大鼠肝臟半乳糖凝聚素-3 cDNA分子多樣性分析

大鼠肝臟半乳糖凝聚素-3 cDNA分子多樣性分析

方恩浩1，2，張珊珊3，劉倩蕓3，周建鐘4，楊仙玉1*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)動物科技學(xué)院,浙江 臨安 311300;

2. 浙江農(nóng)林大學(xué)集賢學(xué)院,浙江 臨安 311300;

3. 浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院,浙江 臨安 311300;

4. 浙江省林業(yè)生物質(zhì)化學(xué)利用重點實驗室，浙江 臨安 311300)

摘要：半乳糖凝聚素-3(Galectin-3，Gal-3)是一種多功能蛋白，參與機體內(nèi)的多種生命活動過程。為分析大鼠Rattus norvegicus gal-3 cDNA分子多樣性，在分析GenBank注冊的大鼠gal-3 cDNA 序列的同時，從三只不同大鼠個體的肝臟第一鏈cDNA，共計9個獨立實驗中克隆gal-3 開放閱讀框OFR (Open reading frame)。分析結(jié)果表明，在已注冊的序列中存在1個單核苷酸多態(tài)性 (Single nucleotide polymorphism，SNP)。本實驗從1-3號大鼠肝臟分別獲得118、95和120個克隆，新發(fā)現(xiàn)1處缺失和5處SNP，共克隆17個不同的 gal-3 ORF，其中僅1個克隆與已報告大鼠gal-3 cDNA 的ORF完全相同。從1號和3號個體肝臟中分別克隆11和14個不同的gal-3 ORF，揭示大鼠gal-3 cDNA存在個體水平的分子多樣性。

關(guān)鍵詞：大鼠；半乳糖凝聚素-3；cDNA多樣性；單核苷酸多態(tài)性

中圖分類號：S443.5;Q533+.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

收稿日期：2015-01-22;修回日期：2015-04-15.

作者簡介：宋東光，男，副教授，研究方向:生物信息學(xué)與植物分子育種;E-mail:3dsong@163.com.

doi:10.3969/j.issn.1672-5565.2015.02.04

Livergalectin-3 cDNA diversity inRattusnorvegicus

FANG Enhao1，2, ZHANG Shanshan3，LIU Qianyun3，ZHOU Jianzhong4，YANG Xianyu1*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ZhejiangAgriculturalandForestryUniversity,Lin′an311300,China;

2.JixianHonorsCollege,ZhejiangAgriculturalandForestryUniversity,Lin′an311300,China;

3.SchoolofForestryandBiotechnology,ZhejiangAgriculturalandForestryUniversity,Lin′an311300,China;

4.ZhejiangProvincialKeyLaboratoryofChemicalUtilizationofForestryBiomass, 88HuanchengBeilu,Lin′an311300,China)

Abstract：Galectin-3 (Gal-3) is a multi-functional protein involved in many biological processes. To clarify the gal-3 cDNA diversity of Rattus norvegicus, cloning of gal-3 open reading frame (ORF) from liver first strand cDNA of three individuals was performed totally from 9 independent experiments. Consequently, 118, 95 and 120 clones were obtained from three individuals, respectively. Alignment of all these sequences indicated 1 deletion and 5 single nucleotide polymorphism (SNP) sites, and 17 different clones were obtained. Nine out of the 17 clones appeared in two or more independent experiments, and 11 and 14 different clones were obtained from the first and the third individuals, respectively. These results indicated the objectivity of liver gal-3 cDNA diversity at individual level in R. norvegicus.

Keywords：Rattus norvegicus; Galectin-3; cDNA diversity; SNP

近年來，高通量DNA測序技術(shù)的發(fā)展，基因組和轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)在不斷的積累，學(xué)者們逐漸發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄子的多樣性以及轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 (RNA)與基因組DNA不相匹配的現(xiàn)象，而且這種多樣性出現(xiàn)于個體水平[1-2]。半乳糖凝集素(Galectins, Gal)作為動物類凝聚素，通過其高度保守的糖識別結(jié)構(gòu)域 (Carbohydrate recognition domain, CRD)特異性識別并結(jié)合β-半乳糖苷，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能[3]。在哺乳類，已發(fā)現(xiàn)15個家族成員，分為原型、串聯(lián)重復(fù)型和嵌合型三類[3]。半乳糖凝聚素-3(Gal-3) 是該家族唯一嵌合型代表，具有多種生物學(xué)功能，參與細(xì)胞增殖與分化、血管發(fā)生及腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移等多種生命過程，在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá)[4-7]。Gal-3由單拷貝基因LGALS3 編碼，包含5 個內(nèi)含子和6 個外顯子，約由250 個氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量約31 kD，由3個結(jié)構(gòu)域組成[8]。(1) N端結(jié)構(gòu)域(N-terminal domain)：由12個氨基酸殘基組成，Ser6磷酸化位點具有細(xì)胞靶向調(diào)節(jié)作用；(2) 串聯(lián)重復(fù)序列：由富含 Gly、Tyr和 Pro的串聯(lián)重復(fù)序列的類膠原結(jié)構(gòu)組成(Repetitive collagen-like sequence)；(3) CRD：由一個糖識別結(jié)構(gòu)域組成，包含凋亡基因Bcl-2家族同源序列BH1中的保守基序NWGR(Asp-Trp-Gly-Arg)[8]。在前期研究工作中，作者發(fā)現(xiàn)中華大蟾蜍Bufogargarizans皮膚第一鏈cDNA中g(shù)al-3開放閱讀框(Open reading frame，ORF)存在個體水平的分子多樣性[9-11]。鑒于Gal-3是一種多功能蛋白，分析哺乳動物gal-3 cDNA分子個體水平的多樣性具有重要的生物學(xué)意義。本文選擇哺乳類模式動物大鼠Rattusnorvegicus為研究材料，對其肝臟gal-3 ORF進(jìn)行克隆，并對其多樣性進(jìn)行分析和討論。

1材料與方法

1.1試驗動物和主要試劑

SD大鼠 (Rattusnorvegicus) 購自浙江省實驗動物中心，取其肝臟剪成小塊投入液氮中快速冷凍，再轉(zhuǎn)入-70 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

RNA提取試劑盒購自上海博彩生物技術(shù)公司，Quantscript RT kit、pGM-T載體、大腸桿菌E.coli感受態(tài)細(xì)胞DH5α購自北京天根生化科技有限公司，DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR (Polymerase chain reaction) 試劑盒購自TaKaRa，引物合成與DNA測序委托上海桑尼生物科技有限公司。

1.2引物設(shè)計

為克隆大鼠gal-3 ORF，參考GenBank已注冊的大鼠gal-3 cDNA序列 (Accession number: FQ220174, BC089054, FQ210101, FQ214799, FQ219929, FQ219987, FQ220157, FQ220215, FQ220224, FQ220313, FQ220348, FQ220361, FQ220369)，在ORF上、下游分別設(shè)計引物P1 (5′-AGGAGGAGCACTAACCAGGAAA-3′)和P2 (5′-TTTCCCGCTCATAACACACAG-3′)。

1.3大鼠肝臟第一鏈cDNA的合成及gal-3 ORF克隆

首先按試劑盒使用說明，純化大鼠肝臟總RNA，通過瓊脂糖電泳和分光光度計檢測其濃度和完整性后，合成其第一鏈cDNA。然后以大鼠肝臟第一鏈cDNA為模板，以1.2中設(shè)計的 P1與P2為引物，按照試劑盒說明實施PCR。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將PCR產(chǎn)物與T載體進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化。然后通過藍(lán)白斑篩選和菌落PCR篩選陽性菌落及回收其重組質(zhì)粒，并委托公司進(jìn)行測序。為排除在反轉(zhuǎn)錄、PCR或DNA測序等實驗過程中可能人為導(dǎo)入的堿基變化，本實驗對每一個體的肝臟第一鏈cDNA均實施3組獨立的PCR及克隆實驗，將每個實驗編號為x-y(x表示大鼠個體編號1-3，y表示實驗組號)。

1.4缺失及SNP分析

將重復(fù)出現(xiàn)于兩個或更多獨立實驗中的堿基變化(包括單核苷酸多態(tài)性SNP (Single nucleotide polymorphism，SNP)和缺失)確定為客觀存在的；反之，為實驗過程中導(dǎo)入的。

1.5同源性分析

利用EditSeq尋找已測序樣品的ORF，利用NCBI Blast功能在GenBank中查找下載其他物種同源蛋白的氨基酸序列(http: //blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi)，利用ClustalX 2.0 進(jìn)行同源性分析。

2結(jié)果

2.1大鼠gal-3 ORF克隆及其多樣性分析

從1號個體三個獨立實驗中分別克隆31、36和51個gal-3 ORF克隆 (表1)，即從1號個體共計克隆118個gal-3 ORF。從2號和3號個體分別獲得95和120個gal-3 ORF克隆 (表1)。將所有序列進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)1處缺失 (△301-321 bp) 和5處SNP 18(A-G)、43(T-C)、356 (T-A)、441 (A-G) 和488(A-G) (表1)。與大鼠結(jié)構(gòu)基因?qū)Ρ确治霭l(fā)現(xiàn)，SNP 18(A-G)發(fā)生于第2外顯子3′末端，SNP 48(T-C) 和356(T-A) 以及△301-321 bp 位于第3外顯子內(nèi)部，SNP 441 (A-G) 和488(A-G)分別位于第4、第5外顯子內(nèi)部 (見圖1)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，本文共計克隆17個不同的大鼠gal-3 ORF (見表2，CL1-17)。其中9個克隆 (CL1, 2, 3, 7, 8, 9, 12, 16, 17) 重復(fù)出現(xiàn)于2個或更多獨立的實驗中，CL1出現(xiàn)于所有獨立實驗(見表3)，并與GenBank已注冊大鼠gal-3 cDNA (Accession number: FQ220174)的ORF完全相同 (見圖2)，CL16在1號和3號個體的所有實驗中均有出現(xiàn)(見表3)。從1號和3號個體分別獲得11和14個不同的克隆，2號個體中由于沒有發(fā)現(xiàn)缺失和SNP，因此僅有1個克隆(見表3)。盡管個體間存在一定的差異，但是這些實驗結(jié)果仍然揭示大鼠肝臟gal-3 cDNA個體水平的分子多樣性。

表1　大鼠 gal-3ORF的缺失及單核苷酸多態(tài)性

注:*: 示該SNP 導(dǎo)致同義突變; **: 示該SNP 導(dǎo)致錯義突變; bp: 堿基對; A, T, C, G: 代表4種脫氧核糖核苷酸; △: 缺失; -, +: 分別代表缺失的有無。

Notes:*:Show the SNP resulting in synonymous mutation; **: Missence mutation,respectively；bp:Base pair; A,T,C,G:Represent 4 kinds of deoxynucleotides; △: Deletion;-,+:Indicate no deletion or the existence of deletion,respectively.

圖1　大鼠LGALS3基因及肝臟SNP在ORF中的位置及兩者的對應(yīng)關(guān)系

注：長方形: 外顯子; 線段: 內(nèi)含子; 羅馬數(shù)字: 外顯子序號; bp, kb: 堿基對, 千堿基對;△: 缺失；正常數(shù)字：外顯子和內(nèi)含子的長度；加粗?jǐn)?shù)字：示缺失或SNP的位置。

Notes: Rectangle: Exon; Line: Intron; Roman numerals: Serial number of exon;bp,kb:Base pair and kilobase pair. △: Deletion; Number in regular: Length of exon and intron; Bold number: Deletion or the location of SNP.

表2　大鼠不同gal-3ORF克隆在不同實驗中的出現(xiàn)情況

表3　不同克隆在不同實驗組中的出現(xiàn)頻次

2.2大鼠GenBank注冊gal-3 ORF分析

為簡化數(shù)據(jù)分析的復(fù)雜性，作者從GenBank注冊的大鼠gal-3 cDNA序列中，首先選擇了無插入和缺失的具有完整ORF(789 bp)的所有序列，共計13個(見材料與方法1.2)。其次，在序列分析過程中，針對其ORF 進(jìn)行了比較。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)1個SNP：786 (C-T)，與本實驗中發(fā)現(xiàn)的5個SNP均不同，位于第6外顯子內(nèi)部(見圖1)，將13個cDNA分為兩組。第一組包括5個克隆，其ORF與本文報告的CL1完全相同，第二組包括8個克隆，在本實驗中尚未發(fā)現(xiàn)。

2.3大鼠Gal-3 氨基酸變化位點分析

上述18個不同的gal-3 ORF (2個源自GenBank，16個為本文新發(fā)現(xiàn)) 實際編碼9個不同多肽鏈，表明cDNA分子多樣性導(dǎo)致其編碼蛋白的多樣性。多肽鏈之間產(chǎn)生差異的原因有兩個：一是21 bp的缺失使17個不同的多肽鏈分為兩組，即789 bp的長型ORF (long type，L type) 和768 bp的短型ORF (short type，S type)，分別編碼由262和255個氨基酸殘基組成的大鼠Gal-3；二是6處SNP (1個源自GenBank，5個源自本實驗)中，18(A-G)、43(T-C) 和786 (C-T)三處SNP為同義突變，356(T-A)、 441 (A-G) 和488(A-G) 三處為錯義突變(見表1)，導(dǎo)致其對應(yīng)編碼氨基酸的改變(見圖3)。結(jié)果CL1和12編碼相同的肽鏈，CL2、11和13，CL3和14，CL5和15，CL8、10和16，CL7和17分別編碼相同肽鏈，CL4、6和9各自編碼不同的肽鏈。但是，這些氨基酸的變化并沒有發(fā)生在磷酸化位點、糖基結(jié)合位點以及與Gal-3生物學(xué)功能關(guān)系密切的兩個保守基序上(見圖3)，暗示氨基酸的替換或減少并沒有改變Gal-3與β-半乳糖苷結(jié)合的生物學(xué)特征。

圖2　大鼠gal-3 ORF多序列比對

注：·: 與第一行的相應(yīng)堿基相同; 實線矩形：堿基缺失; 虛線矩形: SNP。

Notes: ·: The same as that in the reference sequence;Line enclosed rectandle:Deletion;Dot line enclosed rectangle:SNP.

圖3　大鼠幾種Gal-3變異體的氨基酸序列比對分析

注: ·: 與第一行的氨基酸相同; - : 缺少相對應(yīng)的氨基酸;_:β-半乳糖苷結(jié)合位點；* : 磷酸化位點; 實線矩形: SNP導(dǎo)致對應(yīng)氨基酸的改變; 虛線矩形: 識別β-半乳糖苷的重要基序。

Notes:·: The same as that in the reference sequence; -:Absence of the corresponding amino acid; _:β-galactoside binding site; * : Phosphorelation site; Line enclosed rectangle:Amino acid subsititution due to SNP;Dot line enclosed rectangle:Important motif for β-galactoside binding.

2.4大鼠Gal-3 氨基酸序列同源性分析

為分析大鼠Gal-3 氨基酸序列同源性，選擇CL1和CL8的編碼蛋白分別作為L type和S type代表，與其他動物Gal-3進(jìn)行了同源性分析(見圖4)。L type 與五種哺乳動物小鼠Musmusculus(EDL20744)、豬Susscrofa(NP_001090970.1)、人Homosapiens(AAA88086)、蘇門答臘星星Pongoabelii(XP_002824813)和兔Oryctolaguscuniculus(NP_001075807.1)的同源性分別為87%、81%、80%、80%和74%。與家雞Gallusgallus(ABO25859) 、家鴿Columbalivia(EMC80882)、鴨Anasplatyrhynchos(XP_005029449), 熱帶爪蟾Xenopus(Silurana)tropicalis(NP_988986)以及斑馬魚Daniorerio(AAR84191)的同源性介于46%~64%。S type比L type的同源性略高，如與小鼠的同源性為88%，與豬的同源性為84%等。

注: - : 缺少相對應(yīng)的氨基酸; _:β-半乳糖苷結(jié)合位點；* : 磷酸化位點; 實線矩形: 因△301-321 導(dǎo)致S type Gal-3缺少的7個氨基酸在其它動物的Gal-3中亦不存在; 虛線矩形: 識別半乳糖苷的重要基序。

Notes:-： Absence of the corresponding amino acid;_:β-galactoside binding site; * : Phosphorelation site; Line enclosed rectangle：Seven amino acid missing due to △301-321; Dot line enclosed rectangle:Important motif for β-galactoside binding.

3討論

本文從3只大鼠肝臟第一鏈cDNA，9個獨立的克隆實驗中共計得到333個gal-3 ORF克隆(見表1)，除去重復(fù)出現(xiàn)的克隆后，發(fā)現(xiàn)17個不同的大鼠gal-3 ORF(見表2)。在1號和3號個體中分別出現(xiàn)11和14個不同的克隆(見表2)，表明大鼠中確實存在個體水平的gal-3 ORF分子多樣性。

那么這種多樣性是客觀存在還是人為因素導(dǎo)致的呢？如果是客觀存在，又如何解釋該現(xiàn)象呢？

在進(jìn)行cDNA克隆的實驗中，如在反轉(zhuǎn)錄、PCR以及DNA測序過程中均有可能人為導(dǎo)入一些堿基的變化。為了排除這些因素的干擾，本實驗使用了3只不同的大鼠個體的肝臟第一鏈cDNA，針對每一個體實施3組獨立的PCR及其克隆。在分析數(shù)據(jù)的過程中，嚴(yán)格確認(rèn)重復(fù)出現(xiàn)于2個或更多獨立實驗中的堿基變化，最后確定本次實驗新發(fā)現(xiàn)1處缺失和5處SNP。因此，盡管有些克隆僅出現(xiàn)一次，基于這些缺失和SNP而克隆的17個不同的大鼠gal-3 ORF應(yīng)該是客觀存在的。另外，S type ORF缺失21 bp，其編碼蛋白比L type ORF編碼蛋白少7個氨基酸殘基，同源性比對分析揭示其它動物的Gal-3中不存在與此對應(yīng)的7個氨基酸(見圖4中矩形框)，支持大鼠S type ORF的客觀存在。

對于cDNA多樣性的原因至少需要分析以下幾點。(1)物種的染色體倍數(shù)；(2)多拷貝基因；(3)RNA選擇性剪切(RNA alternative splicing)；(4)RNA編輯(RNA editing)；(5)人為因素。目前，關(guān)于大鼠為二倍體以及Gal-3編碼基因LAGAL3為單拷貝基因不存在任何爭議。本文對新發(fā)現(xiàn)的1處缺失和5處SNP進(jìn)行的結(jié)構(gòu)基因上的定位分析(見圖1)難以得出大鼠gal-3 ORF多樣性與RNA選擇性剪切有關(guān)。那么會不會與RNA編輯有關(guān)呢？

RNA編輯是mRNA前體的一種加工方式，通過脫氨基作用使腺嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)榇吸S嘌呤(A-I)或者使胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?C-U)，導(dǎo)致mRNA與染色體上的編碼基因不匹配[2,12]。上述的6處SNP中，除了356(A-T)為顛換以外，其他5處SNP均為轉(zhuǎn)換，表明這5處的SNP很可能由RNA編輯造成。實際上，在α-銀環(huán)蛇毒素(α-bungarotoxin，α-BGT)的研究中，個體水平上的cDNA多樣性早有報道，可是對其多樣性產(chǎn)生的原因仍存在爭議，有學(xué)者認(rèn)為與RNA編輯有關(guān)，有學(xué)者則完全否定RNA編輯[13-15]。但是大鼠肝臟gal-3 ORF中的356(A-T)以及21 bp (301-321)的缺失目前尚無理論可以對其進(jìn)行合理的解釋。目前采用基因組和轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進(jìn)行比對分析的報道越來越多，發(fā)現(xiàn)大量的RNA序列與基因組DNA不匹配，被稱為RDD (RNA-DNA differences)，難以用現(xiàn)有的理論包括RNA編輯的機制進(jìn)行解釋，因此有學(xué)者認(rèn)為生物體內(nèi)很可能存在未知的尚未發(fā)現(xiàn)的調(diào)控RNA多樣性的機制[1]。大鼠的gal-3 cDNA的多樣性產(chǎn)生的機制可能包括RNA編輯及尚未發(fā)現(xiàn)的調(diào)控機制，有待于今后更加深入細(xì)致的研究。至于大鼠gal-3 cDNA的多樣性的生物學(xué)意義，很可能與Gal-3作為多功能蛋白在生物體內(nèi)廣泛行使功能的性質(zhì)有關(guān)。雖然目前得此結(jié)論為時尚早，但是，基因的多樣性總體上是生物進(jìn)化的特征，有利于基因的表達(dá)調(diào)控及其生物學(xué)功能的實現(xiàn)。

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