液2.5mL、第7、8、9份分別精密加入咖啡因回收率對(duì)照品溶液3mL，9份試樣分別用甲醇定容至刻度，搖勻，用0.22μm微孔膜濾過(guò)，取續(xù)濾液注入U(xiǎn)PLC進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算咖啡因回收率。

4.樣品含量測(cè)定

取鳳岡鋅硒茶酒樣品6批，按上述方法制備對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別進(jìn)樣0.5μL，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積，計(jì)算樣品中咖啡因的含量。

三、結(jié)果

1.系統(tǒng)適應(yīng)性

在前述色譜條件下，咖啡因與雜質(zhì)峰分離完全，分離度大于1.5，對(duì)照品及供試品色譜中咖啡因峰的理論塔板數(shù)均不小于5000（圖1～3）。

圖1 咖啡因?qū)φ掌飞V圖

圖2 供試品溶液色譜圖

2.線(xiàn)性關(guān)系結(jié)果

計(jì)算線(xiàn)性回歸方程得：A=31550227c-281943，r=0.99997，結(jié)果表明在0.05085～0.3051μg范圍內(nèi)，咖啡因的量與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

3.儀器精密度結(jié)果

結(jié)果6次峰面積值的RSD=0.64%，表明儀器精密度良好。

4.重復(fù)性結(jié)果

結(jié)果樣品含量6次測(cè)定值在0.2116～0.2123 mg/mL范圍內(nèi)，平均含量為0.2120mg/mL，RSD=0.13%，表明樣品重復(fù)性良好。

5.穩(wěn)定性結(jié)果

結(jié)果6次峰面積值的RSD=0.15%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

6.回收率結(jié)果

該實(shí)驗(yàn)的回收率在99.02%～100.33%之間，RSD=0.45%，結(jié)果表明用此方法測(cè)定咖啡因含量的準(zhǔn)確度良好。詳見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

7.樣品含量測(cè)定結(jié)果

按前述方法對(duì)6批鳳岡鋅硒茶酒樣品中的咖啡因進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果各批次鳳岡鋅硒茶酒中咖啡因的含量在0.20～0.26mg/mL范圍內(nèi)，詳見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果 mg/mL

四、討 論

1.將咖啡因?qū)φ諛?biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行紫外-可見(jiàn)全波段掃描（190～800nm），結(jié)果得到咖啡因的2個(gè)吸收峰分別處于204.8nm和272.2nm處。為避免溶劑的末端吸收及雜質(zhì)峰的影響，故選擇272nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。大于400nm波長(zhǎng)范圍咖啡因紫外-可見(jiàn)吸收值為0，故方法中波長(zhǎng)掃描范圍確定為190～400nm。

2.對(duì)流動(dòng)相比例、流速、柱溫進(jìn)行考察，實(shí)驗(yàn)表明在流動(dòng)相比例為甲醇∶水(體積比)=35∶65、流速為0.1mL/min、柱溫為30℃時(shí)，出峰保留時(shí)間適中，峰型對(duì)稱(chēng)，咖啡因峰與雜質(zhì)峰分離完全，故本方法選定了前述的色譜條件。

3.本研究采用了超高效液相色譜儀（UPLC）建立咖啡因含量測(cè)定方法并完成方法學(xué)考察。用高效液相色譜儀（HPLC）及HPLC色譜柱對(duì)該方法進(jìn)行了適用性考察。結(jié)果所得HPLC圖譜中，咖啡因保留時(shí)間較長(zhǎng)，峰型較差，理論塔板數(shù)較低，分離度不理想，今后將繼續(xù)對(duì)該方法進(jìn)行改進(jìn)，使之同樣適用于HPLC，以便能被更廣泛地應(yīng)用。

4.該方法亦可用于其他各類(lèi)水基液體樣品中咖啡因的檢測(cè)。當(dāng)咖啡因作為禁用物質(zhì)被檢測(cè)時(shí)，如樣品色譜中在與咖啡因?qū)φ掌飞V相應(yīng)位置處出現(xiàn)色譜峰，應(yīng)比對(duì)該物質(zhì)的光譜與咖啡因光譜的一致性，進(jìn)行定性鑒別。

5.經(jīng)實(shí)驗(yàn)得該方法對(duì)咖啡因的最低檢出濃度為0.4μg/mL。用該方法對(duì)菩提子酒、幸九酒、金花茶酒3種原料中含茶的保健酒進(jìn)行咖啡因的檢測(cè)，結(jié)果均未檢出咖啡因。說(shuō)明原料含茶的酒中并不一定含有咖啡因。含咖啡因與不含咖啡因茶酒品質(zhì)及功效的差別需進(jìn)行更深入研究后方能確定。