SSR分子標(biāo)記技術(shù)在甘藍(lán)型油菜雜交種陜油16純度鑒定中的應(yīng)用

盧 虹， 徐愛(ài)遐

（西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西 楊凌712100）

油菜屬于十字花科蕓薹屬，是世界四大油料作物（大豆、油菜、花生、向日葵）之一。中國(guó)是重要的油菜生產(chǎn)國(guó)，2013—2014年度中國(guó)的油菜籽產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的20.6%。2012—2013年度中國(guó)油料播種面積為1 402.3萬(wàn)hm2，油菜籽播種面積為753.1萬(wàn)hm2，占油料播種面積的53.7%。2012—2013年度較往年油菜播種面積、總產(chǎn)增加，但是單產(chǎn)降低［1］，雜種優(yōu)勢(shì)的利用是一種有效的提高油菜產(chǎn)量的重要途徑。

隨著油菜雜種優(yōu)勢(shì)的利用，市場(chǎng)上的雜交油菜推廣面積占油菜生產(chǎn)總面積的60%［2］。雜種利用的主要途徑有：細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CMS）、細(xì)胞核雄性不育（GMS）、化學(xué)誘導(dǎo)雄性不育（CHA）和自交不親和性（SI）等［3］，但目前應(yīng)用于生產(chǎn)的細(xì)胞質(zhì)雄性不育主要是高溫不育型，在低溫條件下容易產(chǎn)生微粉，造成自交結(jié)實(shí)從而影響雜交種的純度［4］。因此，對(duì)雜交種的純度研究顯得尤為重要。

目前，農(nóng)作物雜交種純度的鑒定方法主要有三大類：形態(tài)學(xué)鑒定、生化標(biāo)記鑒定和DNA水平鑒定。形態(tài)學(xué)鑒定周期長(zhǎng)，易受環(huán)境影響，相似形態(tài)特征的鑒定困難，鑒定者的經(jīng)驗(yàn)制約設(shè)鑒定的準(zhǔn)確性，而且花費(fèi)高；生化標(biāo)記鑒定不穩(wěn)定受環(huán)境影響較大，具有嚴(yán)格的組織和時(shí)間表達(dá)特異性［5－6］。DNA水平鑒定有DNA分子標(biāo)記技術(shù)和基因組DNA的光譜分析（Fourier transform infrared spectroscopy）［7］，DNA 分子標(biāo) 記技術(shù)可以有效的避免上述問(wèn)題，具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。DNA分子標(biāo)記技術(shù)主要包括RAPD、SRAP、SSR、ISSR、EST－SSR、INDEL、AFLP 等［8－12］。其中，SSR分子標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用于油菜［13］、大豆［14］、向日葵［15］、棉花［16］、水稻［17－8］、玉米［19］等的雜交種純度鑒定。

本試驗(yàn)利用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)甘藍(lán)型油菜陜油16雜交種純度進(jìn)行研究，以期找到可以鑒定陜油16雜交種純度的SSR標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甘藍(lán)型油菜雜交種陜油16及其雙親9A（♀）和530C（♂）均由西北農(nóng)林科技大學(xué)油菜中心品種資源課題組提供。陜油16大田制種種子樣本由楊凌金諾公司和楊凌高科公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

80對(duì)引物來(lái)源于白菜型油菜基因組已公布信息，下載網(wǎng)址 http：／／brassicadb.org／brad／geneticMarker.php？chr＝ALL。所有引物均有上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2 DNA的提取與檢測(cè)

雜交種陜油16及其親本各取100粒，大田制種種子各取400粒，分別均勻放入鋪有2層吸水紙的培養(yǎng)皿中，早晚各澆水1次，室溫下發(fā)芽5～7d。取幼芽上半部分放入研缽中，隨機(jī)選取實(shí)驗(yàn)材料父本、F1、母本標(biāo)準(zhǔn)樣品10個(gè)單株的幼嫩子葉分別混合磨樣，提取DNA用于標(biāo)記篩選。陜油16大田制種材料分別取188株并編號(hào)，進(jìn)行單株DNA提取，用于純度鑒定?；蚪MDNA提取采用CTAB法進(jìn)行［20］。

1.2.3 雜交種及其親本的SSR分析

1）PCR擴(kuò)增。PCR循環(huán)參數(shù)94℃預(yù)變性3 min，94℃變性1min，60℃退火30s，72℃延伸45s，此后每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0.5℃，共計(jì)9個(gè)循環(huán)；94℃變性1min，55℃退火30s，72℃延伸45s，29個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。

表1 PCR反應(yīng)體系

2）電泳檢測(cè)。樣品從PCR中取出來(lái)后加入等體積的Loading buffer，放入水浴中變性5min，然后放入冰水混合物中冷卻；然后在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳（U＝2 000VI＝200AP＝85W）45min左右；電泳完成后，用10%醋酸固定20min后，蒸餾水漂洗2遍，每次10min；然后用硝酸銀染色、碳酸鈉顯影，再用10%醋酸固定，經(jīng)漂洗后自然風(fēng)干，拍照保存。

1.3 種子純度的鑒定

1.3.1 SSR分子標(biāo)記鑒定

用80對(duì)SSR引物在構(gòu)建的陜油16及其雙親的基因池中進(jìn)行篩選，用篩選到的具有差異的SSR引物鑒定陜油16大田制種材料的純度。雜交種純度（%）＝具有雙親特征條帶的樣本數(shù)／檢測(cè)的樣本總數(shù)×100%。

1.3.2 田間植株鑒定

陜油16種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)油菜實(shí)驗(yàn)基地，每個(gè)品種設(shè)2個(gè)小區(qū)，進(jìn)行常規(guī)田間管理，不間苗，在盛花期統(tǒng)計(jì)總株數(shù)以及不育株數(shù)。

鑒定方法為：當(dāng)天開(kāi)的花中，如果有花朵的花藥高于柱頭、正常散粉且發(fā)育正常則記為可育株，花朵較小、花藥等于或低于柱頭且雄蕊退化不能散粉的單株記為不育株，其中未開(kāi)花的單株不計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 特征型引物的篩選

用80對(duì)SSR引物在陜油16雜交種及其親本中進(jìn)行篩選和群體驗(yàn)證后，確定有3對(duì)引物SSR 313、SSR 354、SSR 359在陜油16雜交種及其親本中存在多態(tài)性，擴(kuò)增帶型清晰，容易分辨，且在陜油16及其雙親中表現(xiàn)共顯性，見(jiàn)圖1，引物序列見(jiàn)表2。

2.2 SSR標(biāo)記用于陜油16雜交種種子純度鑒定

試驗(yàn)中共檢測(cè)了188個(gè)陜油16雜交種單株（如圖2～圖4箭頭所示），與P1條帶相同的記為母本（不育系），與P2條帶相同的記為父本（恢復(fù)系），與F1條帶相同的記為雜交種；圖2，圖3，圖4分別是SSR 313、SSR 354、SSR 359用于陜油16大田制種種子純度鑒定圖（部分）。

表2 SSR引物序列

圖1 SSR引物對(duì)陜油16及其親本的擴(kuò)增結(jié)果

圖2 SSR 313對(duì)陜油16部分單株及其親本的擴(kuò)增結(jié)果

圖3 SSR 354對(duì)陜油16部分單株及其親本的擴(kuò)增結(jié)果

圖4 SSR 359對(duì)陜油16部分單株及其親本的擴(kuò)增結(jié)果

統(tǒng)計(jì)2品種雜交種種子中不育系（母本）比率、恢復(fù)系（父本）比率和雜交種純度鑒定結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可以看出，SSR標(biāo)記鑒定結(jié)果中不育株比率均大于恢復(fù)系比率。

表3 陜油16雜交種種子純度鑒定結(jié)果

2.3 田間植株鑒定

于油菜盛花期（4月1日）在田間對(duì)陜油16鑒定圃材料進(jìn)行全區(qū)逐株觀察鑒定，鑒別育性。田間種植鑒定結(jié)果顯示，陜油16品種的平均純度為85.61%，結(jié)果見(jiàn)表4。

對(duì)陜油16的SSR鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果進(jìn)行了比較分析，結(jié)果顯示，田間鑒定的平均純度高于SSR鑒定結(jié)果3.71%。

表4 陜油16的田間鑒定結(jié)果

3 討 論

首先，本研究篩選的SSR引物在陜油16的F1代雜交種擴(kuò)增結(jié)果均具有親本的兩條帶，說(shuō)明SSR標(biāo)記有穩(wěn)定的共顯性，可以用來(lái)鑒定甘藍(lán)型油菜的雜交種純度。

其次，本研究發(fā)現(xiàn)，分子標(biāo)記鑒定結(jié)果中，不育株率較父本株率高，說(shuō)明母本因微粉導(dǎo)致的自交是雜交種種子純度降低的重要原因。因此，在制種過(guò)程中要特別注意母本的育性，可采用化學(xué)殺雄的方法盡量避免由于微粉造成的雜交種純度降低。

此外，本研究中SSR標(biāo)記純度鑒定結(jié)果均低于田間鑒定結(jié)果，與王同華等［21］的研究結(jié)果一致，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的可能原因是田間鑒定主要通過(guò)形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行判斷，由于材料間親緣關(guān)系較近，很難做出準(zhǔn)確的鑒定，而SSR分子標(biāo)記技術(shù)可以準(zhǔn)確識(shí)別非雜交單株，如由于母本因微粉導(dǎo)致的自交、花粉污染、機(jī)械混雜等原因造成的混雜，因此，SSR標(biāo)記技術(shù)得到的純度鑒定結(jié)果比種植鑒定的結(jié)果更為可靠、準(zhǔn)確。

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