β-半乳糖苷酶的篩選、克隆表達(dá)、酶學(xué)性質(zhì)及其酶法合成低聚半乳糖

β-半乳糖苷酶的篩選、克隆表達(dá)、酶學(xué)性質(zhì)及其酶法合成低聚半乳糖

王欣，吳斌，何冰芳

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京211800)

摘要：采用人工底物鄰硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(oNPG)為篩選標(biāo)記,從耐有機(jī)溶劑微生物菌庫(kù)中,篩選出具有較高水解活性的β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌，再以乳糖為底物考察菌株低聚半乳糖的合成性能，篩選得到1株產(chǎn)β-半乳糖苷酶的Erwinia billingiae WX1。根據(jù)GenBank中相同屬種的基因組序列推測(cè)β-半乳糖苷酶基因，克隆得到β-半乳糖苷酶基因gal，并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了來源于Erwinia billingiae菌β-半乳糖苷酶的克隆表達(dá)。該基因的開放閱讀框(ORF)為1 428 bp，編碼475個(gè)氨基酸，理論相對(duì)分子質(zhì)量為5.2×10`4。鎳柱法分離純化得到電泳純的β-半乳糖苷酶GAL，其酶學(xué)性質(zhì)研究表明最適催化溫度55 ℃，最適pH 7.0；Mg`(2+)、Mn`(2+)對(duì)該酶起較強(qiáng)促進(jìn)作用， EDTA對(duì)該酶抑制作用較強(qiáng)。利用β-半乳糖苷酶GAL的轉(zhuǎn)糖基作用，以乳糖為底物合成低聚半乳糖，初步優(yōu)化的反應(yīng)條件：底物乳糖質(zhì)量濃度400 g/L，每克乳糖添加酶量 1.0 U，在40 ℃反應(yīng)16 h后，低聚半乳糖合成率達(dá)到34%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，顯示了較好的開發(fā)前景。

關(guān)鍵詞：Erwinia billingiae；β-半乳糖苷酶；克隆表達(dá)；酶法合成；低聚半乳糖

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2015.06.006

收稿日期：2014-04-04

基金項(xiàng)目：高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)基金(20123221130001)；國(guó)家自然科學(xué)基金(21376119)

作者簡(jiǎn)介：王欣(1988—)，女，遼寧營(yíng)口人，碩士研究生，研究方向：生物化工；何冰芳(聯(lián)系人)，教授，E-mail:bingfanghe@njtech.edu.cn

中圖分類號(hào)：Q93

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-3678(2015)06-0030-06

Abstract：Strains were screened from organic solvent tolerant bacteria,though the hydrolysis of o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (oNPG).After rescreened by lactose as using lactose as substrate,strain Erwinia billingiae WX1 showed high transgalactosidation.Based on the nucleotide sequence of the β-galactosidase from Erwinia billingiae,the gene encoding the β-galactosidase GAL was cloned and expressed in Escherichia coli. The gene consists of 1 428 bp,and the translated protein encodes 475 amino acids and its molecular mass is approximately 5.2×10`4. After purification,the purity of this enzyme showed that the optimal pH and temperature were 7.0 and 55 ℃,respectively. Its activity was notably promoted by Mg`(2+),Mn`(2+),whereas EDTA had high inhibition to the enzyme. The enzyme synthesis of galacto-oligosachorides was studied by using its transgalactosylation. The optimum synthesis condition of galacto-oligosachorides was as follows:400 g/L lactose,1.0 U β-galactosidase GAL,reaction with temperature 40 ℃ for 16 h,under the conditons,the production rate of galacto-oligosachorides was 34%. Our findings demonstrate that the recombinant β-galactosidase has good development prospects.

Keywords：Erwinia billingiae; β-galactosidase; cloning expression; enzymatic synthesis; galacto-oligosachorides

Screening,cloning,expression,characterization of β-galactosidase and enzymatic synthesis of galacto-oligosaccharides

WANG Xin,WU Bin,HE Bingfang

(College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China)

低聚半乳糖(galacto-oligosaccharide,GOS)是在乳糖分子的半乳糖基一側(cè)連接上1～4個(gè)半乳糖基生成的低聚糖類，屬于葡萄糖和半乳糖組成的雜低聚糖。低聚半乳糖作為功能性低聚糖，具有促進(jìn)腸道內(nèi)益生菌增殖、緩解乳糖不耐癥等功效。目前，市場(chǎng)上銷售的乳制品中很多添加低聚半乳糖，具有廣闊的應(yīng)用前景。利用酶法合成低聚半乳糖，是工業(yè)生產(chǎn)低聚半乳糖的主要方法。

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,EC 3.2.1.23),又稱乳糖酶(GAL)，能夠水解乳糖生成半乳糖和葡萄糖。有些β-半乳糖苷酶在水解乳糖分子中β-1,4半乳糖苷鍵的同時(shí)，具有轉(zhuǎn)糖基作用，通常以水解產(chǎn)物半乳糖為供體，以底物乳糖為受體，生成低聚半乳糖。該酶廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物中，其中微生物是β-半乳糖苷酶的主要來源。然而，國(guó)內(nèi)用β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的產(chǎn)率相對(duì)較低，因此篩選具有高合成性能的β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌株具有重要意義。

筆者篩得1株產(chǎn)β-半乳糖苷酶的ErwiniabillingiaeWX1，克隆該酶的基因，并在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)，以實(shí)現(xiàn)來源于Erwiniabillingiae菌β-半乳糖苷酶的克隆表達(dá)，在此基礎(chǔ)上純化β-半乳糖苷酶，考察該酶的酶學(xué)性質(zhì)，并利用該酶催化合成低聚半乳糖。

1材料與方法

1.1　主要試劑和材料

pMD-18T Vector、限制性內(nèi)切酶Hind III和NdeI、T4 DNA ligase，TaKaRa公司；大腸桿菌(Escherichiacoil)DH5a和BL21(DE3)、質(zhì)粒pET-28a(+)由筆者所在實(shí)驗(yàn)室提供，鄰硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(oNPG)，Sigma公司；酶標(biāo)儀Power Wave XS,美國(guó)Bio-Tech公司；ultimate 3000型戴安高效液相色譜儀(HPLC)，美國(guó)Thermo公司。

初篩培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5、蛋白胨10、NaCl 10、瓊脂20。pH 7.0。滅菌后冷卻再加入oNPG 1 g/L。

復(fù)篩培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基g/L)：可溶性淀粉1、乳糖10、酵母粉2、胰蛋白胨6、CaCl20.5、MgSO4·7H2O 1.5、KH2PO42、脲0.5、TW-80 0.5×10-4。pH 7.5。

1.2　 β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌株的篩選和鑒定

以筆者所在課題組自行篩選并保存的超過1 600株耐有機(jī)溶劑微生物為篩選菌庫(kù)，從凍存管接種于LB固體培養(yǎng)基，于30 ℃培養(yǎng)24 h，將菌株點(diǎn)樣轉(zhuǎn)接到含人工底物oNPG的初篩培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h后，菌落邊出現(xiàn)亮黃色圈的為有β-半乳糖苷酶水解活力的菌株。

將具有β-半乳糖苷酶水解活力的菌株接種到復(fù)篩培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，再以乳糖為底物，通過薄層層析分析，篩選出具有轉(zhuǎn)糖基活性的β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌株。運(yùn)用16S rDNA序列分析，對(duì)篩選的目的菌株進(jìn)行菌種鑒定。

1.3　 β-半乳糖苷酶的基因克隆、異源表達(dá)

1.3.1β-半乳糖苷酶的基因克隆

參照GenBank中典型菌株ErwiniabillingiaeEb661基因組推測(cè)的β-半乳糖苷酶基因序列和表達(dá)載體pET-28a(+)的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)正向引物P1：(SF)5′-C￣G￣G￣C￣A￣T￣A￣T￣G￣A￣G￣T￣A￣A￣G￣G￣T￣C￣A￣C￣C￣A￣T￣C￣A￣A￣C￣A -3′(下劃線處為NdeI酶切位點(diǎn))；反向引物P2：(SR)5′-C￣A￣T￣A￣A￣G￣C￣T￣T￣T￣T￣A￣T￣T￣T￣C￣A￣T￣T￣T￣C￣A￣T￣C￣A￣T￣C￣A￣A￣G￣G￣G￣A -3′(下劃線處為Hind III 酶切位點(diǎn))。采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收PCR產(chǎn)物。將目的片段連接到 pMD18-T載體，熱激轉(zhuǎn)化E.coliDH5α。篩選陽(yáng)性菌落，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定后進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒用Hind III和NdeI酶切后，回收目的片段，連接至用相同雙酶切后的pET-28a(+)載體中，轉(zhuǎn)化E.coliBL21，在含卡那霉素(50 μg/mL)的LB平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

1.3.2β-半乳糖苷酶的異源表達(dá)

挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子于4 mL LB(含50 μg/mL卡那霉素)培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，以2%的接種量轉(zhuǎn)接到40 mL相同培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液OD600達(dá)到0.5～0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度0.1 mmol/L，30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h后，離心收集細(xì)胞。用磷酸緩沖溶液(50 mmol/L，pH 7.0)懸浮細(xì)胞，超聲破碎細(xì)胞，于4 ℃下，12 000 r/min離心15 min，收集上清液作為粗酶液，進(jìn)行酶活測(cè)定及SDS-PAGE分析。

1.3.3β-半乳糖苷酶酶活力及蛋白含量的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[7-8]進(jìn)行β-半乳糖苷酶酶活力及蛋白含量的測(cè)定。人工底物的分光光度法檢測(cè)靈敏度高，不易受干擾，操作方便，本實(shí)驗(yàn)采用oNPG為底物的比色法進(jìn)行β-半乳糖苷酶酶活的測(cè)定。蛋白質(zhì)含量的測(cè)定參照Bradford法，以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.4　 β-半乳糖苷酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)

1.4.1β-半乳糖苷酶的分離純化

利用pET-28a(+)表達(dá)載體在N端所帶His標(biāo)簽，在β-半乳糖苷酶的N端引入His標(biāo)簽，表達(dá)后用親和層析(鎳柱)進(jìn)行純化，純化方法見參照文獻(xiàn)[9-10]，純化后的酶進(jìn)行酶活測(cè)定及SDS-PAGE分析。用所獲得純酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究。

1.4.2β-半乳糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)

1)反應(yīng)溫度、pH對(duì)β-半乳糖苷酶活力的影響將反應(yīng)體系(純酶置于pH 6.0緩沖溶液中)分別在30～70 ℃的水浴鍋中進(jìn)行反應(yīng)，檢測(cè)不同溫度對(duì)β-半乳糖苷酶活力的影響。在最佳反應(yīng)溫度下，將反應(yīng)體系分別置于pH 5.0～9.0的緩沖液(Na2HPO4-KH2PO4緩沖液)中，檢測(cè)反應(yīng)pH對(duì)β-半乳糖苷酶活力的影響

2)β-半乳糖苷酶的熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性酶熱穩(wěn)定性的測(cè)定是取同樣濃度的β-半乳糖苷酶，分別置于30～70 ℃的水浴鍋中，每隔5 h取樣測(cè)定殘余酶活力。酶pH穩(wěn)定性的測(cè)定是取同樣濃度的β-半乳糖苷酶，分別置于不同pH緩沖液中(由磷酸緩沖配制)，于40 ℃保溫放置，每隔5 h取樣測(cè)定殘余酶活力。

3)金屬離子及EDTA的影響為了考察金屬離子對(duì)β-半乳糖苷酶的影響，在酶液中分別添加Cu2+等金屬離子(金屬離子終濃度分別為10 mmol/L和1 mmol/L)，于30 ℃下放置1 h后檢測(cè)β-半乳糖苷酶活力。以未添加離子的酶液作為對(duì)照，考察金屬離子對(duì)酶活力的影響。

4)有機(jī)溶劑的耐受性將該酶放置在體積分?jǐn)?shù)為20%的不同有機(jī)溶劑條件下，定時(shí)取樣測(cè)定殘余酶活力，考察酶對(duì)不同溶劑的耐受性。

1.5　 β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖

1.5.1低聚半乳糖合成初始條件及產(chǎn)率計(jì)算

催化反應(yīng)的初始體系(1 mL反應(yīng)體系)：300 g/L乳糖，加酶量1.0 U(以1 g乳糖計(jì))，pH 6.5的磷酸緩沖液，溫度35 ℃、180 r/min下反應(yīng)，在24 h內(nèi)每隔4 h取樣檢測(cè)低聚半乳糖的合成率。以不加酶的反應(yīng)體系為對(duì)照。

低聚半乳糖合成產(chǎn)率的計(jì)算見式(1)。

(1)

式中：A為反應(yīng)結(jié)束后測(cè)得的葡萄糖、半乳糖和乳糖的總質(zhì)量濃度(g/L)，B為初始反應(yīng)時(shí)添加乳糖的質(zhì)量濃度(g/L)。

1.5.2低聚半乳糖的檢測(cè)

薄層層析(TLC)檢測(cè)條件：轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物點(diǎn)樣于硅膠板，展開劑展開，霧噴顯色劑，于120 ℃顯色。展開劑為V(正丁醇)∶V(乙酸)∶V(水)=8∶4∶1；顯色劑為20% H2SO4配制的0.5%的3,5-二羥基甲苯。

HPLC檢測(cè)條件：色譜柱為Kromasil氨基柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-水溶液(兩者體積比為75∶25)，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器。單糖(葡萄糖和半乳糖)、乳糖、三糖和四糖的保留時(shí)間分別為10.3、14.8、17.3和23.7 min。

2結(jié)果與討論

2.1　 β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌株的篩選

對(duì)保存的耐有機(jī)溶劑微生物菌庫(kù)中的1 632株菌，采用人工底物oNPG為篩選標(biāo)記,產(chǎn)β-半乳糖苷酶的菌株能夠水解oNPG產(chǎn)生黃色的鄰硝基苯酚(oNP)。根據(jù)顯色反應(yīng)篩選，獲得產(chǎn)β-半乳糖苷酶的菌株258株，將初篩菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以乳糖為底物，進(jìn)一步進(jìn)行乳糖轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，利用TLC進(jìn)行篩選，結(jié)果見圖1。由圖1可知：通過篩選獲得具有轉(zhuǎn)糖基活性的β-半乳糖苷酶的菌株6株，其中第6號(hào)菌株為轉(zhuǎn)糖基活性較好的菌株WX1，可作為進(jìn)一步研究的候選菌。通過HPLC檢測(cè)菌株WX1轉(zhuǎn)糖基活性(圖2)，并通過16S rDNA序列分析，該菌株被鑒定為Erwiniabillingiae，命名為ErwiniabillingiaeWX1。

圖1　 轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)產(chǎn)物TLC分析 Fig.1　 Analysis of transgalactosylation products by TLC

1—單糖;2—乳糖;3～4—低聚半乳糖 圖2　 轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)產(chǎn)物HPLC分析 Fig.2　 Analysis of transgalactosylation products by HPLC

2.2　 β-半乳糖苷酶的基因克隆及異源表達(dá)結(jié)果

根據(jù)在GenBank中搜索ErwiniabillingiaeEb661菌中推測(cè)的β-半乳糖苷酶基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增到約1 400 bp的PCR產(chǎn)物，與預(yù)期大小一致。經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeI 和Hind III雙酶切后插入經(jīng)相同酶切的質(zhì)粒pET-28a(+)中得到重組質(zhì)粒pET-gal。圖3為pET-gal雙酶切驗(yàn)證圖。對(duì)pET-gal插入部分測(cè)序表明，ErwiniabillingiaeWX1的β-半乳糖苷酶基因的開放閱讀框(ORF)為1 428 bp，編碼475個(gè)氨基酸，理論相對(duì)分子質(zhì)量為5.2×104。與ErwiniabillingiaeEb661基因組推測(cè)的β-半乳糖苷酶的同源性達(dá)到99%，氨基酸序列一致，但是ErwiniabillingiaeEb661菌β-半乳糖苷酶未曾報(bào)道。將鑒定后的重組質(zhì)粒pET-gal轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，得到重組菌BL21/pET-gal。重組菌BL21/pET-gal經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)條件的初步優(yōu)化，比酶活達(dá)到2.83 U/mL，約為對(duì)照菌BL21/pET酶活力的30倍。利用重組蛋白的His標(biāo)簽進(jìn)行鎳柱親和層析純化后，SDS-PAGE分析顯示純化后的目的蛋白呈單一條帶(圖4)，其表觀相對(duì)分子質(zhì)量約為5.2×104,與推測(cè)的理論相對(duì)分子質(zhì)量一致。純化后比酶活提高20倍，β-半乳糖苷酶回收率達(dá)到10.3%(表1)。首次實(shí)現(xiàn)來源于Erwiniabillingiae菌β-半乳糖苷酶的克隆表達(dá)。

M—標(biāo)準(zhǔn)DNA;1—NdeI+Hind III雙酶切pET-gal結(jié)果； 2—β-半乳糖苷酶基因；3—NdeI+Hind III雙酶切pET-28a結(jié)果 圖3　 pET-gal雙酶切驗(yàn)證圖譜 Fig.3　 Digestion of recombinant plasmid pET-gal

M—標(biāo)準(zhǔn)蛋白;1—BL21/pET上清； 2—BL21/pET-gal上清液；3—純化后的β-半乳糖苷酶 圖4　 重組蛋白的SDS-PAGE電泳 Fig.4　 SDS-PAGE analysis of recombinant plasmid pET-gal

表1　 β-半乳糖苷酶GAL純化參數(shù)

2.3　 β-半乳糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1溫度及pH對(duì)β-半乳糖苷酶的影響及其熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性

圖5為溫度對(duì)β-半乳糖苷酶活力的影響結(jié)果。由圖5可知，β-半乳糖苷酶最適反應(yīng)溫度為55 ℃。比嗜熱脂肪芽胞桿菌XG24的β-半乳糖苷酶的最適溫度65 ℃稍低[11]，與來自米曲霉的β-半乳糖苷酶的最適溫度相似[12]。

圖5　 溫度對(duì)β-半乳糖苷酶活性的影響及其熱穩(wěn)定性 Fig.5　 Optimum temperature and thermal stability of β-galatosidase

pH對(duì)β-半乳糖苷酶活力影響結(jié)果見圖6。由圖6可知，pH對(duì)酶活力的影響顯著。由圖6還可以看出，β-半乳糖苷酶催化體系pH范圍較窄，β-半乳糖苷酶最適反應(yīng)pH為7.0。與來自嗜熱乳酸菌的β-半乳糖苷酶的最適pH相似[13]，乳球菌G2005的β-半乳糖苷酶的最適pH為6.5[14]。

圖6　 pH對(duì)β-半乳糖苷酶活性的影響及其pH穩(wěn)定性 Fig.6　 Optimum pH and pH stability of β-galatosidase

由圖5還可知，在50 ℃以下放置50 h后，酶活力殘留92%以上，該酶在50 ℃以下有很好的熱穩(wěn)定性，與已報(bào)道青霉L7的β-半乳糖苷酶在50 ℃處理5 h酶活殘留80%[13]相比，該酶GAL有很好的熱穩(wěn)定性。由圖6還可知，該酶在pH 5.0～9.0體系中放置50 h后，在各pH體系酶活均殘留90%以上，表明該酶GAL有很好的pH穩(wěn)定性，而嗜熱脂肪芽胞桿菌XG24的β-半乳糖苷酶在pH4.0～7.5處理1 h，其酶活殘留90%[11]。

2.3.2金屬離子及EDTA對(duì)酶活的影響結(jié)果

表2為金屬離子及EDTA對(duì)GAL酶活的影響結(jié)果。由表2可知：在催化體系中若適當(dāng)加入Mg2+、Ba2+、Mn2+及Fe3+離子，可以提高β-半乳糖苷酶GAL的酶活，而Cd3+、Cu2+對(duì)糖苷酶活有一定的抑制作用。與來源于短芽胞桿菌L2004的β-半乳糖苷酶相似[15]。通常，β-半乳糖苷酶的活性中心由2個(gè)酸性氨基酸殘基組成。由表2還可知，EDTA顯著抑制GAL的酶活，可推測(cè)金屬離子對(duì)該β-半乳糖苷酶維持活性結(jié)構(gòu)具有關(guān)鍵作用。

表2　金屬離子及EDTA對(duì) β-半乳糖苷酶活性的影響

2.3.3酶對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性分析

有機(jī)溶劑對(duì)β-半乳糖苷酶活性的影響結(jié)果見圖7。由圖7可知：在體積分?jǐn)?shù)為20%的甲醇、乙醇、丙酮的體系中保溫200 h，酶活無顯著變化，體現(xiàn)了很高的耐受性。其他有機(jī)溶劑體系中保溫200 h，活力保持72%以上，表明該酶對(duì)多種有機(jī)溶劑有很好的耐受性。

圖7　 有機(jī)溶劑對(duì)β-半乳糖苷酶活性的影響 Fig.7　 Effects of organic solvents on the stability of β-galatosidase

圖8　 β-半乳糖苷酶催化乳糖反應(yīng)進(jìn)程曲線圖 Fig.8　 Time course of lactose reaction by β-galatosidase

2.4　 β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖

通過對(duì)反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、底物濃度、酶量等條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化的反應(yīng)條件如下：底物乳糖質(zhì)量濃度400 g/L，酶量1.0 U/g(以1 g乳糖計(jì))，反應(yīng)溫度40 ℃，反應(yīng)16 h,低聚半乳糖產(chǎn)率達(dá)到34%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，而后再延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，產(chǎn)物有少量水解。與巨大芽胞桿菌β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖產(chǎn)率25.68%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))[15]相比有所增高。產(chǎn)率與Aspergillusoryzae的β-D-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖的產(chǎn)率[16]相近。

3結(jié)論

以人工底物oNPG為篩選標(biāo)記初篩,通過乳糖轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)復(fù)篩，成功篩選到1株產(chǎn)β-半乳糖苷酶的菌株ErwiniabillingiaeWX1。該菌的β-半乳糖苷酶基因未曾被報(bào)道,實(shí)現(xiàn)了該菌株的β-半乳糖苷酶的克隆表達(dá)，并對(duì)酶學(xué)性質(zhì)，催化合成低聚半乳糖進(jìn)行了研究。

酶學(xué)性質(zhì)研究表明，β-半乳糖苷酶GAL在溫度為55 ℃、最適pH為7.0時(shí)對(duì)各種有機(jī)溶劑體現(xiàn)了很好的耐受性，同時(shí)具有較好的溫度穩(wěn)定性。

該β-半乳糖苷酶(GAL)轉(zhuǎn)糖基合成低聚半乳糖，經(jīng)過合成條件的初步優(yōu)化，GOS產(chǎn)率達(dá)到34%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。同時(shí)轉(zhuǎn)糖基這個(gè)特性不僅可以用于低聚半乳糖的合成，還可應(yīng)用于生產(chǎn)低乳糖高低聚半乳糖乳制品，解除源于乳糖酶缺乏的乳糖不耐受癥，同時(shí)改善乳制品的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)，具有進(jìn)一步的應(yīng)用開發(fā)前景。

參考文獻(xiàn)：

[1]張莉,李慶章,田雷.β-半乳糖苷酶研究進(jìn)展.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,40(7):128-131.

[2]董藝凝,陳海琴,劉小鳴,等.耐熱β-半乳糖苷酶的研究進(jìn)展.食品工業(yè)科技,2012,33(1):384-387.

[3]Greenberg N A,Mahoney R R.Production and characterization ofβ-galactosidase fromStreptococcusthermophilus.J Food Sci,1982,47(6):1824-1835.

[4]Haki G D,Rakshit S K.Developments in industrially important thermostable enzymes:a review.Bioresour Technol,2003,89(1):17-34.

[5]Sheridan P P,Brenchley J E.Characterization of a salt-tolerant family 42β-galactosidase from a psychrophilic AntarcticPlanococcusisolate.Appl Environ Microbiol,2000,66(6):2438-2444.

[6]Li Lite,Zhang Min,Jiang Zhengqiang,et al. Characterization of a thermostable family 42β-galactosidase fromThermotogamaritime.Food Chem,2009,112(1):844-850.

[7]Peterson G L.Determination of total protein.Methods Enzymol,1983,91(1):86-105.

[8]張敏,江正強(qiáng),唐犖,等.海棲熱袍菌耐高溫β-半乳糖苷酶基因的克隆和表達(dá).微生物學(xué)通報(bào),2007,35(4):507-511.

[9]Nguyen T H,Splechtna B,Krasteva S,et al.Characterization and molecular cloning of a heterodimeric beta-galactosidase from the probiotic strainLactobacillusacidophilusR22.FEMS Microbiol Lett,2007,269(1):136-144.

[10]Nguyen T H,Splechtna B,Yamabhai M,et al.Cloning and expression of the beta-galactosidase genes fromLactobacillusreuteriinEscherichiacoli.J Biotechnol,2007,129(4):581-591.

[11]高兆建,候進(jìn)慧,孫會(huì)剛,等.耐高溫β-半乳糖苷酶的分離純化與酶學(xué)性質(zhì)分析.食品科學(xué),2010,31(23):151-155.

[12]王昌祿,顧曉波.米曲霉β-半乳糖苷酶的性質(zhì)及其水解作用.中國(guó)食品添加劑,2002,1(1):34-37.

[13]黎麗,王瑞明,李丕武,等.一種來源于青霉的β-半乳糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)的研究.中國(guó)食品添加劑,2013(3):121-126.

[14]史應(yīng)武,婁愷,常瑋,等.一株產(chǎn)高溫β-半乳糖苷酶低溫菌株及其酶學(xué)性質(zhì)的研究.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007,33(2):56-58.

[15]王紅妹,肖敏,李正義,等.轉(zhuǎn)糖基β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌篩選和鑒定及酶法催化生成低聚半乳糖.山東大學(xué)學(xué)報(bào):理學(xué)版,2006,41(2):133-139.

[16]許杜丹,楊偉東,柯蕾,等.米曲霉β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的工藝研究.食品添加劑,2006(1):183-189.

(責(zé)任編輯荀志金)