血小板功能評價(jià)方法

于 茜，王 凡，劉宏斌

(解放軍總醫(yī)院南樓心血管內(nèi)科，北京 100853)

血小板作為血液中一種特殊的細(xì)胞成分，廣泛參與了炎癥、宿主防御、組織修復(fù)等生理過程，但最重要的仍是參與正常的止血功能[1,2]。因此，抗血小板治療廣泛發(fā)展與應(yīng)用的同時(shí)，利用血小板功能檢測方法監(jiān)測抗血小板治療的有效性及識別動脈疾病高風(fēng)險(xiǎn)患者越來越重要。隨著對血小板多方面功能的認(rèn)識以及社會科技進(jìn)步，出現(xiàn)了各種基于不同原理的檢測方法。但由于技術(shù)處理或原理的單一性，目前大多處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，臨床應(yīng)用受限。本文對近年來實(shí)驗(yàn)室或臨床的常用設(shè)備作一綜述，綜合分析利弊。

1 血小板聚集功能分析方法

1.1 光比濁法

1.1.1 原理介紹 20世紀(jì)60年代，Born設(shè)計(jì)了光比濁法(light transmission aggregometry，LTA)，其作為血小板檢測方法的金標(biāo)準(zhǔn)直到現(xiàn)在地位仍是不可動搖的，是很多鑒別和診斷血小板功能缺陷的專業(yè)實(shí)驗(yàn)室最為常用的方法[3]。LTA的測試原理是計(jì)算富血小板血漿(platelet rich plasma，PRP)樣品的透光度變化。PRP是含有大量懸浮細(xì)胞的渾濁溶液，懸浮細(xì)胞會大大減少光的透射。血小板聚集堆在激活劑加入后出現(xiàn)，懸浮細(xì)胞沉淀，光透射增加(100%設(shè)定為乏PRP)，隨血小板聚集實(shí)時(shí)測量動力學(xué)變化。設(shè)備配備自動設(shè)置功能(透光度為100%及0%的條件)、存儲軟件和配有攪拌棒的一次性比色杯。設(shè)備將獲得信號自動轉(zhuǎn)化為曲線圖形，與透光度的變化平行。在PRP中，不同的激活劑加入可致不同的血小板途徑活化，從而可了解血小板功能的不同特性。最常用的激活劑有二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)、花生四烯酸(arachidonic acid，AA)、膠原和腎上腺素。

1.1.2 優(yōu)缺點(diǎn) LTA能用多種激活劑及不同濃度引發(fā)血小板激活及聚集，因此提供了學(xué)習(xí)更多血小板激活途徑細(xì)節(jié)的機(jī)會；且因LTA與出血及缺血事件相關(guān)，成為在過去50年里大多數(shù)專業(yè)實(shí)驗(yàn)室備受歡迎的檢測方法[4]。盡管LTA被認(rèn)為重要且全面，但還是存在一些特殊問題：(1)受不同的分析前條件(如：抗凝血藥類型、血漿脂質(zhì)、溶血、低血小板計(jì)數(shù))影響；(2)不同的程序條件(如PRP的準(zhǔn)備、不同濃度的激活劑)易造成誤差；(3)在完成實(shí)驗(yàn)和解釋結(jié)果中，需實(shí)驗(yàn)室人員具備良好的技術(shù)、經(jīng)驗(yàn)和專業(yè)知識；(4)試驗(yàn)中的條件未能精確模擬生理?xiàng)l件[3,4]。因此，LTA需要不斷地被發(fā)展的標(biāo)準(zhǔn)化過程驗(yàn)證[5]。

1.1.3 臨床應(yīng)用 LTA是血小板檢測方法的金標(biāo)準(zhǔn)，是診斷多種血小板缺陷和監(jiān)測抗血小板治療的最常用技術(shù)[6]。研究發(fā)現(xiàn)[7]，瑞斯托菌素能促進(jìn)血管性血友病因子(von willebrand factor，VWF)和糖蛋白(glycoprotein，GP)Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ復(fù)合物的整合，可作為激活劑發(fā)現(xiàn)血管性血友病和血小板功能失調(diào)(如Bernard-Soulier綜合征)。用LTA監(jiān)測抗血小板治療能在高風(fēng)險(xiǎn)心血管患者中預(yù)測主要不良心血管事件(major adverse cardiovascular events，MACE)，由ADP-LTA和AA-LTA定義的殘留血小板活性率，均與缺血事件(如急性冠脈綜合征、穩(wěn)定型心絞痛)的發(fā)展相關(guān)。目前在實(shí)驗(yàn)室或臨床研究中，常用由ADP和AA觸發(fā)的血小板聚集截點(diǎn)值鑒別那些對抗血小板制劑沒有反應(yīng)且高風(fēng)險(xiǎn)MACE的急性冠脈綜合征患者[8]。

1.2 VerifyNow系統(tǒng)

1.2.1 原理介紹 VerifyNow是全自動的快速檢測系統(tǒng)，用于監(jiān)測抗血小板治療[9]。原理為血小板聚集到試劑盒內(nèi)纖維蛋白原覆蓋的珠子上，與活化的GPⅡb/Ⅲa受體成比例。光學(xué)濁度計(jì)反應(yīng)的透光度隨激活的血小板與附著在球體的纖維蛋白原的聚集而增加，凝集隨透光增加的程度而增大。在這項(xiàng)檢測方法中，凝血酶受體激活肽(thrombin receptor activating peptide，TRAP)用作激活劑，最大程度刺激血小板聚集。以聚集速率和程度計(jì)算血小板聚集單位(platelet aggregation units，PAU)。目前，又有對靶向藥物敏感的2個(gè)試劑盒可用：(1)用阿司匹林作為激活劑表達(dá)為阿司匹林反應(yīng)單位(aspirin reaction units，ARU)；(2)PRU試驗(yàn)(對噻吩并吡啶治療敏感)表達(dá)為P2Y12 反應(yīng)單位(P2Y12 reaction units，PRU)。

1.2.2 優(yōu)缺點(diǎn) 檢測快速，采用全血，無需樣本預(yù)處理和運(yùn)輸，無需專業(yè)實(shí)驗(yàn)室或操作者，無需用藥前基礎(chǔ)值，致聚劑和抗凝劑的作用無影響[8]。影響試驗(yàn)的因素包括：取血進(jìn)入試驗(yàn)的時(shí)間、血小板計(jì)數(shù)、血細(xì)胞比容、甘油三酯、纖維蛋白原水平。此外，試驗(yàn)設(shè)備昂貴，因此大多用于科研[10]。

1.2.3 臨床應(yīng)用 Verifynow系統(tǒng)被廣泛用于監(jiān)測急診心臟手術(shù)室的抗血小板治療，無需專業(yè)實(shí)驗(yàn)室?guī)椭鶾10]。2014年《抗血小板藥物治療反應(yīng)多樣性臨床檢測和處理的中國專家建議》中提出[11]，P2Y12抑制劑治療反應(yīng)監(jiān)測推薦應(yīng)用VerifyNow或血小板血管擴(kuò)張劑刺激磷蛋白(vasodilator-stimulated phosphoprotein，VASP)檢測，無條件時(shí)可采用LTA方法，但需注意操作標(biāo)準(zhǔn)化。另外，Verifynow系統(tǒng)在抗血小板治療患者中的應(yīng)用已擴(kuò)展至外科，嘗試預(yù)測術(shù)后出血[12]。

1.3 Plateletworks分析儀

1.3.1 原理介紹 Plateletworks是一種即時(shí)檢驗(yàn)分析儀，用于診斷性篩選試驗(yàn)。分析儀用阻抗法比較對照樣品乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid， EDTA)管中的血小板計(jì)數(shù)和添加ADP或AA后聚集的試驗(yàn)樣品(檸檬酸鹽管)中的血小板計(jì)數(shù)。

1.3.2 優(yōu)缺點(diǎn) 無需處理全血、結(jié)果即刻獲得，比LTA重復(fù)性較好，充實(shí)了血小板整體功能中血小板計(jì)數(shù)的角色，可應(yīng)用在血小板減少患者中[13]。不利因素是試驗(yàn)需在采集血樣后的幾分鐘內(nèi)進(jìn)行，嚴(yán)格的時(shí)間控制使這項(xiàng)設(shè)備在操作區(qū)域上應(yīng)用受限。

1.3.3 臨床應(yīng)用 Plateletworks分析儀將有可能成為心臟介入或外科手術(shù)中有用的工具，在急診護(hù)理?xiàng)l件下，Plateletworks也可顯示出檢測血小板計(jì)數(shù)和功能的臨床價(jià)值[14]。

2 基于凝血塊形成及穩(wěn)定性的分析方法——血栓彈力圖

2.1 原理介紹

血栓彈力圖(thromboelastography，TEG)為整體止血過程，目前常用的是TEG分析儀5000系列[15]，動態(tài)監(jiān)測從凝血開始至血小板聚集、血凝塊形成以及纖維蛋白溶解的整體過程，以血塊形成及溶解過程中全血在粘彈力上的變化為分析基礎(chǔ)[15,16]。根據(jù)所用試劑可進(jìn)行不同的試驗(yàn)，了解不同途徑的止血：如添加肝素酶能評估全血中肝素的抗凝程度，添加血小板受體激活劑(如ADP或AA)能監(jiān)測抗血小板藥物療效。

2.2 優(yōu)缺點(diǎn)

試驗(yàn)?zāi)芎芸焱瓿?<30 min)，允許全血成分之間的相互作用，更接近生理狀態(tài)，能提供完整的凝血輪廓，不受肝素類物質(zhì)的影響。缺點(diǎn)在于實(shí)驗(yàn)室之間可能存在變異性[17]，且TEG需在37℃ 進(jìn)行，無法監(jiān)測較低溫度時(shí)患者的凝血動態(tài)。

2.3 臨床應(yīng)用

TEG已在成分輸血、創(chuàng)傷、急診、外科手術(shù)(如心臟手術(shù)、肝移植、產(chǎn)科手術(shù)等)及臨床試驗(yàn)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，用于評估術(shù)后出血風(fēng)險(xiǎn)[18]。還可在冠心病個(gè)體中評價(jià)凝血狀態(tài)，監(jiān)測不同抗栓療效，協(xié)助擬定個(gè)體化治療方案，減少血栓和出血風(fēng)險(xiǎn)。血小板圖檢測已被證實(shí)可靠且分析變異小[19]。然而，更大規(guī)模的前瞻性研究還有待完成，以明確這些設(shè)備在監(jiān)測抗血小板治療中的合適角色。

3 流式細(xì)胞儀

3.1 原理介紹

流式細(xì)胞儀(flow cytometry，F(xiàn)C)血小板分析能提供在體血小板功能狀態(tài)信息，是分子水平觀察血小板聚集功能的一種新方法[20,21]。常用的血小板活化標(biāo)志物包括：血小板表面表達(dá)的P選擇素(CD62p標(biāo)記，作為α分泌顆粒的標(biāo)志)、膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物(用單克隆抗體PAC-1檢測)和VASP(作為P2Y12受體活化依賴信號標(biāo)志)。通過免疫熒光標(biāo)記后，由光學(xué)系統(tǒng)激發(fā)出不同散射光，光電信號傳入計(jì)算機(jī)系統(tǒng)處理，結(jié)果再以平均熒光強(qiáng)度暗指細(xì)胞數(shù)量的直方圖表現(xiàn)出來。通過測定循環(huán)中活化血小板(circulating activated platelets，CAP)判斷血小板的功能狀態(tài)。

3.2 優(yōu)缺點(diǎn)

用少量全血即可完成，避免樣品準(zhǔn)備步驟，允許生理環(huán)境中血小板相互作用，且能單獨(dú)完成血小板計(jì)數(shù)[22]。但設(shè)備昂貴，需要專業(yè)操作者及相關(guān)培訓(xùn)，且分析前階段需精心準(zhǔn)備防止誤差產(chǎn)生[22]；測定的蛋白分子活性敏感度高，易受多種實(shí)驗(yàn)條件的影響[23]；解釋結(jié)果有主觀性，造成實(shí)驗(yàn)室之間重復(fù)性及可比性差。

3.3 臨床應(yīng)用

近年來FC分析血小板功能被廣泛應(yīng)用，如測量血小板計(jì)數(shù)，明確血小板活化狀態(tài)，診斷血小板受體功能或數(shù)量異常，監(jiān)測抗血小板藥物療效。FC能發(fā)現(xiàn)很多遺傳性或獲得性血小板功能失調(diào)和儲存池疾病，被認(rèn)為是檢測血小板病的首選試驗(yàn)[22]。FC還能識別血小板的促凝能力和激活狀態(tài)(如在急性冠脈綜合征或體外循環(huán)時(shí))，評估血庫中儲存血小板的狀態(tài)[24]。但目前研究表明，PAC-1和CD62p蛋白分子因不穩(wěn)定而不適宜于抗血小板療效常規(guī)檢測[23]。

4 剪切力誘導(dǎo)血小板聚集的方法

4.1 血小板功能分析儀

4.1.1 原理介紹 20世紀(jì)90年代中期，血小板功能分析儀(platelet function analyzer，PFA)-100設(shè)備更新為PFA-200并投入使用，被認(rèn)為是測試出血時(shí)間(bleeding time，BT)的標(biāo)準(zhǔn)化體外替代試驗(yàn)[25]。少量檸檬酸鹽全血在高剪切力條件下通過毛細(xì)管抽吸到覆蓋不同激活劑的帶孔(147 μm)薄膜上，激活劑結(jié)合高剪切力在試劑盒中激活血小板，發(fā)生聚集。設(shè)備測量剪切力下減慢或停止的全血血流，以及血小板聚集封鎖孔隙的時(shí)間(closure time，CT)。試驗(yàn)包括兩種試劑盒：膠原和ADP(CADP試劑盒)或者腎上腺素(CEPI試劑盒)。FDA已批準(zhǔn)第3種INNOVANCE PFA P2Y試劑盒用來檢測P2Y12途徑，監(jiān)測抗血小板藥物如氯吡格雷的療效；試劑盒中薄膜孔更小(100 μm)，內(nèi)含ADP和PGE1的結(jié)合物[26]。

4.1.2 優(yōu)缺點(diǎn) 測試簡單快速，只需少量全血，無需多余的樣品準(zhǔn)備及大量的專業(yè)技術(shù)培訓(xùn)[4]。另外，此試驗(yàn)陰性預(yù)測值較高，尤其對于嚴(yán)重血小板功能缺陷和血管性血友病(von willebrand disease，VWD)Ⅱ、Ⅲ型[27]。但是，PFA-100/200對多種影響血小板功能的因素敏感，血小板計(jì)數(shù)、血細(xì)胞比容及抗凝劑特性會影響CT，因此在血小板<50×109/L或血細(xì)胞比容<25%時(shí)，臨床醫(yī)師需要仔細(xì)結(jié)合考慮[3]。另外，高VWF、纖維蛋白原、紅細(xì)胞水平可能縮短CEPI CT[27]。

4.1.3 臨床應(yīng)用 試驗(yàn)應(yīng)用剪切力模擬在體條件，相當(dāng)高水平依靠VWF，適合篩選VWD及其治療監(jiān)測[28]。但PFA-100/200方法對微小血小板功能缺陷不敏感，需要被更多專業(yè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)[27]。在抗血小板藥物療效檢測方面，PFA雖然顯示了與LTA、TEG較高的一致性，但方法學(xué)依賴性高，實(shí)用性稍差，仍需更嚴(yán)格的質(zhì)控[29]。

4.2 Cone and Plate(Let)分析儀

4.2.1 原理介紹 一種創(chuàng)新的快速檢測方法，人工在聚氯乙烯板(含促血栓形成物質(zhì))加樣孔中添加少量全血，椎體旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生剪切力刺激血小板活化、黏附，將多余血液成分洗掉后自動染色，通過顯微鏡觀察，軟件拍攝一系列加樣板連拍圖像，測量其表面覆蓋血小板聚集物的百分?jǐn)?shù)(代表血小板黏附)和聚集堆平均大小(代表血小板聚集)。

4.2.2 優(yōu)缺點(diǎn) 設(shè)備全自動化，無需移液，無需樣品準(zhǔn)備，簡單快速可行，但依賴血漿、血細(xì)胞比容及血小板計(jì)數(shù)。裝置中剪切力可調(diào)，可模擬血小板生理環(huán)境或接近于動脈粥樣硬化疾病的病理狀況[30]。

4.2.3 臨床應(yīng)用 此設(shè)備相關(guān)臨床經(jīng)驗(yàn)少，很少應(yīng)用于臨床大樣本中。該系統(tǒng)可相容性診斷血小板缺陷，但價(jià)值不大，臨床實(shí)用性仍需評估[31]。

5 檢測血栓素代謝物的方法

5.1 原理介紹

血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)是血小板活化后由AA快速合成的，在磷脂膜釋放。TXA2增強(qiáng)血小板活化，招募其他血小板到血管損傷部位，引起血管收縮，加速止血過程。因?yàn)榘胨テ诙?，TXA2在血漿或全血中很難檢測，最常用的代謝物是血栓烷素B2(thromboxane B2，TXB2)和11-去氫-血栓烷B2(DH-TXB2)，后者較前者更穩(wěn)定。關(guān)于TXA2代謝物的定量分析，放射免疫測定法已過時(shí)棄用，目前常用酶聯(lián)免疫測定或質(zhì)譜分析法[32]，采用37℃全血凝固30～60 min后的血漿或血小板活化聚集后PRP血漿檢測TXB2，或在尿液中檢測DH-TXB2。

5.2 優(yōu)缺點(diǎn)

測量TXA2代謝物可直接評估在體環(huán)氧合酶途徑，了解血小板活化狀態(tài)。但血小板生物合成TXA2的量(1～2 pg/mL)和容量(300～400 ng/mL)之間有很大差異。因此，有人認(rèn)為在血清或血漿中檢測TXB2受取樣時(shí)人工激活血小板的影響。

5.3 臨床應(yīng)用

血清和尿中TXB2濃度與TXA2生物合成密切相關(guān)，在不同疾病中其含量不同。目前廣泛用于發(fā)現(xiàn)血栓素合成缺陷及對阿司匹林的反應(yīng)[22,33]。在血小板對AA反應(yīng)異常時(shí)，測量TXA2代謝物能鑒別因?qū)ρ逅厥荏w反應(yīng)下降血小板產(chǎn)生TXA2能力的異常[34]。

6 總 結(jié)

迄今，已出現(xiàn)基于各種不同原理的試驗(yàn)設(shè)備用于檢測部分或整體的血小板功能，越來越多的方法更多關(guān)注于凝血、出血障礙以及監(jiān)測抗血小板治療有效性。隨著技術(shù)發(fā)展，試驗(yàn)方法或設(shè)備的升級能指導(dǎo)臨床醫(yī)師對出血風(fēng)險(xiǎn)做更正確快速的診斷，在術(shù)前、術(shù)后更精準(zhǔn)地調(diào)整抗血小板方案。雖然前景美好，在各種檢測方法之間也存在著很大問題：檢測方法缺乏明確的指南或指征；不同檢測方法之間相關(guān)性差；缺少精確分析前的質(zhì)量控制以減少人工誤差[30]。因此，除提高試驗(yàn)及設(shè)備可用性外，可靠性以及質(zhì)控測試的研究顯得日益重要。

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