姜黃素對大腦中動脈缺血模型大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制研究

李姝雅，王伊龍，王春雪，劉改芬，王擁軍

腦缺血后局部炎性因子的表達(dá)顯著增加，且急性炎性因子的升高程度與臨床預(yù)后緊密相關(guān)[1]。Notch信號通路調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的浸潤分化和血管新生[2-4]，并參與炎癥反應(yīng)過程[5]。研究發(fā)現(xiàn)，Notch 1可與經(jīng)典炎性因子NF-κB共活化參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控。姜黃素（curcumin），黃色粉末，為姜黃根莖的生物活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗血管粥樣硬化及保護(hù)肝腎等多種生物學(xué)作用[6-7]。本研究擬通過公認(rèn)的線栓法建立穩(wěn)定的大鼠大腦中動脈梗死（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，通過觀察姜黃素對Notch 1和NF-κB的作用，進(jìn)一步探討其神經(jīng)保護(hù)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物及試劑

成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠93只，體重250～280 g，清潔級，由河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。姜黃素（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA）：用含0.5 mol/L NaOH的0.01 PBS配制，濃度12.5 mg/ml。

1.2 試驗(yàn)動物分組與給藥

1.2.1 姜黃素對Notch 1和NF-κB表達(dá)的影響 試驗(yàn)動物分為三組（63只）：①姜黃素組（CUR）：參照Longa線栓法制作大鼠右側(cè)MCAO模型。在MCAO模型基礎(chǔ)上按80 mg/kg劑量腹腔注射配制好的姜黃素溶液。②溶劑對照組（vehicle-control）：在MCAO模型基礎(chǔ)上按80 mg/kg劑量腹腔注射含0.5 mol/L NaOH的0.01 PBS。③假手術(shù)組（sham）：除不在頸內(nèi)動脈插入線栓外，其余步驟同Longa線栓法操作，模型制作完成后按80 mg/kg劑量腹腔注射含0.5 mol/L NaOH的0.01 PBS。每組均按時間點(diǎn)分為對照、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h共7個亞組，每個亞組3只大鼠。用免疫組化和Western blot的方法測定Notch 1和NF-κB的動態(tài)表達(dá)。

1.2.2 姜黃素急性腦缺血的神經(jīng)保護(hù)作用 30只大鼠隨機(jī)分配至CUR組、vehicle-control組、sham組，建模48 h評價神經(jīng)功能學(xué)評分，5只用于腦含水量測定，5只用于梗死體積測定。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 神經(jīng)功能學(xué)評分 Longa改良評分法：0分：沒有神經(jīng)功能缺損；1分：左側(cè)（癱瘓側(cè)）前爪不能完全伸展；2分：左側(cè)（癱瘓側(cè)）前肢不能伸展；3分：行走時，大鼠向左側(cè)（癱瘓側(cè)）轉(zhuǎn)大圈；4分：行走時，大鼠向左側(cè)（癱瘓側(cè)）轉(zhuǎn)小圈；5分：行走時，大鼠身體向左側(cè)（癱瘓側(cè)）傾倒[8]。

1.3.2 腦含水量的測定 將成功入組的大鼠在相應(yīng)時間點(diǎn)麻醉后斷頭處死，取出完整腦組織，前去額極，后去部分枕葉，留取腦組織中間部分厚約4 mm。將腦組織放入事先稱重的錫箔紙中包好稱重，減去錫箔紙重量即得濕重。將包有錫箔紙的腦組織放入95℃烤箱內(nèi)烘干24 h，取出待測腦組織恢復(fù)到室溫，反復(fù)稱量至恒重，減去錫箔紙重量即得干重。腦組織含水量：（濕重-干重）/濕重×100%。

1.3.3 腦梗死體積百分比測定 大鼠麻醉斷頭處死后，取出完整新鮮腦組織，連續(xù)切成2 mm厚的冠狀組織切片，置于新鮮配制的2%的2，3，5-三苯基四唑氮紅（triphenyltetrazolium chloride，TTC）中，37℃孵育30 min。用Olympus SP560數(shù)碼相機(jī)采取圖像，Image Pro-Plus 5.1分析系統(tǒng)對圖片進(jìn)行分析?？偣Ｋ荔w積=總梗死面積×腦片的厚度。水腫修正后梗死體積=對側(cè)半球體積-（損傷側(cè)半球體積-損傷側(cè)半球梗死體積）。梗死體積百分比（%）=修正后梗死體積/對側(cè)半球體積。

1.3.4 免疫組織化學(xué)法檢測Notch 1和NF-κB陽性細(xì)胞 按照SP試劑盒說明書（北京中杉生物工程有限公司）進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。所用Notch 1兔抗大鼠多克隆抗體（1∶400，Abcam Biotechnology），NF-κB P65兔抗大鼠多克隆抗體（1∶150，Santa Cruz Biotechnology）。光鏡下胞質(zhì)中棕黃色顆粒為陽性產(chǎn)物。

1.3.5 Western blot法檢測Notch 1和NF-κB蛋白按照總蛋白提取試劑盒說明書（北京普利萊公司）提取蛋白，BCA蛋白檢測試劑盒（美國Novagen）測定蛋白濃度。取等質(zhì)量的樣本蛋白（30 μg），進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（初始電壓80 V 1 h，后100 V 1 h）；將標(biāo)本蛋白轉(zhuǎn)移至PDVF膜上；TBST洗滌3次，每次5 min；加入TBST稀釋的一抗（兔抗大鼠Notch 1抗體，1∶300，Abcam Biotechnology，兔抗大鼠NF-κB P65抗體，1∶100，Santa Cruz Biotechnology），4℃搖床過夜。TBST洗滌3次，每次10 min；封閉2 h后加入熒光標(biāo)記的二抗工作液（1∶6000，Rockland），室溫下避光振蕩1 h。TBST洗滌3次，每次10 min；圖像掃描分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素下調(diào)了Notch 1和NF-κB在MCAO中的表達(dá)

與vehicle-control組相比，CUR組中Notch 1和NF-κB表達(dá)下調(diào)，比較差異有顯著性（P＜0.05）。見表1、圖1和圖2。

2.2 姜黃素降低神經(jīng)功能評分

與vehicle-control組相比，CUR組降低MCAO后48 h時神經(jīng)功能評分，比較差異有顯著性（P＜0.05）。見圖3。

2.3 姜黃素減輕腦水腫

用干濕重法測得的腦組織含水量結(jié)果顯示：sham組為（78.16±8.00）%，vehicle-control組為（83.71±7.00）%，CUR組的腦組織含水量較vehicle-control組有所下降，為（80.42±9.00）%，比較差異有顯著性（P＜0.05）。見圖4A。

2.4 姜黃素減少梗死體積

腦梗死體積測定結(jié)果顯示，CUR組為（28.94±6.20）%，低于vehiclecontrol組的（40.08±3.66）%，比較差異有顯著性（P＜0.05）。見圖4B。

3 討論

表1 免疫組織化學(xué)陽性細(xì)胞數(shù)的動態(tài)表達(dá)

圖1 免疫組織化學(xué)陽性細(xì)胞數(shù)的動態(tài)表達(dá)

姜黃素是從姜科姜黃屬植物的根莖中提取的一種植物多酚，是姜黃發(fā)揮藥理作用最重要的活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)肝腎功能等多種生物學(xué)功能。在宮頸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，姜黃素可通過降低Notch和NF-κB的表達(dá)起到抗癌作用，說明姜黃素與Notch通路間存在聯(lián)系[9-10]。姜黃素用于治療缺血性腦血管病，可減少腦水腫和梗死面積，改善神經(jīng)功能學(xué)評分，其作用機(jī)制尚未明確。研究證實(shí)，姜黃素能升高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）水平，降低腦缺血病灶周圍的氧化應(yīng)激反應(yīng)，挽救缺血半暗帶的神經(jīng)元，減輕缺血后腦損傷。炎癥反應(yīng)在缺血后腦損傷機(jī)制中的作用已得到共識，NF-κB作為炎癥反應(yīng)的核心因子，在缺血性腦損傷中起到重要作用。姜黃素通過抑制NF-κB的表達(dá)，干擾下游基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮抗炎作用。對于姜黃素的抗炎作用是否可作為其腦保護(hù)作用機(jī)制之一，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，姜黃素可同步降低缺血后腦組織中NF-κB和Notch 1的表達(dá)，推測Notch信號通路可能通過調(diào)節(jié)NF-κB的表達(dá)參與姜黃素的腦保護(hù)作用。

圖2 不同時間點(diǎn)測定Western blot蛋白表達(dá)水平

圖3 不同組別神經(jīng)功能學(xué)評分

圖4 姜黃素對腦含水量及梗死體積的影響

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