石墨烯類材料在組織工程中的應(yīng)用

鄒亞光　魏皎　綜述　李青峰　審校

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石墨烯類材料在組織工程中的應(yīng)用

鄒亞光魏皎綜述李青峰審校

【提要】石墨烯是一種具有獨(dú)特理化性質(zhì)的二維晶體納米材料，在各個(gè)領(lǐng)域中都有廣泛應(yīng)用，但在再生醫(yī)學(xué)方面的研究尚處于早期階段。我們就石墨烯類材料的細(xì)胞毒性，及其誘導(dǎo)干細(xì)胞向成骨、成神經(jīng)、成心肌、成脂方向分化的相關(guān)研究進(jìn)行綜述。

【關(guān)鍵詞】石墨烯細(xì)胞毒性分化

作者單位：200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。

Application of Graphene-based Materials in Tissue Engineering

ZOU Yaguang,WEI Jiao,LI Qingfeng.

Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200011,China.Corresponding author:LI Qingfeng(E-mail:dr.liqingfeng@yahoo.com).

【Summary】Graphene is a kind of atomic crystal nanomaterial arranged in a two-dimensional structure with extraordinary physicochemical properties,which have been extensively employed in various fields.However the application of graphene in regenerative medicine is still in an early phase.In this paper,the study of toxicity of graphene-based materials and its ability of inducing stem cell differentiation into osteogenic,neuronal,cardiomyogenic and adipogenic lineages were reviewed.

【Key words】Graphene;Cell toxicity;Differentiation

碳元素作為地球上最常見的元素之一，是生物體內(nèi)化學(xué)反應(yīng)過程中不可缺少的一部分。由于碳原子之間的共價(jià)鍵存在多種軌道雜化方式（sp，sp2，sp3），碳元素?fù)碛袨閿?shù)眾多的同素異形體，如金剛石、石墨、足球烯等。2004年，Novoselo和Geim成功地通過實(shí)驗(yàn)從石墨中分離出石墨烯，并證實(shí)其可以單獨(dú)存在[1]。此后，石墨烯類材料就以其獨(dú)特的理化特性成為各領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)[2-3]。

石墨烯是一種二維平面多環(huán)芳香烴原子晶體，碳原子以sp2雜化軌道形成蜂巢晶格，保持著嚴(yán)格的二維結(jié)構(gòu)且非常穩(wěn)定[4]。通過不同小分子基團(tuán)的化學(xué)修飾，石墨烯的分子結(jié)構(gòu)可發(fā)生改變并形成多種衍生物，常見的石墨烯類材料包括氧化石墨烯（GO）、還原氧化石墨烯（r-GO）、多層石墨烯、超薄石墨、碳納米管（CNT）、石墨烯納米片（GNS）等，這些性質(zhì)各異的材料共同構(gòu)成了龐大的石墨烯納米材料家族（GNFs）[5-7]。同時(shí)，石墨烯類材料還能與生物相容聚合物材料結(jié)合，形成更為復(fù)雜的多功能的復(fù)合物。

石墨烯是最薄、最堅(jiān)硬的納米材料，其光學(xué)性質(zhì)、導(dǎo)熱性能、導(dǎo)電能力均非常優(yōu)秀[1，8-12]，廣泛應(yīng)用于納米生物傳感器[13]、太陽(yáng)能電池、近紅外標(biāo)記探針、光敏劑等不同領(lǐng)域[14-15]；而石墨烯的高比表面積[16]及疏水性帶來的對(duì)各類藥物分子的吸附性，使其在藥物的靶向運(yùn)輸上也擁有巨大的潛力[17-19]。

盡管石墨烯類材料在工業(yè)、微電子等領(lǐng)域中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，但其在醫(yī)學(xué)，尤其是再生醫(yī)學(xué)中的研究，依然處在相當(dāng)早期的階段。我們就石墨烯及其衍生物近年來在組織工程領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1　石墨烯類材料的毒性研究

當(dāng)石墨烯及其衍生物被應(yīng)用于生物領(lǐng)域時(shí)，其生物毒性一直是研究的焦點(diǎn)，但由于并不存在一個(gè)特征性的參數(shù)來衡量納米材料的細(xì)胞毒性，因此需要從體內(nèi)外等多方面來進(jìn)行衡量。大量的研究表明，單純的石墨烯能夠引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)，存在一定的細(xì)胞毒性[20-21]。

在Zhang等[22]的體外研究中，石墨烯與單壁碳納米管以0.1～100 μg/mL的不同濃度來測(cè)試對(duì)嗜鉻神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系PC12的影響。兩種材料均表現(xiàn)出了與濃度相關(guān)的細(xì)胞毒性。而石墨烯對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了更強(qiáng)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，介導(dǎo)Caspase-3活化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。結(jié)果表明，天然石墨烯的體外生物毒性存在一定的形狀相關(guān)性與濃度依賴性。而Chauhan等[23]的研究也表明，直徑＞5 nm的石墨烯材料容易在體內(nèi)堵塞毛細(xì)血管，引發(fā)炎癥反應(yīng)，而相對(duì)直徑較小的材料則容易被腎臟排泄。

Sasidharan等[24]測(cè)試了不同濃度的氧化石墨烯與羧基化的氧化石墨烯在猴腎細(xì)胞中的毒性作用。結(jié)果表明，氧化石墨烯會(huì)積聚在細(xì)胞膜表面，破壞F-actin蛋白的穩(wěn)定性，造成濃度依賴性的氧化應(yīng)激，影響細(xì)胞骨架的形態(tài)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；而羧基化的氧化石墨烯在任何濃度下均未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。其他相似的研究也證實(shí)了氧化石墨烯雖然毒性小于石墨烯，但在一定濃度下也會(huì)造成細(xì)胞的氧化應(yīng)激與蛋白質(zhì)、DNA的損傷和細(xì)胞凋亡，而通過更多適當(dāng)?shù)暮趸鶊F(tuán)的修飾，可以削弱石墨烯疏水鍵與細(xì)胞間的相互作用，降低其毒性[19，25-28]。另外，同屬石墨烯材料家族的還原氧化石墨烯，在體外實(shí)驗(yàn)中也導(dǎo)致細(xì)胞活力顯著降低，表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性[29]。

進(jìn)一步研究表明，石墨烯類材料通過表面修飾和功能化能夠降低生物毒性，增加生物相容性，甚至促進(jìn)細(xì)胞增殖。Liao等[30]報(bào)道了使用殼聚糖被覆的氧化石墨烯成功解決了普通氧化石墨烯帶來的溶血副作用。Yang等[14，31-32]介紹了聚乙二醇（PEG）偶聯(lián)的石墨烯類材料（包括石墨烯與氧化石墨烯）在生物體內(nèi)毒性的改善，包括體外毒性的降低，體內(nèi)在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)內(nèi)潴留較少，腫瘤細(xì)胞內(nèi)積聚增多，對(duì)血液系統(tǒng)、消化系統(tǒng)沒有明顯的毒副作用等。同時(shí)，他們也報(bào)道了葡聚糖（Dextran）功能化的氧化石墨烯能夠顯著增加細(xì)胞的體外活性，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，并在體內(nèi)增加肝臟與脾臟對(duì)材料的吸收與代謝，減少其短期毒性[33]。

綜上所述，盡管石墨烯類材料存在有一定的體外毒性，材料本身的形狀、大小、濃度，以及培養(yǎng)細(xì)胞的種類、狀態(tài)均會(huì)對(duì)其毒性造成影響，但通過一定程度的化學(xué)修飾及高分子材料的功能化能夠有效地降低材料本身的毒性，改善生物相容性，并促進(jìn)其在生物體內(nèi)的靶向、分解與代謝。因此，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，功能化的石墨烯材料是一種安全的選擇。

2　石墨烯類材料與細(xì)胞分化的研究

因具有高生物兼容性，低毒性，高比表面積，對(duì)各類小分子物質(zhì)較強(qiáng)的吸附能力等物理化學(xué)性質(zhì)，石墨烯類材料在組織工程領(lǐng)域有著良好的應(yīng)用前景。目前的研究主要包括①將石墨烯類納米材料溶解于干細(xì)胞培養(yǎng)液中，檢測(cè)其對(duì)干細(xì)胞體外分化的影響；②將石墨烯類材料單獨(dú)或與高分子材料進(jìn)行偶聯(lián)，制成生物支架，研究干細(xì)胞在其表面的黏附、增殖、分化[34-35]。目前已有大量的研究表明，石墨烯類材料能夠促進(jìn)干細(xì)胞多向分化。

2.1成骨方向研究

骨組織工程一直致力于研究不同材料誘導(dǎo)干細(xì)胞向成骨方向分化，以填補(bǔ)因嚴(yán)重?fù)p傷或先天性殘疾等因素造成的骨缺損。研究表明，石墨烯類材料能顯著增強(qiáng)現(xiàn)有支架材料的生物相容性，并促進(jìn)干細(xì)胞的黏附、增殖及分化[36]。

Kalbacova等[37]將石墨烯被覆于二氧化硅材料表面，并在其上種植成骨細(xì)胞與hBMSC。培養(yǎng)48 h后，被覆組材料上的細(xì)胞相比對(duì)照組具有更強(qiáng)的黏附性和增殖能力。Nayak等[38-39]則先后使用聚乙二醇偶聯(lián)的碳納米管與石墨烯被覆的PET、PDMS、Si/SiO2等材料來檢測(cè)不同硬度的基底材料上石墨烯類材料對(duì)BMSCs成骨分化能力的影響。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組BMSCs出現(xiàn)了顯著的成骨細(xì)胞標(biāo)志物降鈣素（OCN）的表達(dá)，而對(duì)照組中的細(xì)胞則依舊CD44陽(yáng)性表達(dá)（BMSC的特征性標(biāo)志）；在茜素紅染色中，實(shí)驗(yàn)組也出現(xiàn)了更多的鈣沉積。證明了石墨烯材料是促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化的重要因素，與基底材料的種類沒有明顯的相關(guān)性。

Pan等[40]發(fā)現(xiàn)，種植于碳納米管復(fù)合支架上的BMSCs使用普通干細(xì)胞培養(yǎng)液（不含誘導(dǎo)因子），也能誘導(dǎo)分化成骨，并高表達(dá)堿性磷酸酶，認(rèn)為可能與材料在空間上的形態(tài)有一定的關(guān)系。Crowder等[41]的研究表明，三維泡沫狀結(jié)構(gòu)的石墨烯材料同樣能夠誘導(dǎo)hBMSCs向成骨方向分化。研究發(fā)現(xiàn)，氧化石墨烯材料能夠促進(jìn)hBMSCs成骨方向分化[42]。種植于氧化石墨烯被覆鈦金屬材料表面的hBMSCs在2～3周后出現(xiàn)了更顯著的骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2）的表達(dá)。

2.2神經(jīng)方向研究

目前，自體神經(jīng)移植仍然是神經(jīng)損傷修復(fù)的首選方案，然而，供區(qū)的缺乏與移植后供區(qū)神經(jīng)功能的缺損一直是無法解決的問題[43]。因此，構(gòu)建組織工程化神經(jīng)以供移植，被視為最佳的替代方案[44]。相關(guān)研究中，常以神經(jīng)干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，并以一定的電刺激作為誘導(dǎo)分化的條件。石墨烯類材料以其優(yōu)異的電學(xué)特性和對(duì)干細(xì)胞良好的生物相容性被廣泛地應(yīng)用[45]。

相關(guān)研究表明，石墨烯被覆的材料相比對(duì)照組更能促進(jìn)NSCs或神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞PC-12的黏附與增殖，并促進(jìn)其向神經(jīng)元細(xì)胞方向分化[46-47]。氧化石墨烯與還原氧化石墨烯被覆的材料能在一定條件刺激下（電刺激、光刺激）促進(jìn)ESCs 與NSCs分化為神經(jīng)元細(xì)胞，并抑制其向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化[48-49]。

Li等[50]發(fā)現(xiàn)，三維結(jié)構(gòu)的石墨烯支架更能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的黏附，并能通過更好的導(dǎo)電性傳遞電刺激促使干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞分化。Wang等[51]的研究則表明，氟化的石墨烯材料相較于傳統(tǒng)的純石墨烯，能更為顯著地促進(jìn)MSCs向神經(jīng)細(xì)胞方向分化。而Chao等[52]的研究也表明，碳納米管與聚丙烯酸復(fù)合材料能夠很好地消除原有聚丙烯酸對(duì)神經(jīng)分化的不良影響，并促進(jìn)ESCs神經(jīng)方向的分化[53]。

2.3心肌方向研究

石墨烯類材料良好的導(dǎo)電性同樣被應(yīng)用于促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖與干細(xì)胞向心肌方向分化的生物支架材料中。碳納米管的納米幾何結(jié)構(gòu)與人心臟組織細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)非常相似，Stout等[54]將碳納米管與聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）材料相結(jié)合，探究復(fù)合支架與心肌細(xì)胞的相互影響。研究表明，結(jié)合了碳納米管的支架上，心肌細(xì)胞的密度接近對(duì)照組的5倍。Mooney等[55]則將hMSCs種植于碳納米管與聚乳酸材料（PLA）的復(fù)合支架上，經(jīng)一定的電刺激，發(fā)現(xiàn)hMSCs顯著表現(xiàn)出向心肌前體細(xì)胞分化的趨勢(shì)，其心肌相關(guān)蛋白Nkx2.5、GATA-4、心肌肌鈣蛋白T與心肌縫隙連接蛋白43明顯上調(diào)。

不僅僅局限于碳納米管，Lee等[56]也報(bào)道了玻璃黏連蛋白（VN）被覆的石墨烯材料能夠促使種植其上的ESCs中與內(nèi)胚層、中胚層分化相關(guān)的基因表達(dá)逐步上調(diào)，并隨后向心肌方向分化。研究認(rèn)為，這一分化過程與石墨烯促進(jìn)培養(yǎng)環(huán)境中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白與信號(hào)分子表達(dá)上調(diào)有關(guān)[57]。

2.4成脂方向研究

Lee等[58]將hMSCs種植在覆有石墨烯與氧化石墨烯的聚二甲基硅氧烷（PDMS）材料表面，經(jīng)14 d的成脂誘導(dǎo)后，油紅染色顯示氧化石墨烯材料組能夠顯著地促進(jìn)hMSCs成脂方向的分化，說明氧化石墨烯能夠濃縮成脂誘導(dǎo)液的成分，是有效促進(jìn)分化的平臺(tái)。然而石墨烯材料組卻明顯抑制了其分化，可能與石墨烯促使胰島素變性有關(guān)。另有類似研究顯示，氧化石墨烯能夠促進(jìn)hADSCs在材料表面的黏附與增殖，同時(shí)也顯著提高了hADSCs向成骨、上皮方向的分化能力，并抑制其向成軟骨方向分化[34]。

近年來，石墨烯類材料在組織工程領(lǐng)域的研究中，體內(nèi)與體外的實(shí)驗(yàn)均證實(shí)其能促進(jìn)組織的修復(fù)與重建，甚至已有一部分臨床試驗(yàn)獲得開展。但是該材料對(duì)細(xì)胞的潛在毒性不容忽視，眾多因素均對(duì)其毒性的評(píng)估有著至關(guān)重要的影響。只有盡早地建立相關(guān)材料的加工流程規(guī)范與精確的生物相容性評(píng)估系統(tǒng)，才能使石墨烯類材料擺脫安全性的爭(zhēng)議。

雖有大量的研究表明石墨烯與其衍生物氧化石墨烯等材料能顯著促進(jìn)干細(xì)胞黏附、增殖，并向各個(gè)方向分化，但其確切的機(jī)制仍不明確。目前的研究認(rèn)為，石墨烯類材料以其獨(dú)特的納米微觀結(jié)構(gòu)（如不同形態(tài)材料表面對(duì)細(xì)胞的張力）、高比表面積，以及強(qiáng)大的吸附能力，使大量生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能聚集、濃縮其表面，作為一種干細(xì)胞巢，影響細(xì)胞分子信號(hào)通路的表達(dá)，從而誘導(dǎo)干細(xì)胞的分化。而外源性協(xié)同的電與光學(xué)的刺激，及復(fù)合材料帶來的特性，也能很大程度影響石墨烯對(duì)干細(xì)胞分化的作用。進(jìn)一步深入研究石墨烯與干細(xì)胞間的相互作用，將對(duì)石墨烯類材料在組織工程領(lǐng)域中的應(yīng)用提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

盡管石墨烯在醫(yī)學(xué)方面的研究仍處于早期階段，但憑借其優(yōu)異的理化特性和良好的生物相容性，石墨烯類材料在組織工程領(lǐng)域有著極大的應(yīng)用前景，有望為先天性或嚴(yán)重?fù)p傷造成的組織缺損帶來新的解決方案。

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收稿日期：（2015年11月2日；修回日期：2015年12月20日）

通訊作者：李青峰（E-mail：dr.liqingfeng@yahoo.com）。

doi:10.3969/j.issn.1673-0364.2016.01.013

【中圖分類號(hào)】R318.08

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1673－0364（2016）01－0048－04