液體甲醛脅迫下天竺葵葉片甲醛代謝途徑對甲醛吸收的貢獻作用

液體甲醛脅迫下天竺葵葉片甲醛代謝途徑對甲醛吸收的貢獻作用

韓雙, 肖素勤, 孫振, 軒秀霞, 李昆志, 陳麗梅*

(昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物工程技術(shù)研究中心,昆明650500)

摘要通過2 mmol/L H13CHO溶液處理天竺葵葉片4、24和48 h,以及用2、4和6 mmol/L HCHO溶液處理天竺葵葉片4 h,13C-NMR分析H13CHO在天竺葵葉片內(nèi)的具體代謝途徑及主要代謝途徑對甲醛吸收的貢獻。在時間梯度處理中,天竺葵葉片枸櫞酸(citric acid，Cit)的含量一直處于上升趨勢，在處理48 h后，其相對信號積分達到未處理天竺葵葉片(control，CK)的4.54倍。13C-糖類物質(zhì)[U-13C]葡萄糖(glucose,Gluc)和[U-13C]果糖(fructose,Fruc)的含量在處理的前4 h下降再上升,最后為CK的1.72和1.94倍。在濃度梯度處理中,Cit的含量隨HCHO濃度增大而明顯上升,最后為CK的7.58倍,13C-糖類物質(zhì)[U-13C]Gluc和[U-13C]Fruc的含量隨HCHO濃度增大先大幅下降后稍有上升,最后為CK的0.15和0.2倍。結(jié)合天竺葵的HCHO吸收曲線,表明在甲醛脅迫的早期(0～24 h),葉片中起作用的主要甲醛代謝途徑是從甲醛產(chǎn)生Cit的途徑;在脅迫后期(24～48 h),葉片中產(chǎn)生Cit的途徑和13C-糖類物質(zhì)[U-13C]Gluc和[U-13C]Fruc合成途徑同時起作用,使這個時期內(nèi)葉片從溶液中吸收甲醛量顯著增加。在這一時期可能還有部分[U-13C]Gluc和[U-13C]Fruc流入糖酵解或三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環(huán)使有機酸的信號峰增強。綜上可知,天竺葵主要通過Cit和糖類物質(zhì)([U-13C]Gluc和[U-13C]Fruc)合成途徑來代謝液體甲醛。

關(guān)鍵詞天竺葵; 甲醛代謝途徑; 液體甲醛脅迫; 甲醛吸收

中圖分類號Q 946.92文獻標志碼A

基金項目：四川省青年科技創(chuàng)新研究團隊項目(2013TD0015);國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(2013YQ49085906);國家科技支撐計劃科研條件領(lǐng)域備選項目(2014BAI03B01)。

收稿日期(Received)：2014-10-08;接受日期(Accepted)：2015-01-22;網(wǎng)絡(luò)出版日期(Published online)：2015-05-19

Contribution of the major HCHO metabolic pathways to HCHO-uptake by geranium leaves under liquid HCHO stress. Journal of ZhejiangUniversity(Agric. & LifeSci.), 2015,41(3):293-301

Han Shuang, Xiao Suqin, Sun Zhen, Xuan Xiuxia, Li Kunzhi, Chen Limei*(BiotechnologyResearchCenter,FacultyofLifeScienceandTechnology,KunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming650500,China)

SummaryGeranium (Pelargoniumsp. Frensham) is an ornamental plant cultivated in the worldwide. In this study, wild type (WT) geranium leaves were first treated with H13CHO solutions in time and concentration-gradient manner to clarify the detailed H13CHO-metabolic pathways in WT geranium leaves and to quantitatively analyze the roles of the major HCHO-metabolic pathways in HCHO-absorption by WT geranium leaves, and then understand the metabolic mechanism of geranium response to liquid HCHO stress.

Geranium was used as the experimental material. In the H13CHO treatment, 2 g geranium fresh leaves were soaked in different concentrations of H13CHO [including 0.1% 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid,MES] solution (100 mL), and then incubated under constant light [100 μmol/(m2·s)] at 25 ℃ for different time with shaking (100 r/min). After incubation, the leaves were washed and used to grind. The extract was transferred into a 5 mm NMR tube and subjected to13C-NMR analysis. Resonance peaks were assigned by comparison with authentic compound’s chemical shifts and confirmed by spiking the kalium phosphate buffer (KPB) extracts with authentic reference standards. For comparison of the relative contents of the metabolites, the target peaks were integrated relatively to the reference. Geranium leaves were treated in H13CHO solution to analyze the detailed HCHO metabolic pathways and the contribution of the major metabolic pathway to HCHO-uptake by geranium leaves.

In the time gradient, the content of citric acid (Cit) was on an upward trend, after treatment 48 h, its relative signal integral reached 4.54-fold of the unprocessed geranium leaves (control, CK). The signal integration of13C-carbohydrate[U-13C]glucose (Gluc) and [U-13C]fructose (Fruc) decreased in the first 4 h treatment and then increased, and finally achieved 1.72 and 1.94-fold of CK. In the concentration gradient, the content of citric acid increased obviously with the increase of HCHO concentration, and finally reached 7.58-fold of CK. The signal integration of13C-carbohydrate[U-13C]Gluc and [U-13C]Fruc slightly increased after decreased dramatically with the increase of HCHO concentration, and finally achieved 0.15 and 0.2-fold of CK. Results suggested that the HCHO-absorption by geranium leaves was a power function in relation with the treatment time. In 2 mmol/L HCHO treatment,during the early stage (0-24 h), the primary functioned metabolic pathway was the Cit produced pathway in geranium leaves. In this period, the geranium leaves absorbed 25% HCHO of total absorption. At the late stage (24-48 h) of HCHO treatment, two major metabolic pathways, the Cit produced pathway and13C-labelled glucide ([U-13C]Gluc and [U-13C]Fruc) generation pathway, functioned simultaneously in geranium leaves. Some13C-labelled glucide might also enter the glycolysis pathway or the tricarboxylate (TCA) cycle, which thereby allowed an enhancement in many organic acid peaks. In this time, the geranium leaves absorbed 50% HCHO of all uptake.

It is concluded that HCHO is eventually converted into glyoxylate which enters into the glyoxylate cycle to produce [3-13C]Cit, and carbohydrates are synthesized via gluconeogenesis pathway, then isocitrate enters into the TCA cycle to produce amino acids, and these metabolic pathways produce various organic acids. Apparently, geranium leaves metabolize liquid formaldehyde mainly through Cit and glucide ([U-13C]Gluc and [U-13C]Fruc) synthesis pathway.

Key wordsgeranium; HCHO metabolic pathway; liquid formaldehyde stress; formaldehyde-uptake

甲醛(HCHO)被廣泛用于化工合成﹑工業(yè)制造、醫(yī)藥合成等涉及化學(xué)的領(lǐng)域及其他工業(yè)領(lǐng)域,因此現(xiàn)代化工產(chǎn)品的生產(chǎn)過程中不可避免地要產(chǎn)生大量含液體甲醛的生產(chǎn)廢水,這些廢水直接排放到環(huán)境中將會對人和動物產(chǎn)生危害[1]。另外，人們?nèi)粘Ｉ钪醒b修所用的材料含有大量HCHO,且會持續(xù)不斷地釋放氣態(tài)甲醛,這使得氣態(tài)HCHO成為裝修房間中空氣污染的主要化學(xué)物質(zhì)之一[2]。利用微生物和植物制備的生物反應(yīng)器可以凈化環(huán)境中的液態(tài)、固態(tài)和氣態(tài)甲醛污染。

微生物可以通過異化途徑和同化途徑代謝甲醛。在異化途徑中,微生物體內(nèi)的游離HCHO首先通過與各種輔因子結(jié)合而脫毒,這些輔因子在不同微生物中各異,主要有真菌硫醇、還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、四氫甲基喋呤及四氫葉酸(tetrahydrofolic acid,THFA)等[3-4],加合反應(yīng)產(chǎn)生的HCHO加合物主要被氧化生成CO2并再生輔因子,同時提供能量供微生物生長。至今在微生物體內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的甲醛同化途徑有核酮糖單磷酸途徑(ribulose monophosphate pathway，RuMP)、絲氨酸途徑、木酮糖單磷酸途徑(xylulose5-P monophosphate pathway,Xu5P)及核酮糖單磷酸的環(huán)狀氧化途徑,微生物利用同化途徑把HCHO轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎慕M成成分。對一些植物包括吊蘭、綠蘿[5]、垂葉榕[6]、擬南芥[7]、香蕉[8]及常春藤[9]等甲醛代謝的研究結(jié)果表明植物的甲醛代謝機制和微生物相似,同一種植物體內(nèi)也存在多個甲醛代謝途徑：甲醛可以和GSH、THFA或氨基酸形成加合物而脫毒,甲醛與GSH產(chǎn)生的加合物進入甲醛氧化途徑被氧化為甲酸,甲酸可進一步被氧化為CO2,CO2可以通過卡爾循環(huán)同化為糖類物質(zhì);甲酸也可以進入C1代謝被同化為有機酸;甲醛與THFA產(chǎn)生的加合物可通過C1代謝同化為氨基酸。甲醛同化產(chǎn)生的糖類物質(zhì)、有機酸或氨基酸最終可以被整合進入植物的細胞組成成分如纖維素和蛋白質(zhì)中。此外,植物的甲醛代謝途徑也呈現(xiàn)一定程度的多樣性,如甲醛還原為甲醇和甲醛代謝產(chǎn)生甲硫氨酸的途徑僅在氣體甲醛脅迫的常春藤中觀察到,甲醛代謝產(chǎn)生枸櫞酸的途徑僅在液體甲醛脅迫的香蕉葉片中出現(xiàn),甲醛進入光呼吸途徑產(chǎn)生甘氨酸和絲氨酸同時進入三羧酸循環(huán)產(chǎn)生氮轉(zhuǎn)運氨基酸的代謝途徑只在液體甲醛脅迫的擬南芥中起作用。

天竺葵(Pelargoniumsp. Frensham)是在全世界范圍內(nèi)栽培的觀賞植物,本實驗室徐迪[10]的研究表明天竺葵葉片對液體甲醛具有一定的吸收能力;Song等[11]在轉(zhuǎn)基因天竺葵的葉綠體中過量表達RuMP途徑的HPS-PHI(6-磷酸己酮糖合成酶,HPS;6-磷酸果糖異構(gòu)酶,PHI)融合蛋白,成功地構(gòu)建了一個甲醛光合同化途徑,同時還發(fā)現(xiàn)液體H13CHO脅迫處理未轉(zhuǎn)基因的野生型(wild type,WT)天竺葵葉片中有一些未鑒定的特殊代謝產(chǎn)物。為了更好地了解天竺葵應(yīng)答液體HCHO脅迫的代謝機制,本研究用H13CHO溶液對天竺葵葉片進行時間梯度和濃度梯度處理,通過分析H13CHO在WT天竺葵葉片內(nèi)的具體代謝產(chǎn)物及各種產(chǎn)物相對含量的變化來推測甲醛在天竺葵葉片內(nèi)的具體代謝途徑及主要代謝途徑對甲醛吸收的貢獻。

1材料與方法

1.1天竺葵的培養(yǎng)

以無菌條件下生長的天竺葵(Pelargoniumsp. Frensham)植株為實驗材料,從盆栽的天竺葵植株上取幼芽經(jīng)氯化汞表面消毒后,植于固體MS培養(yǎng)基中,于恒溫23 ℃/24 h光照的組培室中培養(yǎng)2個月，取葉片用于后續(xù)實驗。

1.2葉片HCHO吸收能力的測定

從無菌培養(yǎng)天竺葵植株上取葉片2 g,置于含2、4和6 mmol/L的HCHO處理液[100 mL,含5 mmol/L KHCO3、0.1% 2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物(2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid,MES)]的組培瓶中,同時以不加葉片的相同HCHO溶液為對照(contrast，CK)檢測HCHO的揮發(fā)和吸附程度。處理樣品置于組培室,搖床振蕩(100 r/min)培養(yǎng)。在處理的不同時間點(8、16、24、32、40、48和72 h)取樣,用Nash[12]法測定處理液中殘留的HCHO含量。

溶液剩余甲醛含量/%=處理液中殘留甲醛的含量/處理液起始的甲醛含量×100;

CK中甲醛揮發(fā)量=處理液起始的甲醛含量-CK中溶液剩余甲醛含量;

死葉片吸附甲醛量/%=(處理液起始的甲醛含量-溶液剩余甲醛含量-CK中甲醛揮發(fā)量)/處理液起始的甲醛含量×100;

葉片的甲醛吸收量/%=(處理液起始的甲醛含量-溶液剩余甲醛量-CK中甲醛揮發(fā)量-死葉片的甲醛吸附量)/處理液起始的甲醛含量×100。

1.3H13CHO標記處理

從無菌培養(yǎng)的天竺葵植株上取葉片2 g置于組培瓶中,在時間梯度實驗中,用2 mmol/LH13CHO處理液(100 mL,含5 mmol/L KHCO3,0.1% MES)處理葉片4、24和48 h;在濃度梯度實驗中,用2、4和6 mmol/L處理葉片4 h。在整個處理期,組培瓶放在有24 h光照的25 ℃組培室中,搖床振蕩(100 r/min)培養(yǎng)。以相同條件不含H13CHO溶液處理的葉片為CK。處理結(jié)束后,用預(yù)冷無菌蒸餾水沖洗葉片4～5次,去除葉片表面殘留的H13CHO。用無菌吸水紙吸干葉片表面殘留水分,液氮速凍,置于-80 ℃冰箱備用。

1.413C-NMR分析

取出于-80 ℃冰箱中凍存的葉片,在液氮中研磨成粉末狀,加入3 mL含有10 mmol/L馬來酸、100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(kalium phosphate buffer,KPB,pH 7.4)抽提可溶性代謝產(chǎn)物,經(jīng)沸水浴加熱處理3 min使酶失活,12 000 r/min,4 ℃離心20 min去除細胞碎片。上清液經(jīng)真空冷凍干燥后,用0.5 mL KPB溶解,離心(12 000×g)3 min后取上清液裝入5 mm核磁管中,并在毛細管中封入甲酰胺插入核磁管中作為內(nèi)參與樣品同時進行13C-NMR分析。

13C-NMR分析在布魯克核磁共振儀(DRX 500-MHz)上進行,13C-NMR分析使用的相關(guān)參數(shù):寬帶質(zhì)子去耦,5-ms (90°)脈沖,譜寬37 594 Hz,采樣時間0.5 s,延滯時間1.2 s,樣品溫度保持在25 ℃,每個樣品采集32 000個數(shù)據(jù)點,掃描1 200次,處理數(shù)據(jù)時線寬為4 Hz。H13CHO標記樣品中化學(xué)位移參照甲酰胺碳共振峰(166.85)或馬來酸碳共振峰(130.41)。NMR譜中共振峰通過和已知化合物13C-NMR譜進行比較鑒定[13-14]。在計算不同樣品中各代謝物的相對含量時,目標共振峰以甲酰胺或馬來酸為內(nèi)參進行積分。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有的生理生化指標分析均進行3次生物學(xué)重復(fù)。使用Microsoft Excel 2003計算平均值及誤差分析,用DPS 7.5數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對所得數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析(P<0.05)。

2結(jié)果

2.1液體甲醛脅迫下天竺葵葉片吸收HCHO的能力

把無菌天竺葵葉片浸沒在2、4和6 mmol/L HCHO溶液中,每隔8 h測定1次溶液中剩余HCHO含量,并以溶液中剩余甲醛含量占起始甲醛含量百分比作圖(圖1A),分析天竺葵對液體HCHO的吸收效率(由于葉片對甲醛的吸附量幾乎為零,故忽略不計)。結(jié)果表明：隨著處理時間的增加,不同處理液中剩余甲醛含量都呈逐漸降低的趨勢,這種降低趨勢在32 h之后表現(xiàn)更明顯；處理到72 h時,天竺葵葉片能完全清除2 mmol/L處理液中的HCHO,4 mmol/L處理液中剩余17%的甲醛,6 mmo/L處理液中還有42%的甲醛剩余。證實了浸沒在液體中的天竺葵葉片可以吸收液體甲醛,但天竺葵葉片對不同濃度的液體甲醛吸收效率不同。

不含植物葉片的對照溶液(CK-2 mmol/L、CK-4 mmol/L和CK-6 mmol/L HCHO)在72 h時HCHO的揮發(fā)量分別為6.7%、4.1%和3.9%。根據(jù)上述方法計算天竺葵葉片對不同濃度液體甲醛的實際吸收量作甲醛的吸收曲線(圖1B),結(jié)果表明天竺葵對不同濃度液體甲醛的吸收量與時間呈冪函數(shù)關(guān)系。在18～32 h期間,天竺葵葉片對2、4和6 mmol/L液體HCHO的吸收速率分別為1.49 μmol/(g·h)、0.99 μmol/(g·h)和0.16 μmol/(g·h);在32～40 h期間,每克天竺葵葉片對2、4和6 mmol/L液體HCHO的吸收速率分別上升為3.81 μmol/(g·h)、3.14 μmol/(g·h) 和1.82 μmol/(g·h)。這說明天竺葵葉片對2 mmol/L液體甲醛吸收速率最快,對4 mmol/L液體甲醛吸收速率次之,對6 mmol/L液體甲醛吸收速率最慢。此外,葉片對不同濃度液體甲醛的吸收速率與其對不同濃度液體甲醛的吸收量呈正相關(guān)。因此,本研究把2 mmol/L和6 mmol/L的液體HCHO分別定義為低濃度和高濃度HCHO,4 mmol/L的液體HCHO定義為中濃度HCHO。

圖1　天竺葵吸收不同濃度液體HCHO的動力學(xué)曲線 Fig.1　Uptake kinetics of formaldehyde (HCHO) by geranium leaves in HCHO solutions

2.2低濃度液體甲醛脅迫下天竺葵葉片代謝H13CHO產(chǎn)物分析

用13C-NMR分析低濃度(2 mmol/L)液體H13CHO處理天竺葵葉片的代謝譜。結(jié)果表明[3-13C]枸櫞酸(citric acid,Cit)是天竺葵葉片背景中最強的信號峰,在H13CHO脅迫4 h時,[3-13C] Cit的信號峰(圖2A)開始上升,其信號強度約是CK的1.34倍(圖2B),此時[2-13C]甘氨酸(glycine,Gly)(圖2A,C)和[3-13C]絲氨酸(serine,Ser)(圖2H,J)的信號峰也在4 h有所增強;隨著H13CHO處理時間的增加,[3-13C]Cit的信號峰繼續(xù)上升,在24 h和48 h時,分別達到CK的1.83和2.58倍。這表明[3-13C]Cit是低濃度液體甲醛脅迫下天竺葵葉片代謝H13CHO最初出現(xiàn)的主要產(chǎn)物。此外，[1,5-13C]Cit、[6-13C]Cit和[2,4-13C]Cit的信號峰(圖2A)及強度(圖2B)也在2 mmol/L液體H13CHO的48 h顯著增強。

天竺葵葉片內(nèi)的游離[U-13C]葡萄糖(glucose,Gluc)和[U-13C] 果糖(fructose,Fruc)的信號峰(圖2D,E)和強度(圖2F,G)也變化明顯。經(jīng)2 mmol/L液體H13CHO脅迫4 h時,游離[U-13C]Gluc和[U-13C]Fruc的所有信號峰都顯著降低,它們的相對含量分別降低71%和65%。隨著處理時間的增加,游離[U-13C]Gluc和[U-13C]Fruc的含量有所恢復(fù),在脅迫24 h時,[U-13C]Gluc和[U-13C]Fruc的信號強度仍低于CK(圖2F,G),當處理至48 h時,[U-13C]Gluc和[U-13C]Fruc碳原子的共振峰強度與CK相比明顯增強,二者的相對積分分別為CK的1.72和1.94倍。這些結(jié)果說明在2 mmol/L液體H13CHO脅迫下,天竺葵葉片能將吸收的液體甲醛同化為[U-13C]Gluc和[U-13C]Fruc,從而使天竺葵葉片內(nèi)源[U-13C]Gluc和[U-13C]Fruc信號峰恢復(fù),并高出對照的水平。

在低濃度H13CHO脅迫至48 h時,伴隨[U-13C]Gluc和[U-13C]Fruc信號峰的增強,多種有機酸包括[3-13C]丙氨酸(alanine,Ala)、[3-13C]丙酮酸(pyruvic acid,PA)、[2-13C]谷氨酸(glutamic acid,Glu)、[2-13C]谷氨酰胺(glutamine,Gln)、[3-13C]天冬氨酸(aspartic acid,Asp)、[3-13C]天冬酰胺(asparagine,Asn)、[2-13C]蘋果酸(malic acid,Mal)信號峰的強度(圖2H～L)也顯著增強,表明這些化合物也是天竺葵葉片代謝2 mmol/L液體H13CHO的主要產(chǎn)物。

CK:對照;Ref:甲酰胺;Cit:枸櫞酸;Gly:甘氨酸;Gluc:葡萄糖;Fruc:果糖;PA:丙酮酸;Mal:蘋果酸;Ser:絲氨酸;Ala:丙氨酸;Glu:谷氨酸;Gln:谷氨酰胺;Asp:天冬氨酸;Asn:天冬酰胺.柱狀圖上不同小寫字母表示在P<0.05水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義. 　　CK: Control; Ref: Formamide; Cit: Citric acid; Gly: Glycine; Gluc: Glucose; Fruc: Fructose; PA: Pyruvic acid; Mal: Malic acid; Ser: Serine; Ala: Alanine; Glu: Glutamic acid; Gln: Glutamine; Asp: Aspartic acid; Asn:Asparagine. Different lowercase letters above the bar graph indicate statistically significant differences at the 0.05 probability level. 圖2　2 mmol/L液體H 13CHO處理天竺葵4、24和48 h后的主要代謝產(chǎn)物 Fig.2　 Carbon-13 nuclear magnetic resonance ( 13C-NMR) analyses of metabolic intermediates in geranium leaves treated with gradient time of 4, 24 and 48 h in 2 mmol/L H 13CHO

2.3高濃度液體甲醛脅迫下天竺葵葉片代謝H13CHO的代謝產(chǎn)物分析

用13C-NMR分析天竺葵葉片在高濃度液體甲醛脅迫下短時期內(nèi)代謝H13CHO的主要代謝產(chǎn)物。結(jié)果表明：2 mmol/L H13CHO處理葉片中沒有H13COOH信號峰(圖3A),4 mmol/L 和6 mmol/L H13CHO處理葉片中均產(chǎn)生了明顯的H13COOH信號峰(圖3A),并且隨著H13CHO處理濃度的增加,H13COOH的生成量明顯增加(圖3B),6 mmol/L H13CHO脅迫下H13COOH的生成量是4 mmol/L 的1.3倍(圖3C)。同時,[3-13C]Cit的信號峰上升幅度仍是最明顯的(圖3B),在2、4和6 mmol/L H13CHO處理的葉片中[3-13C]Cit相對含量分別是CK的1.33、4.39和5.86倍(圖3D)。另外,[1,5,6-13C]Cit信號峰的強度也隨H13CHO濃度的上升而增強(圖3B，D)。此外，[U-13C]Gluc和[U-13C]Fruc的信號峰(圖3E，F(xiàn))和相對含量(圖3G，H)隨H13CHO濃度的上升反而降低,說明在高濃度液體甲醛脅迫下短時期內(nèi)H13CHO在天竺葵葉片中的代謝沒有產(chǎn)生[U-13C]Gluc和[U-13C]Fruc。其他有機酸的信號峰變化和[U-13C]Gluc及[U-13C]Fruc相似,也隨H13CHO濃度的升高而降低。綜合13C-NMR分析結(jié)果,H13COOH、[3-13C]Cit和[1,5,6-13C]Cit是天竺葵葉片代謝H13CHO的主要代謝產(chǎn)物。

FA:甲酸;Ref:甲酰胺;Cit:枸櫞酸;Gluc:葡萄糖;Fruc:果糖.柱狀圖上不同小寫字母表示在P<0.05水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義. 　　FA: H 13COOH; Ref: Formamide; Cit: Citric acid; Gluc: Glucose; Fruc: Fructose. Different lowercase letters above the bar graph indicate statistically significant differences at the 0.05 probability level. 圖3　2、4和6 mmol/L液體H 13CHO處理天竺葵葉片4 h后的主要代謝產(chǎn)物 Fig.3　 Carbon-13 nuclear magnetic resonance ( 13C-NMR) analyses of metabolic intermediates in geranium leaves treated with of 2, 4 and 6 mmol/L H 13CHO solutions for 4 h

3討論

根據(jù)目前已知的C1化合物在植物體內(nèi)的代謝途徑可推測甲醛在植物體內(nèi)代謝產(chǎn)生枸櫞酸和甘氨酸的途徑可能是:1)甲醛被同化為糖類物質(zhì),糖類物質(zhì)進入光呼吸途徑產(chǎn)生甘氨酸或經(jīng)過糖酵解進入TCA循環(huán)產(chǎn)生枸櫞酸;2)甲醛氧化產(chǎn)生甲酸,甲酸氧化為CO2,CO2通過磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化的反應(yīng)和磷酸烯醇式丙酮酸結(jié)合形成草酰乙酸(oxaloacetic acid,OAA),OAA進入TCA循環(huán)產(chǎn)生枸櫞酸;3)甲酸縮合為乙醛酸,乙醛酸通過轉(zhuǎn)氨作用形成甘氨酸或進入乙醛酸循環(huán)產(chǎn)生枸櫞酸。由2 mmol/L液體H13CHO處理的天竺葵葉片4 h后的13C-NMR數(shù)據(jù)推測,天竺葵代謝液體H13CHO最先產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物應(yīng)該是[3-13C]Cit和[2-13C]Gly。在脅迫增加至24 h時,[3-13C]Cit的信號峰強度繼續(xù)上升,而在這2個時間點13C-標記糖類物質(zhì)的信號峰都在降低,13C-標記[U-13C]Gluc和[U-13C]Fruc信號峰的增強出現(xiàn)在脅迫葉片的48 h后。此外,在濃度梯度液體H13CHO處理的葉片中,隨甲醛濃度的增加，[3-13C]Cit、[6-13C]Cit和[1,5-13C]Cit信號峰的強度呈現(xiàn)上升趨勢,而其他化合物包括13C-標記糖類物質(zhì)信號峰的強度都呈現(xiàn)下降的趨勢。這說明在液體H13CHO處理的天竺葵葉片中,枸櫞酸和甘氨酸的產(chǎn)生可能和13C-標記糖類物質(zhì)的合成無關(guān)。

雖然在2 mmol/L液體H13CHO處理的葉片中沒有觀察到明顯的H13COOH共振峰,但在4和6 mmol/L液體H13CHO處理葉片中有很強的H13COOH共振峰,因此可以推測在2 mmol/L液體H13CHO脅迫下,H13CHO肯定在天竺葵葉片被氧化為H13COOH,可能是因為2 mmol/L液體H13CHO處理的葉片產(chǎn)生的H13COOH較少,同時又被迅速轉(zhuǎn)化為其他代謝產(chǎn)物,因而13C-NMR未能檢測到H13COOH的信號。水稻在淹水低氧的條件下,葉片中乙醛酸循環(huán)的關(guān)鍵酶枸櫞酸裂解酶(citrate lyase,ICL)和蘋果酸合成酶(malate synthase,MS)的表達受到誘導(dǎo),使乙醛酸循環(huán)的作用增強。在低氧時水稻葉片中由于糖酵解產(chǎn)生大量的乙醛和乙酸,通過增強乙醛酸循環(huán)的作用使乙醛和乙酸轉(zhuǎn)化為枸櫞酸和蘋果酸而脫毒[15]。當葉片浸泡在甲醛溶液中時也處于一種厭氧的環(huán)境,由此推測在液體H13CHO脅迫的天竺葵葉片中,[3-13C]Cit應(yīng)該通過上述第3)種途徑產(chǎn)生。有相關(guān)研究報道，在綠色馬鈴薯塊莖葉綠體中存在催化甲酸縮合成乙醛酸的酶(乙醛酸合成酶)[16-17],由此我們推測天竺葵葉片的葉綠體中可能也存在乙醛酸合成酶(glyoxylic acid synthase,GXS),在甲醛處理的天竺葵葉片中可由GXS催化甲醛氧化產(chǎn)生的甲酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐胰┧?乙醛酸通過轉(zhuǎn)氨作用形成甘氨酸或進入乙醛酸循環(huán)產(chǎn)生[3-13C]Cit(圖4),還有部分甘氨酸可能進入光呼吸途徑產(chǎn)生[3-13C]Ser(圖4)。

在時間梯度的液體H13CHO脅迫實驗中,天竺葵葉片中的[U-13C]Gluc和[U-13C]Fruc信號峰和相對含量在H13CHO脅迫的早期顯著降低,這一結(jié)果在低濃度液體H13CHO脅迫的香蕉和擬南芥葉片中也觀察到[8,18],證實消耗植物體內(nèi)源的可溶性糖類物質(zhì)是植物應(yīng)答液體甲醛脅迫的一種普遍機制,這可能是因為在溶液中進行液體甲醛脅迫是一種厭氧環(huán)境,植物組織只能通過糖酵解獲得能量,因而消耗更多糖類物質(zhì),這一點已在液體甲醛脅迫的動物細胞中得到證實[19]。在濃度梯度的液體H13CHO脅迫試驗中,天竺葵葉片中的[U-13C]Gluc和[U-13C]Fruc信號峰并沒有因為H13CHO脅迫濃度的升高而能迅速恢復(fù)到CK的水平,這一結(jié)果和高濃度液體H13CHO脅迫的香蕉和擬南芥葉片不同,說明即使是高濃度液體H13CHO的脅迫,也不能使天竺葵葉片中的H13CHO代謝迅速產(chǎn)生糖類物質(zhì),推測天竺葵葉片應(yīng)答高濃度液體H13CHO脅迫的機制與擬南介和香蕉葉片的可能不同。植物體可通過糖異生途徑把來自非糖類物質(zhì)的碳骨架轉(zhuǎn)化為糖類物質(zhì),由此推測2 mmol/L液體H13CHO脅迫48 h后天竺葵葉片中[U-13C]Gluc和[U-13C]Fruc可能是通過糖異生途徑產(chǎn)生的(圖4)。伴隨[U-13C]Gluc和[U-13C]Fruc信號峰的升高而增強的有機酸包括:[3-13C]Ala、[3-13C]PA、[2-13C]Glu、[2-13C]Gln、[3-13C]Asp、[2-13C]Asn、[2-13C]Mal可能是[U-13C]Gluc和[U-13C]Fruc隨后流入糖酵解或TCA循環(huán)的結(jié)果(圖4)。

Ser:絲氨酸;SHMT:絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶;Gly:甘氨酸;Asn:天冬酰胺;Cit:枸櫞酸;Glu:谷氨酸;Gln:谷氨酰胺;Asp:天冬氨酸;SGAT:乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶;FALDH:甲酸脫氫酶;FGH:硫代甲?；入赘孰乃饷?Ala:丙氨酸;PA:丙酮酸;Gluc:葡萄糖;Fruc:果糖;PEP:磷酸烯醇式丙酮酸. 　　Ser: Serine; SHMT: Serine hydroxymethyl transferase; Gly: Glycine; Asn:Asparagine; Cit: Citric acid; Glu: Glutamic acid; Gln: Glutamine; Asp: Aspartic acid; SGAT: Glyoxylate aminotransferase; FALDH: Formaldehyde dehydrogenase; FGH: S-formylglutathione hydrolase; Ala: Alanine; PA: Pyruvic acid; Gluc: Glucose; Fruc: Fructose; PEP: Phosphoenolpyruvic acid. 圖4　天竺葵代謝液體HCHO的主要代謝途徑 Fig.4　Major metabolic pathways of geranium metabolising liquid H 13CHO

試驗證明了枸櫞酸合成途徑和13C-糖類物質(zhì)合成途徑是天竺葵葉片代謝液體HCHO的主要途徑。結(jié)合甲醛吸收曲線和時間、濃度梯度的核磁譜可以估算在2 mmol/L液體甲醛脅迫的早期(0～24 h時期),在天竺葵葉片中主要起作用的甲醛代謝途徑是從甲醛產(chǎn)生枸櫞酸的途徑,這一時期葉片從溶液中吸收甲醛的量約為總吸收量的25%;在24～48 h時期,葉片中的2個甲醛代謝途徑即產(chǎn)生枸櫞酸的途徑和13C-糖類物質(zhì)合成途徑都起作用,故此時期內(nèi)葉片從溶液中吸收甲醛效率顯著提高,吸收的甲醛量約為總吸收量的50%.以上可知，這2種代謝途徑在甲醛脅迫的不同時間段發(fā)揮作用使天竺葵葉片的甲醛吸收量和時間呈曲線函數(shù)關(guān)系。

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*通信作者(Corresponding author)：陳正禮,E-mail:chzhli75@163.com

第一作者聯(lián)系方式：陳姍姍,E-mail:chenssism@163.com;羅啟慧,E-mail:lqhbiology@163.com.?為共同第一作者

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