試論五味子木脂素對發(fā)生氧化損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用

唐莉麗 高 濱 鄭云恒

臨床研究發(fā)現(xiàn)，冠心病患者在發(fā)病的中、晚期，其心臟會發(fā)生血液灌注，這種情況會使其心肌細(xì)胞發(fā)生氧化損傷，進(jìn)而可使其心肌細(xì)胞的功能明顯減弱，從而引起心力衰竭和心肌梗死，危及其生命安全[1]。因此，如何保護(hù)發(fā)生氧化損傷的心肌細(xì)胞、促進(jìn)其功能的恢復(fù)是治療冠心病的關(guān)鍵。近年來的臨床研究發(fā)現(xiàn)，五味子木脂素對發(fā)生氧化損傷的心肌細(xì)胞具有很強(qiáng)的保護(hù)作用[2]。為了進(jìn)一步研究五味子木脂素對發(fā)生氧化損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，我們進(jìn)行了本次研究?，F(xiàn)將研究結(jié)果報告如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本次實驗使用的動物為10只SD乳鼠（雌雄不限）。這10只乳鼠均由長春高新區(qū)醫(yī)學(xué)動物實驗研究中心提供，其出生時間均在3天以內(nèi)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗用的試劑、藥品和儀器 本次實驗使用的試劑、藥品和儀器包括超氧化物歧化酶試劑盒、丙二醛試劑盒、乳酸脫氫酶試劑盒（這三種試劑盒均由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)）、DMEM培養(yǎng)基（由北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）、五味子木脂素（由北華大學(xué)林學(xué)院提供）、電子分析天平（由北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司生產(chǎn)）、超凈工作臺（由蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)）、高速低溫離心機(jī)（由長沙易達(dá)儀器有限公司生產(chǎn)）、680型全自動酶標(biāo)儀（由美國BIO-RAD公司生產(chǎn)）、倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)（由麥克奧迪有限公司生產(chǎn)）。

1.2.2 心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法 該培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行。

1.2.3 對用不同濃度H2O2處理的發(fā)生氧化損傷的心肌細(xì)胞進(jìn)行研究

1.2.3.1 實驗分組 ①對照組：對該組模型進(jìn)行正常培養(yǎng)。②H2O2Ⅰ組：在進(jìn)行心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，使用H2O2對該組模型進(jìn)行預(yù)處理，使其心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)液的濃度達(dá)到200μmol/L。③H2O2Ⅱ組：使用②中的方法將該組模型心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)液的濃度調(diào)節(jié)至400μmol/L。④H2O2Ⅲ組：使用②中的方法將該組模型心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)液的濃度調(diào)節(jié)至600μmol/L 。

1.2.3.2 實驗方法 用MTT比色法測定心肌細(xì)胞的活力，具體的方法是：①吸取細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)的上清液，用PBS對其清洗2次。②在每個培養(yǎng)孔內(nèi)加入無血清的DMEM培養(yǎng)液 200μl和 MTT溶液 (5mg/ml)20μl，在 37℃的環(huán) 境中進(jìn)行孵育4h。③棄去孔內(nèi)的培養(yǎng)液，在每個培養(yǎng)孔加入150μl的DMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。④在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各培養(yǎng)孔的吸光度OD490值（選擇的波長為490nm，），然后分別于H2O2發(fā)生作用后的lh、3h、6h、12h和18h再次測定其吸光度OD490值。⑤取五味子木脂素50g，向其中加入數(shù)滴細(xì)胞培養(yǎng)液，用高壓乳勻儀對其進(jìn)行處理，制成SCL乳劑。

1.2.4 進(jìn)行對心肌細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用量效關(guān)系的實驗

1.2.4.1 實驗分組 ①對照組：對該組模型進(jìn)行正常培養(yǎng)。②H2O2組：在進(jìn)行心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，使用H2O2對該組模型進(jìn)行預(yù)處理，使其心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)液的濃度達(dá)到400μmol/L。③SCLⅠ組：使用SCL對該組模型進(jìn)行預(yù)處理，使其心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)液的濃度達(dá)到2.5×10-5g/L，④SCLⅡ組：使用③中的方法將該組模型心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)液的濃度調(diào)節(jié)至5×10-5g/L。⑤SCLⅢ組：使用③中的方法將該組模型心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)液的濃度調(diào)節(jié)至1×10-4g/L。

1.2.4.2 實驗方法 按照1.2.3.2中的方法分別于H2O2發(fā)生作用后的lh、3h、6h、12h、18h測定各組模型的吸光度OD490值。

1.2.5 進(jìn)行發(fā)生氧化損傷的心肌細(xì)胞對酶學(xué)影響的實驗

1.2.5.1 實驗分組 ①對照組：對該組模型進(jìn)行正常培養(yǎng)。②H2O2組：在進(jìn)行心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，使用H2O2對該組模型進(jìn)行預(yù)處理，使其心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)液的濃度達(dá)到400μmol/L，并連續(xù)處理3h。③SCL組：使用SCL對該組模型進(jìn)行預(yù)處理，使其心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)液的濃度達(dá)到5×10-5g /L，并連續(xù)處理12h。

1.2.5.2 實驗方法 分別用上清乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物岐化酶（SOD)和丙二醛（MDA）測定各組模型細(xì)胞的活性

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

我們使用SPSS13.0軟件包對本次實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計量資料用（x± s ）表示，采用t檢驗，計數(shù)采用χ2檢驗，用P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義[3]。

2 結(jié)果

2.1 進(jìn)行H2O2處理對心肌細(xì)胞的影響

①在H2O2作用1h后，對照組模型、H2O2Ⅰ組模型、H2O2Ⅱ組模型和H2O2Ⅲ組模型的吸光度分別為0.433±0.020、0.453±0.030、0.311±0.012 和 0.278±0.203，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。②在H2O2作用3h后，對照組模型、H2O2Ⅰ組模型、H2O2Ⅱ組模型和H2O2Ⅲ組 模 型 的 吸 光 度 分 別 為 0.442±0.047、0.391±0.121、0.241±0.043和 0.179±0.016， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。③在H2O2作用6至18h后，對照組模型、H2O2Ⅰ組模型、H2O2Ⅱ組模型和H2O2Ⅲ組模型的吸光度 分 別 為 0.477±0.032、0.078±0.013、0.063±0.084和0.041±0.007，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 進(jìn)行對心肌細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用量效關(guān)系實驗的結(jié)果

在H2O2作用12至18h后，對照組模型、H2O2組模型、SCLⅠ組模型、SCLⅡ組模型和SCLⅢ組模型的量效關(guān)系分別為 0.397±0.017、0.063±0.009 、0.071±0.001、0.072±0.004、0.073±0.002，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）。

2.3 進(jìn)行SCL預(yù)處理對發(fā)生氧化損傷心肌細(xì)胞酶學(xué)的影響

①與對照組模型相比，H2O2組模型培養(yǎng)基中的LDH含量、MDA含量和SOD含量無顯著差異(P＞0.05)。②與對照組模型相比，SCL組模型培養(yǎng)基中的LDH含量、MDA含量和SOD含量有顯著差異（P＜0.01）。詳情見表1。

表3 進(jìn)行SCL預(yù)處理對發(fā)生氧化損傷心肌細(xì)胞酶學(xué)的影響

3 討論

臨床研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血是冠心病患者最主要的臨床表現(xiàn)。而心肌在發(fā)生缺血后，心臟就會出現(xiàn)再灌注的現(xiàn)象。病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，心肌在發(fā)生再灌注時會產(chǎn)生大量的氧自由基。這些氧自由基會對心肌細(xì)胞造成傷害，從而影響心肌細(xì)胞的功能[4]。五味子木脂素是從中藥五味子中提取出的一種藥物成分。該成分能夠激活人體內(nèi)的SOD（一種存在于細(xì)胞質(zhì)和線粒體內(nèi)的金屬蛋白酶，具有清除氧自由基的作用），從而有效地清除心肌細(xì)胞中的氧自由基，保護(hù)發(fā)生氧化損傷的心肌細(xì)胞，促進(jìn)其功能的恢復(fù)[5]。

本次研究的結(jié)果說明，SCL對發(fā)生氧化損傷的心肌細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用，而且其濃度與作用呈線性關(guān)系。SCL之所以具有此作用，可能與其能夠激活人體內(nèi)的SOD有關(guān)。

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