堿預(yù)處理玉米芯米根霉同步糖化發(fā)酵產(chǎn)富馬酸

堿預(yù)處理玉米芯米根霉同步糖化發(fā)酵產(chǎn)富馬酸

顧夕梅,周瑾,陳云,李鑫

(南京林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，江蘇南京210037)

摘要：以堿預(yù)處理玉米芯渣為原料，采用單因素優(yōu)化方法優(yōu)化米根霉同步糖化發(fā)酵產(chǎn)富馬酸。在此基礎(chǔ)上，研究米根霉利用堿預(yù)處理玉米芯渣的同步糖化發(fā)酵，并與純糖發(fā)酵進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明：在50 g/L底物、(NH4)2SO4質(zhì)量濃度0.71 g/L、纖維素酶用量20 FPIU(以1 g纖維素計(jì))、CaCO3加入量30 g/L、接種量10%(體積分?jǐn)?shù))和裝液量50 mL的條件下，米根霉同步糖化發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)富馬酸13.78 g/L，而純糖發(fā)酵富馬酸生成量?jī)H6.21 g/L。

關(guān)鍵詞：堿預(yù)處理；玉米芯渣；富馬酸；同步糖化發(fā)酵；米根霉

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2015.06.003

收稿日期：2014-01-07

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2015BAD15B09)；江蘇省高校自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目(14KJA220003)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK20131426)

作者簡(jiǎn)介：顧夕梅(1991—)，女，江蘇南通人，碩士研究生，研究方向：木質(zhì)纖維原料生物利用；李鑫(聯(lián)系人)，副教授，E-mail:xli@njfu.edu.cn

中圖分類號(hào)：TQ353.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-3678(2015)06-0013-05

Abstract：Simultaneous saccharification and fermentation (SSF) of alkali-pretreated corncob to fumaric acid by Rhizopus oryzae was optimized. The optimal conditions were as follow:substrate loading 50 g/L,ammonium sulfate 0.71 g/L,cellulase dosage 20 FPIU/g cellulose,calcium carbonate 30 g/L,inoculum 10%(V/V),and loading volume 50 mL. Simultaneous saccharification and fermentation(SSF) of alkali-pretreated corncob to fumaric acid was compared to direct fermentation of glucose. Under the optimal conditions,process of SSF by Rhizopus oryzae could produce 13.78 g/L fumaric acid,while direct fermentation only obtained 6.21 g/L fumaric acid using glucose as the carbon source.

Keywords：alkali-pretreated； corncob; fumaric acid; simultaneous saccharification and fermentation; Rhizopus oryzae

Simultaneous saccharification and fermentation of alkali- pretreated corncob to fumaric acid by Rhizopus oryzae

GUXimei,ZHOUJin,CHENYun,LIXin

(CollegeofChemicalEngineering,NanjingForestryUniversity,Nanjing210037,China)

富馬酸作為一種不飽和四元羧酸，含有不飽和雙鍵及2個(gè)羧基，這樣的分子結(jié)構(gòu)，使其能夠參與眾多化學(xué)反應(yīng)。同時(shí)，富馬酸具有無(wú)毒、不吸濕及可增加聚合物堅(jiān)硬度等特性，在食品、化工、醫(yī)藥、涂料、樹(shù)脂等領(lǐng)域具有廣泛用途[1-4]。

目前，化石資源的衰竭及化學(xué)合成法對(duì)環(huán)境的污染，使得微生物發(fā)酵產(chǎn)富馬酸成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。發(fā)酵法生產(chǎn)富馬酸的微生物主要有霉菌、酵母及細(xì)菌，而根霉具有營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)以及生長(zhǎng)迅速等特點(diǎn)。此外，根霉菌可利用碳源范圍較廣，如葡萄糖、淀粉、纖維素和石蠟。以來(lái)源廣泛的非糧食基木質(zhì)纖維原料為碳源，低成本生物轉(zhuǎn)化富馬酸，符合可持續(xù)發(fā)展的要求。

同步糖化發(fā)酵(simultaneoussaccharificationandfermentation，SSF)技術(shù)將酶水解過(guò)程和發(fā)酵有機(jī)結(jié)合，具有縮短發(fā)酵周期、節(jié)約成本、避免底物抑制等優(yōu)點(diǎn)[7-8]。筆者以米根霉為發(fā)酵菌種，利用堿預(yù)處理玉米芯渣為原料，SSF法產(chǎn)富馬酸，并對(duì)影響發(fā)酵過(guò)程的因素進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳SSF條件。

1材料與方法

1.1　菌種和原料

米根霉(Rhizopus oryzae)CICC40351，購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

堿預(yù)處理玉米芯渣：江蘇康維生物有限公司(纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)66.35%，半纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)22.38%，木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.92%)。

纖維素酶(Novozyme公司,濾紙酶活力為117U/g)、β-葡萄糖苷酶(Novozyme公司，酶活力為323U/g)，Sigma公司。

1.2　培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)： 酵母膏3.0、麥芽浸膏3.0、瓊脂20.0、蛋白胨5.0、葡萄糖10.0。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L)： 葡萄糖40、(NH4)2SO44.4、KH2PO40.6、MgSO4·7H2O0.5、ZnSO4·7H2O0.017 6、FeSO4·7H2O0.000 498。pH2.3～2.7。

發(fā)酵培養(yǎng)基I(g/L)：(以葡萄糖為碳源)葡萄糖38、(NH4)2SO40.71、KH2PO40.6、MgSO4·7H2O0.5、ZnSO4·7H2O0.01、FeSO4·7H2O0.000 4。自然pH。

發(fā)酵培養(yǎng)基II(1L)：(以堿處理玉米芯渣為碳源)底物50g、(NH4)2SO40.71g、KH2PO40.6g、MgSO4·7H2O0.5g、ZnSO4·7H2O0.01g、FeSO4·7H2O0.000 4g、CaCO330g(單獨(dú)滅菌)；纖維素酶和β-葡萄糖苷酶的加入量分別為25IU和20IU(以1g纖維素計(jì))；加入乙酸-乙酸鈉緩沖液0.05mol/L維持發(fā)酵液pH4.8左右。

上述培養(yǎng)基均在0.1MPa、121 ℃條件下滅菌15min。

1.3　培養(yǎng)方法1.3.1　產(chǎn)孢斜面

從4 ℃冰箱中取出保藏菌種，接種環(huán)挑取少量孢子，接種于斜面，30 ℃培養(yǎng)6～7d。

1.3.2基礎(chǔ)培養(yǎng)

250mL三角瓶加入50mL種子培養(yǎng)基，根據(jù)孢子密度與吸光度曲線：y=0.553x+0.014(x：×107/mL)確定接種量，置于35 ℃、200r/min的搖床培養(yǎng)24h。

1.3.3發(fā)酵培養(yǎng)

250mL的三角錐形瓶，適當(dāng)裝液量和接種量，置于38 ℃、220r/min的搖床培養(yǎng)60h。

1.4　分析方法

水分含量測(cè)定：采用FD-720型紅外水分測(cè)定儀(日本KETT公司)測(cè)定。

孢子數(shù)量的確定：采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

試樣制備：發(fā)酵結(jié)束，加入250g/LNaOH溶液，將發(fā)酵液pH調(diào)至偏堿，再加入360g/L的H2SO4，將pH調(diào)至7附近，將富馬酸轉(zhuǎn)化為易溶于水的鈉鹽進(jìn)行檢測(cè)。離心后，倒出上層清液待測(cè)。

葡萄糖、富馬酸、乙醇含量測(cè)定：采用Agilent1200型高效液相色譜儀，Bio-RadAminexHPX-87糖柱，以5mmol/LH2SO4為流動(dòng)相，流速為0.6mL/min，柱溫55 ℃，示差折光檢測(cè)器，進(jìn)樣量10μL。

2結(jié)果與討論

2.1　同步糖化發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化2.1.1　( NH 4) 2 SO 4用量的確定

氮源的濃度對(duì)微生物的菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物產(chǎn)量都有較大的影響，對(duì)于米根霉為代表的絲狀真菌而言，氮源限制造成的環(huán)境脅迫是積累有機(jī)酸的重要營(yíng)養(yǎng)特征。以(NH4)2SO4作為唯一氮源，考察(NH4)2SO4用量(0.71、0.51、0.31和0.21g/L)對(duì)米根霉SSF產(chǎn)富馬酸的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1(NH4)2SO4用量對(duì)米根霉SSF產(chǎn)富馬酸的影響

Table1Effectsofammoniumsulfateonfumaricacid

productionbySSFusingRhizopus oryzae

g· L -1

由表1可知：氮源用量的變化對(duì)富馬酸產(chǎn)量的影響較小，(NH4)2SO4質(zhì)量濃度為0.71g/L時(shí)，富馬酸產(chǎn)量最高(11.81g/L)。隨著(NH4)2SO4濃度的逐漸減少，菌體對(duì)葡萄糖的利用率下降，(NH4)2SO4用量為0.21g/L時(shí)，剩余葡萄糖質(zhì)量濃度高達(dá)22.19g/L，而富馬酸的產(chǎn)量并未有明顯下降，且乙醇產(chǎn)量呈下降趨勢(shì)。這可能是由于C/N比的增加，導(dǎo)致菌體胞質(zhì)內(nèi)富馬酸酶酶活的提高，使碳流更傾向于形成富馬酸的途徑[10]。從菌體生物量的表現(xiàn)來(lái)看，氮源的減少，菌體顆粒直徑明顯較小，氮源的減少限制了菌體生物量的生長(zhǎng)。

2.1.2纖維素酶用量的確定

纖維素酶的高成本是阻礙纖維工業(yè)化的一個(gè)重要原因，因此，除了開(kāi)發(fā)高效廉價(jià)的纖維素酶之外，優(yōu)化纖維素酶的用量也是降低生產(chǎn)成本的有效途徑之一?？疾炖w維素酶用量(20、25、30和35U)對(duì)米根霉SSF產(chǎn)富馬酸的影響，結(jié)果如表2所示。

表2　纖維素酶用量對(duì)米根霉 SSF產(chǎn)富馬酸的影響

由表2可知：隨著纖維素酶用量的增加，富馬酸產(chǎn)量較為穩(wěn)定，沒(méi)有出現(xiàn)大幅度的變化。增加纖維素酶的用量可以增加纖維素酶與纖維素的黏附幾率，可有效地將纖維素轉(zhuǎn)化為還原糖，然而在一定條件下，纖維素分子能與纖維素酶分子結(jié)合的位點(diǎn)數(shù)量有限，當(dāng)這些結(jié)合位點(diǎn)全被纖維素酶分子占據(jù)后，再增加纖維素酶用量，達(dá)不到增加酶解作用，加快還原糖的釋放；另一方面從經(jīng)濟(jì)角度考慮，酶用量也要盡可能少[11]。因此，確定纖維素酶最佳用量為20U。

2.1.3CaCO3用量的確定

微生物都有它們生長(zhǎng)的最適pH范圍，為了維持環(huán)境中pH，同時(shí)降低產(chǎn)物抑制作用，培養(yǎng)基中往往要加入一定量的中和劑[11]。微生物發(fā)酵產(chǎn)富馬酸的研究中，CaCO3是最常用的中和劑[4,10,12-13]。使用CaCO3為中和劑作用溫和，不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷，有利于菌體生長(zhǎng)；但CaCO3一次性投加過(guò)量時(shí)會(huì)對(duì)菌體造成包埋現(xiàn)象，不利于菌體與培養(yǎng)基接觸而影響發(fā)酵進(jìn)程。因此，考察CaCO3加入量(10、20、30和40g/L)對(duì)米根霉SSF產(chǎn)富馬酸的影響，結(jié)果如表3所示。

表3　 CaCO 3加入量對(duì)米根霉 SSF產(chǎn)富馬酸的影響

由表3可知：當(dāng)CaCO3添加量為10g/L時(shí)，富馬酸產(chǎn)量較低，且CaCO3的加入量過(guò)少時(shí)，米根霉對(duì)葡萄糖的利用率下降，這說(shuō)明較低的CaCO3濃度不足以維持發(fā)酵液在一個(gè)適宜的pH范圍，同時(shí)CaCO3能夠提供一定的CO2，以激活丙酮酸羧化酶，使碳流主要分布于產(chǎn)生富馬酸的胞質(zhì)途徑。所以，當(dāng)CaCO3加入量不足時(shí)，會(huì)影響碳流的分布[14]。由表3還可知，當(dāng)CaCO3的添加量過(guò)高或過(guò)低時(shí)，乙醇的濃度都較高。綜合考慮，確定CaCO3的最適添加量為30g/L。

2.1.4接種量的確定

接種量是由發(fā)酵時(shí)菌體生長(zhǎng)繁殖的速度決定的，通常較大的接種量可以縮短生長(zhǎng)周期，使產(chǎn)物合成提前，但如果接種量過(guò)大則可能使菌種生長(zhǎng)過(guò)快，溶氧量不足，從而影響產(chǎn)物的合成[15]?？疾旖臃N量(5、10、15和20%(體積分?jǐn)?shù)))對(duì)碳源的利用情況和SSF產(chǎn)富馬酸的影響，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知：隨著接種量的增加，發(fā)酵剩余葡萄糖逐漸減少，但是過(guò)高的接種量，并未帶來(lái)高的富馬酸積累，原因可能是接種量提高，菌球數(shù)目增多，有氧呼吸較強(qiáng)，葡萄糖經(jīng)糖酵解生成的丙酮酸大量進(jìn)入三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán))被消耗，最終進(jìn)入胞質(zhì)轉(zhuǎn)化為富馬酸的量也較低[13]。而高接種量下乙醇的產(chǎn)量也較高，說(shuō)明在一定階段，高接種量會(huì)加速無(wú)氧呼吸。當(dāng)接種量為5%時(shí)，富馬酸產(chǎn)量低于接種量為10%時(shí)的產(chǎn)量，這是因?yàn)檫m當(dāng)?shù)卦黾咏臃N量，有利于微生物快速進(jìn)入到對(duì)數(shù)期，使整個(gè)發(fā)酵周期中的產(chǎn)酸期相對(duì)延長(zhǎng)。因此，選定米根霉發(fā)酵產(chǎn)富馬酸的最佳接種量為10%。

表4　接種量對(duì)米根霉 SSF產(chǎn)富馬酸的影響

2.1.5裝液量的確定

對(duì)好氧性真菌米根霉而言，溶氧對(duì)于其菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物積累都有較大影響，溶氧越多，菌體生長(zhǎng)越快，有氧呼吸越強(qiáng)，TCA循環(huán)產(chǎn)生的ATP越多，可以為丙酮酸羧化酶催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸所用，同時(shí)TCA循環(huán)本身也是積累富馬酸的次要途徑[4-5]。因此，在一定范圍內(nèi)，高的溶氧可以帶來(lái)高的富馬酸積累[13]。錐形瓶中的裝液量直接影響溶氧水平，從而影響根霉細(xì)胞生長(zhǎng)和富馬酸的積累?？疾煅b液量(50、75、100和125mL)對(duì)米根霉SSF產(chǎn)富馬酸的影響，結(jié)果如表5所示。

表5　裝液量對(duì)米根霉 SSF產(chǎn)富馬酸的影響

由表5可知，相同轉(zhuǎn)速下，裝液量越少，溶氧條件越好。隨著裝液量的升高，富馬酸產(chǎn)量越來(lái)越低，而乙醇的積累則越來(lái)越高。這說(shuō)明，裝液量越低，米根霉的無(wú)氧呼吸越弱。由此可知，裝液量是影響搖瓶發(fā)酵溶氧的重要因素。裝液量越高，溶氧越少，無(wú)氧呼吸越強(qiáng)，進(jìn)而促進(jìn)了副產(chǎn)物乙醇的積累。因此，最佳裝液量為50mL。

2.2　堿預(yù)處理玉米芯同步糖化發(fā)酵產(chǎn)富馬酸

經(jīng)過(guò)堿預(yù)處理的玉米芯渣，作為一種木質(zhì)纖維原料，含有豐富的纖維素，可以作為SSF碳源進(jìn)行米根霉同步糖化發(fā)酵產(chǎn)富馬酸。堿預(yù)處理破壞了玉米芯的結(jié)構(gòu)，使其結(jié)構(gòu)松散，且去除了大量的半纖維素和木質(zhì)素，這些都有利于纖維素降解成單糖的酶解過(guò)程[16]。而以玉米芯為唯一碳源的培養(yǎng)基中，除了大量的纖維素成分外，蛋白質(zhì)、脂類等也為米根霉提供了生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)成分[17]。以堿預(yù)處理玉米芯渣為碳源的同步糖化發(fā)酵過(guò)程，與米根霉純糖發(fā)酵產(chǎn)富馬酸的對(duì)比，結(jié)果如圖1所示。

圖1　 米根霉同步糖化發(fā)酵與純糖發(fā)酵產(chǎn)富馬酸的對(duì)比 Fig.1　 Comparison of production of fumaric acid between SSF of alkali-pretreated corncob and direct fermentation of glucose

由圖1可知：以堿預(yù)處理玉米芯渣為碳源的發(fā)酵，前期積累的葡萄糖較多，當(dāng)米根霉菌體小球生長(zhǎng)完全并開(kāi)始產(chǎn)酸時(shí)，葡萄糖的含量急劇下降。而以葡萄糖為碳源時(shí)，菌體可直接利用培養(yǎng)基中的碳源進(jìn)行生長(zhǎng)和產(chǎn)酸，36h時(shí)，葡萄糖已經(jīng)完全耗盡。米根霉是非生長(zhǎng)耦聯(lián)型的產(chǎn)酸機(jī)制，因此富馬酸的分泌均在菌體生長(zhǎng)完全以后，且SSF過(guò)程中乙酸-乙酸鈉緩沖液的存在，延遲了菌體的生長(zhǎng)，但適宜濃度的乙酸會(huì)促進(jìn)乙酰輔酶的生成，有利于細(xì)胞的代謝[18]。對(duì)于SSF發(fā)酵60h后，葡萄糖完全耗盡，富馬酸的產(chǎn)量達(dá)到最高13.78g/L，而葡萄糖發(fā)酵富馬酸的產(chǎn)量最高僅6.21g/L。且葡萄糖發(fā)酵后期，菌體死亡導(dǎo)致發(fā)酵液pH的明顯上升。

根霉利用木質(zhì)纖維原料同步糖化發(fā)酵產(chǎn)富馬酸的研究較少，李碩[19]以小麥麩皮為碳源，利用戴爾根霉同步糖化發(fā)酵產(chǎn)富馬酸，底物添加量為100g/L，而富馬酸產(chǎn)量?jī)H為6.06g/L。本研究雖然只是在低底物濃度的條件下進(jìn)行了同步糖化發(fā)酵的試驗(yàn)，但是為米根霉利用木質(zhì)纖維原料同步糖化發(fā)酵產(chǎn)富馬酸的發(fā)展奠定了一定的前期基礎(chǔ)。

3結(jié)論

米根霉利用堿預(yù)處理玉米芯渣SSF發(fā)酵產(chǎn)富馬酸的培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果：50g/L堿預(yù)處理玉米芯渣，(NH4)2SO4質(zhì)量濃度0.71g/L，纖維素酶用量20U(以1g纖維素計(jì))，CaCO3加入量30g/L，接種量10%(體積分?jǐn)?shù))，裝液量50mL。

米根霉利用堿預(yù)處理玉米芯渣SSF與純糖發(fā)酵產(chǎn)富馬酸對(duì)比表明，在SSF過(guò)程中富馬酸產(chǎn)量最高可達(dá)13.78g/L，純糖發(fā)酵的富馬酸產(chǎn)量?jī)H6.21g/L。

參考文獻(xiàn)：

[1]古春博.少根根霉網(wǎng)布固定化發(fā)酵產(chǎn)富馬酸.北京:北京化工大學(xué),2013.

[2]李學(xué)坤,張昆,高振,等.富馬酸的合成及應(yīng)用.現(xiàn)代化工,2005,25(增刊1):81-84.

[3]李霜,徐晴,黃和.發(fā)酵法制備富馬酸的關(guān)鍵技術(shù)及其進(jìn)展.生物加工過(guò)程,2013,11(2):52-57.

[4]RoaEngelCA,StraathofAJJ,ZijlmansTW,etal.Fumaricacidproductionbyfermentation.ApplMicrobiolBiotechnol,2008,78:379-389.

[5]臧茹.富馬酸生產(chǎn)菌株米根霉的菌種選育及培養(yǎng)條件的優(yōu)化.杭州:浙江大學(xué),2007.

[6]韓衛(wèi)強(qiáng).少根根霉直接發(fā)酵木薯粉產(chǎn)富馬酸的研究.北京:北京化工大學(xué),2012.

[7]趙國(guó)振,熊向峰,陳朝銀,等.馬鈴薯淀粉同步糖化發(fā)酵制備L-乳酸條件的統(tǒng)計(jì)學(xué)優(yōu)化.生物加工過(guò)程,2010,8(4):6-11.

[8]彭志宏.同步糖化發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸工藝的研究進(jìn)展.化工進(jìn)展,2011,30(8):1821-1825.

[9]余洋,徐晴,李霜.米根霉在氮源限制下的木糖代謝和關(guān)鍵酶特性.微生物學(xué)報(bào),2013,53(11):1189-1194.

[10]DingYueyue,LiShuang,DouChang,etal.ProductionoffumaricacidbyRhizopus oryzae:roleofcarbon-nitrogenratio.ApplBiochemBiotechnol,2011,164:1461-1467.

[11]楊靜.木質(zhì)纖維原料分段酶水解技術(shù)的研究.南京:南京林業(yè)大學(xué),2010.

[12]劉寧,張昆,何皓,等.響應(yīng)面法優(yōu)化少根根霉發(fā)酵合成富馬酸.食品與發(fā)酵業(yè),2008,34(7):64-67.

[13]韓衛(wèi)強(qiáng),王芳,譚天偉,等.接種量和裝液量對(duì)少根根霉直接發(fā)酵生木薯粉生產(chǎn)富馬酸的影響. 北京化工大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2011,38(5):95-99.

[14]ZhangKun.FumaricacidfermentationbyRhizopus oryzaewithintegratedseparationtechnologies.Columbus:OhioStateUniversity,2012.

[15]李鑫,馬瑞,趙晗璐,等.米根霉利用純糖和不同預(yù)處理玉米秸稈酶解糖生產(chǎn)L-乳酸.生物加工過(guò)程,2010,8(6):1-5.

[16]歐陽(yáng)嘉,李建明,李鑫,等.酶法水解低聚木糖生產(chǎn)廢渣工藝的研究.太陽(yáng)能學(xué)報(bào),2010,31(2):263-268.

[17]金濱鋒,崔洪斌,王金鳳,等.利用玉米芯發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的研究.哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2004,20(2):213-215.

[18]劉寧,李霜,嚴(yán)立石,等.半纖維素水解液中抑制物對(duì)少根根霉發(fā)酵產(chǎn)富馬酸的影響.現(xiàn)代化工,2008,28(增刊2):271-275.

[19]李碩.戴爾根霉利用小麥麩皮發(fā)酵產(chǎn)富馬酸的研究.合肥:合肥工業(yè)大學(xué),2013.

(責(zé)任編輯荀志金)