玻璃質(zhì)殼類底棲有孔蟲卷轉(zhuǎn)蟲屬Ammonia spp.的DNA保存方式和提取效能比較研究*

呂 曼 類彥立 李鐵剛

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所海洋生物分類與系統(tǒng)演化實(shí)驗(yàn)室 青島 266071; 2. 國家海洋局第一海洋研究所海洋沉積與環(huán)境地質(zhì)國家海洋局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室海洋地質(zhì)過程與環(huán)境功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266061;3. 中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

有孔蟲(Foraminifera)門隸屬于原生動(dòng)物界, 目前已知化石種約36000種, 現(xiàn)生種約4000—6000種,大部分為海洋底棲種類(Sen Gupta, 1999)。有孔蟲因其殼體可長期保存在海洋水體及沉積物中, 因此在古海洋學(xué)等學(xué)科研究中有重要價(jià)值(汪品先等, 1980,1988)。另外在環(huán)境指示(Eichler et al, 2012)、生態(tài)評(píng)估(Boucheta et al, 2012)以及海洋生態(tài)系統(tǒng)的能量流動(dòng)與物質(zhì)循環(huán)中, 都扮演著重要角色。

現(xiàn)生有孔蟲有鈣質(zhì)玻璃殼、鈣質(zhì)瓷質(zhì)殼、砂質(zhì)殼(膠結(jié)殼)和無殼(蛋白質(zhì)膜)等多種類型。其中玻璃質(zhì)類底棲有孔蟲 Ammonia(Brünnich, 1772)是中國近海重要的優(yōu)勢類群, 常以優(yōu)勢種出現(xiàn), 在中國各海域均見報(bào)道(汪品先等, 1980; 成鑫榮, 1987; 李保華等,2008; 趙泉鴻等, 2009; 李小艷等, 2010; 類彥立等,2015)。這類有孔蟲常被用來指示濱岸和低鹽等海洋環(huán)境, 具有重要的生態(tài)價(jià)值(郝詒純等, 1980; 汪品先等, 1980)。

Ammonia是最早被確定為有孔蟲的一個(gè)屬, 其種類之多、形態(tài)變異之大使得這類有孔蟲的分類鑒定尤為困難和混亂(Holzmann et al, 2000; Hayward et al,2004), 同樣的困難也存在于其他類群的有孔蟲。而分子技術(shù)的應(yīng)用為解決這一難題提供了新的思路(Pawlowski et al, 2010, 2014, 2013)。有孔蟲分子生物學(xué)研究已經(jīng)有較長的歷史(Langer et al, 1993), 對(duì)于Ammonia屬的分子鑒定多基于對(duì)編碼核糖體RNA基因的序列分析, 這方面的工作在國外已經(jīng)有很多報(bào)道(Pawlowski et al, 1994b, 1995; Hayward et al, 2004),而國內(nèi)的開展尚未普及(徐美香等, 2004; 李保華等,2005, 2007): 技術(shù)應(yīng)用的不成熟、相關(guān)數(shù)據(jù)庫信息量太少等都是其限制因素。

眾所周知, 有孔蟲很難在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)并且繁殖,而且野外采樣也受到時(shí)間和空間的限制。因此, 如何有效保存有孔蟲的 DNA以用于后續(xù)研究, 是有孔蟲分子生物學(xué)研究能夠廣泛開展的前提。海洋生物常用的保存方式有冷凍、乙醇固定及福爾馬林固定等。但有研究指出后兩種化學(xué)固定方法并不適用于有孔蟲(Holzmann et al, 1996)。

本工作通過參考前人研究結(jié)果(徐美香等, 2004;李保華等, 2005, 2007; Pawlowski et al, 1994b, 1995;),最終選出3種保存方法, 即烘干法、冷凍法和裂解液法, 進(jìn)行了更為系統(tǒng)的有孔蟲 DNA保存方法的實(shí)驗(yàn)研究。另外, 由于不同殼質(zhì)類型的有孔蟲所適用的DNA提取方法不盡相同(Pawlowski, 2000)。本實(shí)驗(yàn)還比較了 DOC裂解液法和 Guanidine裂解液法對(duì)Ammonia屬DNA提取效能的不同, 以期篩選出最適合玻璃質(zhì)殼類底棲有孔蟲的 DNA保存和提取方法,提供適合野外采集及實(shí)驗(yàn)室等不同環(huán)境下的最優(yōu)方案。進(jìn)而為分子生物學(xué)在這類有孔蟲研究中的應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 活體有孔蟲材料準(zhǔn)備 實(shí)驗(yàn)所用的有孔蟲材料是2014年2月份采自青島灣潮間帶的底棲優(yōu)勢類群, 卷轉(zhuǎn)蟲屬 Ammonia spp. 經(jīng)形態(tài)鑒定, 主要為Ammonia aomoriensis (Asano, 1951)與 Ammonia beccarii(Linnaeus, 1758)的混合種。把沉積物樣品置于14°C左右的培養(yǎng)箱中孵化 2天, 挑選爬到沉積物表面、殼體完整、大小均一、房室呈棕黃色、體表黏附有顆粒物的 Ammonia spp., 這樣的有孔蟲活性較好(Holzmann et al, 1996; Schweizer et al, 2005)。放到盛有過濾海水的培養(yǎng)皿中, 投喂硅藻, 在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng) 1周。將有孔蟲小心轉(zhuǎn)移到滅菌過濾海水中, 在體視顯微鏡下, 用毛筆仔細(xì)清洗殼體表面的雜質(zhì), 準(zhǔn)備進(jìn)行DNA提取和保存實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 試劑準(zhǔn)備 DOC裂解液(0.1mol/LTris-HCl pH8.5, 4mmol/L EDTA pH8.0, 1%DOC, 0.2%TX-100);Guanidine裂解液(4mol/L Guanidinium isothiocyanate,0.05mol/L Tris-HCl pH7.6, 0.01mol/L EDTA,0.068mol/L Sarkosyl=N-Lauroylsarcosine sodium salt,1%β-巰基乙醇)(Pawlowski, 2000); 異丙醇; 70%乙醇;1×TE Buffer; 瓊脂糖; TAE 電泳緩沖液; 2×PCR Mix(TIANGEN Golden Easy PCR System); ddH2O;PCR引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.1.3 儀器準(zhǔn)備 PCR儀; 凝膠成像分析系統(tǒng);電泳儀; 干燥箱; 高速冷凍離心機(jī); –20°C、–80°C 冰箱; 恒溫水浴鍋。

1.2 DNA提取方法

采用DOC裂解液和Guanidine裂解液兩種處理方法提取Ammonia DNA, DOC裂解液法設(shè)置2個(gè)平行組, Guanidine裂解液法設(shè)置3個(gè)平行組, 每個(gè)平行組均為單個(gè)樣本。實(shí)驗(yàn)操作如下:

1.2.1 DOC裂解液法 取一只清洗過的Ammonia實(shí)驗(yàn)樣品放置在含50μL DOC裂解液的1.5mL無菌離心管中, 研磨使殼破碎。于60°C水浴孵化1h。10000 r/min離心5min, 去除不溶物。所得即為基因組DNA,于 –20°C 保 存 (Holzmann et al, 1996; Pawlowski,2000)。

1.2.2 Guanidine裂解液法 取一只清洗過的Ammonia實(shí)驗(yàn)樣品放置在含 50μL Guanidine裂解液的 1.5mL無菌離心管中, 研磨使殼破碎。60°C加熱15min, 或室溫過夜。8000 r/min離心 1min, 取上清液。加入與第一步中Guanidine裂解液等量的異丙醇,混勻。在–20°C沉淀至少2h, 或過夜。最大轉(zhuǎn)速離心15min, 移去上清液, 注意不要擾動(dòng)沉淀。用 100μL 70%乙醇洗滌沉淀物, 最大轉(zhuǎn)速離心1min, 移去上清液。將沉淀物真空干燥5—10min, 或者室溫下干燥更長時(shí)間。用15—20μL 1×TE Buffer溶解沉淀物, 在4°C放置至少1h, 或過夜, 期間取出渦旋數(shù)次。所得即為基因組 DNA, 于–20°C 保存(Pawlowski, 2000)。

1.3 DNA保存方法

對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品分別進(jìn)行烘干、冷凍和裂解液保存等3種方法處理。鑒于預(yù)實(shí)驗(yàn)以及 Holzmann等(1996)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 加之實(shí)驗(yàn)樣品數(shù)量限制, 為了最大限度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究, 進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì): 烘干法共 11個(gè)處理組, 未設(shè)平行組; 冷凍法共 4個(gè)處理組, 每個(gè)處理設(shè)2個(gè)平行組; 裂解液法共6個(gè)處理組, 每個(gè)處理設(shè)2個(gè)平行組。采用1.2.1中介紹的DOC法提取DNA。具體操作如下:

1.3.1 烘干保存法 取清洗好的 Ammonia實(shí)驗(yàn)樣品放置在 1.5mL無菌離心管中, 每管一只。分別在溫度為 20、30、40、50、60、70、80、90、100、110和 120°C烘干 30min, 每個(gè)溫度組烘干 11只。每個(gè)溫度組各取一只, 立即提取 DNA。其余的在室溫下保存, 之后每周取每個(gè)溫度組的一個(gè)樣本提取DNA, 連續(xù)進(jìn)行10周實(shí)驗(yàn)。每次實(shí)驗(yàn)均取一只活的Ammonia提取DNA作為陽性對(duì)照, 另用無菌水做空白對(duì)照。

1.3.2 冷凍保存法 取清洗好的 Ammonia實(shí)驗(yàn)樣品放置在1.5mL無菌離心管中, 每管一只。設(shè)以下4個(gè)冷凍組: 在無水和 50μL無菌過濾海水中分別在–20°C和–80°C下冷凍。之后每周對(duì)每個(gè)冷凍組提取DNA, 連續(xù)進(jìn)行8周實(shí)驗(yàn), 提取前需要解凍并排出海水。設(shè)置陽性和空白對(duì)照。

1.3.3 裂解液保存法 為比較裂解液中是否含有EDTA對(duì)于Ammonia DNA保存效果的差異, 進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。取清洗好的Ammonia實(shí)驗(yàn)樣品放置在1.5mL無菌離心管中, 每管一只。設(shè)以下6個(gè)實(shí)驗(yàn)組: 分別在2種裂解液(含4mmol/L EDTA的DOC以及不含EDTA 的 DOC)、3 種溫度(室溫、4°C、–20°C)下對(duì)樣品進(jìn)行保存實(shí)驗(yàn)。之后每周對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組提取DNA,連續(xù)進(jìn)行8周實(shí)驗(yàn)。設(shè)置陽性和空白對(duì)照。

1.4 DNA檢測方法

基于核糖體 RNA(rRNA)基因大亞基(large subunit, LSU)片段的序列分析在 Ammonia屬種類鑒定等方面的研究中已經(jīng)有很好的應(yīng)用(Pawlowski et al, 1994a, 1995; Holzmann et al, 1996, 2000; Schweizer et al, 2011)。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用 PCR技術(shù), 對(duì)所有實(shí)驗(yàn)組提取的DNA, 擴(kuò)增其 LSU rRNA基因片段(大約 750bp), 取4μL擴(kuò)增產(chǎn)物, 經(jīng) 1.0%瓊脂糖凝膠(TAE緩沖液,110V)電泳 20min、EB染色 10min, 然后用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照。通過分析電泳條帶質(zhì)量判斷所提取的DNA質(zhì)量。DNA提取方法組的比較, 是直接觀察電泳圖條帶的質(zhì)量并結(jié)合后期測序結(jié)果; DNA保存方法組的比較, 是在獲得電泳圖之后, 用 ImageJ軟件對(duì)電泳圖中目的條帶的亮度進(jìn)行定量分析, 用“灰度值”表示定量分析的結(jié)果, PCR條帶的亮度或者灰度值可用于間接反映DNA保存的質(zhì)量(宋鋒等, 2010)。

PCR 引物: 正向 2TA(5′CACATCAGCTCGAGT GAG3′), 反向 L1F(5′ACTCTCTCTTTCACTCC3′)。反應(yīng)體系: 25μL (2×PCR Mix 12.5μL, 10μmol/L 的正反向引物各 0.5μL, DNA 模板 2μL, ddH2O 9.5μL)。反應(yīng)條件: 95°C 預(yù)變性 60s; 94°C 變性 30s、52°C 退火 30s、72°C延伸90s, 共34個(gè)循環(huán); 72°C延伸3min。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)電泳條帶的亮度量化后, 用 SPSS19.0軟件包中有關(guān)的方差分析做數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析, 采用LSD檢驗(yàn)。比較Ammonia DNA的保存效果在不同處理方法、不同保存時(shí)間組之間的差異。

2 結(jié)果與結(jié)論

2.1 DNA提取方法比較

由圖1可以看出, 經(jīng)DOC 裂解液法和Guanidine裂解液法提取到的DNA, 在PCR擴(kuò)增之后都能得到整齊、單一、明亮的、與目標(biāo)條帶大小一致的條帶, 且后續(xù)測序結(jié)果證實(shí)是目標(biāo)條帶。證明這兩種方法所提取的Ammonia屬有孔蟲DNA的濃度和純度都能滿足后續(xù)PCR的需求。但是DOC裂解液法比Guanidine法操作更簡單, 試劑更便宜, 所以前者更適合Ammonia屬有孔蟲DNA的提取。

圖1 兩種DNA提取方法的PCR擴(kuò)增電泳圖譜Fig.1 Gel electrophoreses of PCR products obtained from two methods of DNA extraction

2.2 DNA保存方法比較

2.2.1 烘干保存法 經(jīng) ImageJ軟件分析各組的PCR條帶所得灰度值見表1。用SPSS19.0做單因素方差分析, 采用LSD檢驗(yàn)。結(jié)果顯示20°C組和30°C顯著高于40°C組(P＜0.05), 從均值圖看 20°C組結(jié)果最好, 但未與30°C組產(chǎn)生顯著差異(圖2)。綜合考慮實(shí)驗(yàn)的簡便性和保存結(jié)果的優(yōu)異性, 建議 20°C為最佳烘干溫度。另外, 比較第0、1、2周的結(jié)果發(fā)現(xiàn), 三組間沒有顯著差異(P＞0.05), 表明烘干后立即提取DNA和保存一段時(shí)間之后提取的結(jié)果無顯著差異。到第10周灰度值有顯著下降(P＜0.05), 說明保存時(shí)間超過10周樣品DNA可能會(huì)有顯著降解。

表1 烘干保存各實(shí)驗(yàn)組PCR條帶的灰度值Tab.1 The gray value of PCR products amplified from samples preserved in air-dry method

圖2 烘干保存法的PCR擴(kuò)增電泳圖譜Fig.2 Gel electrophoreses of PCR products preserved in air-dry method

2.2.2 冷凍保存法 各組的PCR條帶灰度值見表2(以均值表示)。用SPSS19.0作3因素單變量方差分析, 不同時(shí)間組采用LSD檢驗(yàn)。結(jié)果顯示–80°C組均值高于–20°C組, 但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)上的顯著水平(P＞0.05)。無水組結(jié)果顯著好于有水組(P＜0.05)。不同保存時(shí)間之間沒有顯著差異, 直到第8周, 各組依然有較好的結(jié)果(圖 3)。因此, 采用–20°C 或–80°C 無水條件對(duì)Ammonia屬有孔蟲進(jìn)行冷凍處理, 至少 8周以內(nèi)其DNA都有較好的保存效果。

2.2.3 裂解液保存法 各組的 PCR條帶灰度值見表 2(以均值表示)。統(tǒng)計(jì)分析方法與“冷凍保存組”相同。均值比較結(jié)果顯示4°C組效果比室溫和–20°C組好, 含EDTA組比不含EDTA組效果好, 但都沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)上的顯著水平(P＞0.05)。不同保存時(shí)間之間沒有顯著差異, 直到第8周, 各處理組依然有較好的結(jié)果(圖 4)。因此, 若采用 DOC裂解液保存Ammonia屬有孔蟲的DNA, 建議選擇4°C含EDTA的裂解液,至少8周以內(nèi)對(duì)DNA都有較好的保存效果。

2.2.4 三種方法總體比較 分別選取烘干法、冷凍法和裂解液法中保存效果最好的組, 比較它們之間的差異。烘干法選取 20°C, 1—8周組; 冷凍法選取–80°C無水, 1—8周組; 裂解液法選取4°C含EDTA,1—8周組。結(jié)果顯示組間有顯著差異: 冷凍法優(yōu)于烘干法, 烘干法優(yōu)于裂解液法(P＜0.05)。因此, 最適合鈣質(zhì)玻璃殼底棲有孔蟲的 DNA保存方法為–80°C無水條件下冷凍; 若–80°C 冷凍條件不可得, 可用–20°C冷凍代替, 但對(duì)樣品的有效保存時(shí)間可能不如–80°C條件下長。

表2 冷凍保存及裂解液保存各實(shí)驗(yàn)組PCR條帶的灰度值Tab.2 The gray value of PCR products amplified from samples preserved in freezing and lysis buffer method

圖3 冷凍保存8周的PCR擴(kuò)增電泳圖譜Fig.3 Gel electrophoreses of PCR products preserved in freezing method for 8 weeks

圖4 裂解液保存8周的PCR擴(kuò)增電泳圖譜Fig.4 Gel electrophoreses of PCR products preserved in lysis buffer for 8 weeks

3 討論

玻璃質(zhì)類底棲有孔蟲是我國近海最常見的優(yōu)勢有孔蟲類群之一, 在潮間帶該類群可占整體有孔蟲群落的30%—70%, 其群落結(jié)構(gòu)有重要的生態(tài)指示意義(Murry, 1991; 李保華等, 2008; 李小艷等, 2010)。對(duì)有孔蟲準(zhǔn)確的分類鑒定是研究其群落結(jié)構(gòu)的前提;尤其是對(duì)Ammonia屬為代表的玻璃質(zhì)有孔蟲, 形態(tài)鑒定較為混亂(類彥立等, 2015), 分子鑒定手段的應(yīng)用對(duì)彌補(bǔ)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類的不足具有重要作用(Pawlowskiet al, 1994b, 1995)。然而國內(nèi)在現(xiàn)生有孔蟲分子生物學(xué)方面的研究還幾乎處于空白期。工作的一大難點(diǎn)在于分子技術(shù)的應(yīng)用, 例如DNA提取方面,由于經(jīng)常有微生物與有孔蟲共生等原因?qū)е潞茈y獲得純的有孔蟲DNA(Holzmannet al, 1996; Pawlowski,2000)。加之作為單細(xì)胞原生動(dòng)物, 有孔蟲DNA拷貝量比起其他多細(xì)胞動(dòng)物要小得多, 使用單個(gè)樣本提取出滿足PCR要求的基因組DNA困難較大; 而對(duì)多樣本提取 DNA時(shí)很難保證所有樣本是同一個(gè)種, 尤其對(duì)于像Ammonia這樣的形態(tài)鑒定疑難類群。研究中常常需要在對(duì)樣品提取DNA的同時(shí), 借助SEM等技術(shù)進(jìn)行形態(tài)鑒定。因此, 干燥之后的樣品還能穩(wěn)定提取 DNA, 并且滿足后續(xù) PCR擴(kuò)增, 對(duì)于有孔蟲分子生物學(xué)研究非常重要。另外, 某些有孔蟲類群的rRNA基因有高度的細(xì)胞內(nèi)變異, 給 DNA測序工作帶來了一定的困難(Pawlowski, 2000)。

對(duì)有孔蟲 DNA進(jìn)行有效保存是進(jìn)行后續(xù)分子鑒定的前提。Holzmann等(1996)對(duì)Ammonia的DNA保存方法進(jìn)行了一些研究, 但除了 30°C干燥保存外, 其余方法所探索的保存時(shí)間都不超過5周。國內(nèi)未見有專門研究有孔蟲 DNA保存方法的報(bào)道。本研究進(jìn)行了更多的保存方法以及更長的保存周期(8至 10周)的實(shí)驗(yàn)探索, 各種方法各有優(yōu)缺點(diǎn),以期滿足不同保存時(shí)間以及不同條件下(如野外或?qū)嶒?yàn)室等)的需求。

有孔蟲基因結(jié)構(gòu)的一些獨(dú)特之處, 例如 SSU rRNA和LSU rRNA基因序列不僅擁有不同尋常的長度, 而且存在很大的種內(nèi)變異(Pawlowski, 2000), 使得一些種類的核糖體基因很難成功擴(kuò)增。另外個(gè)體大小、蟲體活性、有殼等因素都限制了有孔蟲DNA提取的成功率。因此, 即使是對(duì)新鮮樣品直接提取DNA,也不一定能夠成功進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。這也可能是導(dǎo)致相同實(shí)驗(yàn)條件下結(jié)果相差很大的原因(例如圖3中4、5號(hào)條帶以及圖4中2、3號(hào)條帶)。

由于本實(shí)驗(yàn)中使用了2TA-L1F和2TA-L7兩對(duì)引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增(Schweizer et al, 2011), DOC裂解液法提取DNA后PCR結(jié)果出現(xiàn)雙帶(如圖1a中1、2號(hào)條帶所示)。有研究顯示Ammonia屬LSU rRNA基因的擴(kuò)增可能不需要巢式 PCR(Holzmann et al,1996)。本研究通過對(duì)擴(kuò)增出的雙帶進(jìn)行測序, 表明它們分別是引物2TA-L1F及2TA-L7擴(kuò)增的產(chǎn)物, 從而證實(shí)Ammonia屬LSU rRNA基因的擴(kuò)增不需要巢式PCR。

有報(bào)道指出 EDTA對(duì)有孔蟲的殼有破壞作用(Seears et al, 2014)。在本實(shí)驗(yàn)過程中, 每次提DNA之前均對(duì)樣品鏡檢, 發(fā)現(xiàn)用含 EDTA裂解液保存的Ammonia樣品的殼溶解程度比不含EDTA組的更嚴(yán)重; 在室溫和4°C保存的Ammonia樣品的殼溶解程度比–20°C組的更嚴(yán)重。推測隨著殼的逐漸溶解, 原本由殼保護(hù)著的核物質(zhì)可能會(huì)受到某種影響。為了探索這種影響對(duì)Ammonia DNA保存效果造成的差異, 本實(shí)驗(yàn)分別檢驗(yàn)了含與不含EDTA的裂解液對(duì)于Ammonia DNA的保存效果, 前者效果普遍比后者好。

綜上所述, 本研究以玻璃質(zhì)殼類底棲有孔蟲的代表類群Ammonia spp.為材料, 比較了3種DNA保存方法(烘干、冷凍、DOC裂解液)以及2種DNA提取方法(DOC 裂解液法、Guanidine裂解液法)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明: (1) 烘干保存法中 20°C為最佳烘干溫度,保存時(shí)間超過10周樣品DNA可能會(huì)有顯著降解; 冷凍保存法中–20°C和–80°C冷凍保存直至第8周樣品DNA依然較完好; DOC裂解液保存法中樣品用含EDTA的裂解液在4°C保存效果較好, 至少可以保存8周。(2) 從對(duì)有孔蟲DNA保存效果來看, –80°C無水條件下冷凍效果最佳; 烘干保存法使得有孔蟲形態(tài)鑒定與分子鑒定可以更好地結(jié)合; 裂解液法保存則可以很方便地直接進(jìn)行后續(xù) DNA提取實(shí)驗(yàn), 較適合短期保存。3種保存方法各有優(yōu)缺點(diǎn), 可根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行選擇。(3) DOC裂解液法和 Guanidine裂解液法對(duì)玻璃質(zhì)類有孔蟲 DNA提取效果都很好,但前者更經(jīng)濟(jì)且操作簡便。

4 結(jié)論

玻璃質(zhì)殼類底棲有孔蟲DNA保存和提取優(yōu)化方案如下:

DNA保存:

保存法1——烘干法:

A. 設(shè)備器皿準(zhǔn)備:

干燥箱、1.5mL無菌離心管。

B. 操作步驟:

(1) 取單只實(shí)驗(yàn)樣品, 于無菌過濾海水中洗凈;

(2) 蟲體置于1.5mL無菌離心管中, 于20—30°C干燥30min;

(3) 在提取DNA之前于室溫、密封保存。

保存法2——冷凍法:

A. 設(shè)備器皿準(zhǔn)備:

–20°C冰箱、–80°C超低溫冰箱、1.5mL無菌離心管。

B. 操作步驟:

(1) 取單只實(shí)驗(yàn)樣品, 于無菌過濾海水中洗凈;

(2) 蟲體置于1.5mL無菌離心管中, 密封;

(3) 在提取 DNA 之前于–20°C 或–80°C 冷凍保存。

保存法3——裂解液法:

A. 設(shè)備和試劑準(zhǔn)備:

(1) 設(shè)備器皿: 4°C冷藏箱、1.5mL無菌離心管;

(2) 試劑: DOC裂解液(Pawlowski, 2000)。

組分:

TRIS 1mol/L pH 8.5 100μL

EDTA 0.5mol/L (pH 8.0) 8μL

DOC (Na deoxycholate) 10% 100μL

TX-100 10% 20μL

H2O 780μL

B. 操作步驟:

(1) 取單只實(shí)驗(yàn)樣品, 于無菌過濾海水中洗凈;

(2) 蟲體置于 1.5mL無菌離心管中, 加入含4mmol/L EDTA的DOC裂解液;

(3) 在提取DNA之前于4°C保存。

DNA提取:

A. 設(shè)備和試劑準(zhǔn)備:

(1) 設(shè)備器皿: 水浴鍋、高速離心機(jī)、1.5mL無菌離心管;

(2) 試劑: DOC裂解液, 組分同“保存法3”。

B. 操作步驟:

(1) 取單只實(shí)驗(yàn)樣品, 于無菌過濾海水中洗凈;

(2) 蟲體置于 1.5mL無菌離心管中, 加入 50μL DOC裂解液;

(3) 將蟲體徹底研磨碎, 于60°C水浴孵化1h;

(4) 10000r/min離心5min, 去除不溶物;

(5) 上清液中即為提取的基因組 DNA, 于–20°C保存。

致謝 感謝同濟(jì)大學(xué)海洋與地球科學(xué)學(xué)院的翦知湣教授給予類彥立在有孔蟲研究中的無私建議和指導(dǎo), 另外中國科學(xué)院南京地質(zhì)與古生物研究所李保華研究員曾共同探討, 感謝 Paul Br?nniman Foundation 2015基金以及Prof. Dr. Jan W. Pawlowski(University of Geneva, Switzerland)給予方法學(xué)討論,中國科學(xué)院海洋研究所實(shí)驗(yàn)員王雪皎、鄭萌萌、曹麗娜協(xié)助工作。謹(jǐn)致謝忱。

成鑫榮, 1987. 長江口表層沉積物中活有孔蟲分布的初步研究.海洋地質(zhì)與第四紀(jì)地質(zhì), 7(1): 73—79

李小艷, 石學(xué)法, 程振波等, 2010. 渤海萊州灣表層沉積物中底棲有孔蟲分布特征及其環(huán)境意義. 微體古生物學(xué)報(bào),27(1): 38—44

李保華, Ertan K T, Hemleben C, 2005. 有孔蟲分子生物學(xué)研究進(jìn)展. 自然科學(xué)進(jìn)展, 15(5): 534—538

李保華, 王曉燕, 龍江平, 2008. 海南島近岸沉積物中的有孔蟲特征與分布. 微體古生物學(xué)報(bào), 25(3): 225—234

李保華, 李鐵剛, Ertan K T等, 2007. 西北太平洋浮游有孔蟲的 SSU rDNA序列及其古海洋學(xué)意義. 自然科學(xué)進(jìn)展,17(3): 391—395

汪品先, 章紀(jì)軍, 閔秋寶, 1980. 東海表層沉積物中有孔蟲的分布. 見: 海洋微體古生物論文集. 北京: 海洋出版社,20—38

汪品先, 章紀(jì)軍, 趙泉鴻等, 1988. 東海底質(zhì)中的有孔蟲和介形蟲. 北京: 海洋出版社. 1—307

宋 鋒, 孫 敏, 羅克明, 2010. 一種基于PCR技術(shù)鑒定單拷貝轉(zhuǎn)基因煙草的方法. 中國生物工程雜志, 30(4): 83—88

趙泉鴻, 湣翦知, 張?jiān)谛愕? 2009. 東海陸架泥質(zhì)沉積區(qū)全新世有孔蟲和介形蟲及其古環(huán)境應(yīng)用. 微體古生物學(xué)報(bào),26(2): 117—128

郝詒純, 裘松余, 林甲興等, 1980. 有孔蟲. 北京: 科學(xué)出版社,1—224

類彥立, 李鐵剛, 2015. 奧茅卷轉(zhuǎn)蟲 Ammonia aomoriensis(Asano, 1951)與畢克卷轉(zhuǎn)蟲Ammonia beccarii (Linnaeus,1758) (有孔蟲)的分類學(xué)以及在黃東海分布的溫鹽深特征比較研究. 微體古生物學(xué)報(bào), 32(1): 1—19

徐美香, 趙泉鴻, 肖 湘, 2004. 南海沉積物中有孔蟲分子生物學(xué)鑒定的初步研究. 臺(tái)灣海峽, 23(3): 354—359

Boucheta V M P, Alvea E, Rygg B et al, 2012. Benthic foraminifera provide a promising tool for ecological quality assessment of marine waters. Ecological Indicators, 23:66—75

Eichler P P B, Eichler B B, Gupta B S et al, 2012. Foraminifera as indicators of marine pollutant contamination on the inner continental shelf of southern Brazil. Marine Pollution Bulletin, 64(1): 22—30

Hayward B W, Holzmann M, Grenfell H R et al, 2004.Morphological distinction of molecular types in Ammonia-towards a taxonomic revision of the world’s most commonly misidentified foraminifera. Marine Micropaleontology, 50(3—4): 237—271

Holzmann M, Pawlowski J, 1996. Preservation of foraminifera for DNA extraction and PCR amplification. Journal of Foraminiferal Research, 26(3): 264—267

Holzmann M, Pawlowski J, 2000. Taxonomic relationships in the genus Ammonia (Foraminifera) based on ribosomal DNA sequences. Journal of Micropalaeontology, 19(1): 85—95

Langer M R, Lipps J H, Piller W E, 1993. Molecular paleobiology of protists: Amplification and direct sequencing of foraminiferal DNA. Micropaleontology, 39(1): 63—68

Murry J W, 1991. Ecology and Palaeoecology of Benthic Foraminifera. New York: John Wiley and Sons Inc., 397

Pawlowski J, 2000. Introduction to the molecular systematics of foraminifera. Micropaleontology, 46(S1): 1—12

Pawlowski J, Bolivar I, Fahrni J et al, 1994b. Taxonomic identification of foraminifera using ribosomal DNA sequences. Micropaleontology, 40(4): 373—377

Pawlowski J, Bolivar I, Farhni J et al, 1995. DNA analysis of“Ammonia beccarii” morphotypes: one or more species?.Marine Micropaleontology, 26(1—4): 171—178

Pawlowski J, Bolivar I, Guiard-Maffia J et al, 1994a.Phylogenetic Position of foraminifera inferred from LSU rRNA gene sequences. Molecular Biology and Evolution,11(6): 929—938

Pawlowski J, Holzmann M, 2014. A plea for DNA barcoding of foraminifera. The Journal of Foraminiferal Research, 44(1):62—67

Pawlowski J, Holzmann M, Tyszka J, 2013. New supraordinal classification of Foraminifera: molecules meet morphology.Marine Micropaleontology, 100: 1—10

Pawlowski J, Lecroq B, 2010. Short rDNA barcodes for species identification in foraminifera. The Journal of Eukaryotic Microbiology, 57(2): 197—205

Schweizer M, Pawlowski J, Duijnstee I A P et al, 2005.Molecular phylogeny of the foraminiferal genus Uvigerina based on ribosomal DNA sequences. Marine Micropaleontology, 57(3—4): 51—67

Schweizer M, Polovodova I, Nikulina A et al, 2011. Molecular identification of Ammonia and Elphidium species(Foraminifera, Rotaliida) from the Kiel Fjord (SW Baltic Sea) with rDNA sequences. Helgoland Marine Research,65(1): 1—10

Seears H A, Wade C M, 2014. Extracting DNA from within intact foraminiferal shells. Marine Micropaleontology, 109:46—53

Sen Gupta B K, 1999. Modern Foraminifera. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1—371