豬鏈球菌2型1910RR蛋白多克隆抗體的制備

程堯　田永祥　劉澤文　周丹娜　段正贏　楊克禮　郭銳　劉威　袁芳艷

摘要：通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了豬鏈球菌2型（Streptococcus suis type2，SS2）1910RR蛋白，并制備了多克隆抗體。結(jié)果表明，豬鏈球菌2型1910RR重組蛋白以上清形式表達(dá)，Western-blot檢測(cè)證實(shí)了1910RR蛋白具有良好的免疫學(xué)活性，1910RR多克隆抗體效價(jià)為1∶4，為進(jìn)一步研究1910RR蛋白功能奠定了良好基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：豬鏈球菌2型（Streptococcus suis type2，SS2）；1910RR蛋白； 原核表達(dá)；多克隆抗體

中圖分類號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）24-6320-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.058

Abstract： The polyclonal antibody of 1910RR protein of Streptococcus suis type 2 was expressed and prepared. The results showed that 1910RR protein was expressed in the supernatant and has good immunological activity. The polyclonal antibodies of rabbit anti 1910RR protein was 1∶4. The preparation of polyclonal antibody was successful and can be used for function research of 1910RR protein.

Key words：Streptococcus suis type 2；1910RR protein；prokaryotic expression； polyclonal antibody

豬鏈球菌2型（Streptococcus suis type2，SS2）是一種重要的人畜共患病原菌，可引起豬的急性敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、肺炎等疾病，并可引起人類腦膜炎、敗血癥等，嚴(yán)重者導(dǎo)致死亡[1，2]。1998年和2005年，江蘇省和四川省人流行感染SS2事件，患者出現(xiàn)中毒性休克綜合征[3]，引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)SS2的廣泛關(guān)注與研究。

SS2毒力因子種類很多，如莢膜多糖（Capsular polysaccha-ride，CPS）、溶菌酶釋放蛋白（Muramidase-released protein，MRP）、胞外因子（Extracellular factor，EF）、溶血素（Suilysin，Sly）等[4，5]。由于不同菌株所具有的毒力因子各不相同，同一種毒力因子在不同菌株中的作用也不一定相同，同時(shí)單獨(dú)研究毒力因子的功能并不能深入解釋SS2的致病機(jī)制，因此研究這些毒力因子在SS2致病過程中是如何受調(diào)控并共同發(fā)揮作用將更為重要[6，7]，廣泛存在于細(xì)菌中的二元調(diào)控系統(tǒng)（Two-component signal transduction system，TCSTS）作為調(diào)節(jié)自身功能和毒力的中樞系統(tǒng)而成為研究熱點(diǎn)。

經(jīng)典的TCS由兩部分組成，組氨酸激酶（Histidine kinase，HK）和反應(yīng)調(diào)控因子（Response regulator，RR）。經(jīng)典的信號(hào)通路包括外界信號(hào)輸入、HK自體磷酸化、RR磷酸化及信號(hào)輸出[8]。1910HK/RR是豬鏈球菌2型的一對(duì)雙組分調(diào)控系統(tǒng)，1910HK接受并傳遞外界信號(hào)刺激，反應(yīng)調(diào)控因子1910RR則負(fù)責(zé)調(diào)控下游目標(biāo)基因的表達(dá)或使目標(biāo)蛋白的功能發(fā)生變換。本試驗(yàn)克隆了豬鏈球菌2型1910rr基因，連接到原核表達(dá)載體pET-30a中，通過表達(dá)條件的摸索，成功獲得分泌性表達(dá)蛋白，制備了兔抗1910RR蛋白的多克隆抗體，為進(jìn)一步研究1910RR蛋白功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

原核表達(dá)質(zhì)粒pET-30a由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)室實(shí)驗(yàn)室保存。Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ/Hind Ⅲ及T4 DNA連接酶、E.coli DH5α、BL21（DE3）、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；六聯(lián)組氨酸純化鎳柱、山羊抗兔IgG、HRP-DAB底物顯色試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；日本大耳兔購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。

1.2 引物設(shè)計(jì)

參照GenBank公布的豬鏈球菌2型05ZYH33的1910rr基因核苷酸序列，用Primer5設(shè)計(jì)一對(duì)引物：上游引物RrI：5′-CGCCGGATCCATGCATAAGATGTTAGTAGTTGAT-3′，下游引物RrII：5′-CGCCAAGCTTTCATTCTGTCTGTAATTGACCGAT-3′。在上、下游引物分別引入BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)。

1.3 1910rr基因的擴(kuò)增

使用合成的引物RrI/RrII擴(kuò)增出1910rr基因后于1%瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察其條帶大小是否符合預(yù)期。

1.4 pET30a-1910rr原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

1910rr基因與pET-30a經(jīng)BamHⅠ/Hind Ⅲ雙酶切處理后，以T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化到E.Coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒后BamHⅠ/Hind Ⅲ雙酶切鑒定，陽性重組質(zhì)粒命名pET30a-1910rr，送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.5 pET30a-1910RR融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將陽性重組質(zhì)粒pET30a-1910rr轉(zhuǎn)化宿主表達(dá)菌株BL21（DE3），挑取單個(gè)菌落接種于LB液體培養(yǎng)基（含25 mg/L卡那霉素）中，37 ℃培養(yǎng)箱過夜，再按1∶100比例轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)1.5 h后加入終濃度為0.8 mmol/L 的IPTG，22 ℃誘導(dǎo)12～16 h。

1.6 pET30a-1910RR融合蛋白的分離與純化

上清的制備：誘導(dǎo)1 L陽性重組質(zhì)粒pET30a-1910rr轉(zhuǎn)化菌，10 000 r/min離心10 min收集菌體，用Buffer A重懸菌體，冰浴條件下超聲波破碎菌體（功率200 W，破碎1 s，停1 s）共破碎30次。裂解后菌液10 000 r/min離心30 min，收集上清。

上清的純化：用平衡液平衡柱子后，將上清加入Ni-NTA Beads中， 充分結(jié)合后加入20 mmol/L咪唑洗滌雜蛋白， 最后用75 mmol/L咪唑洗脫液進(jìn)行洗脫，12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析蛋白純化情況。

1.7 1910RR蛋白多克隆抗體的制備

純化后的1910RR蛋白皮下多點(diǎn)免疫日本大耳兔，14 d免疫一次，首免前采血分離血清用于陰性對(duì)照。首免用弗氏完全佐劑，加強(qiáng)免疫均用弗氏不完全佐劑。前兩次蛋白免疫量為6 mg/只，第3次和第4次免疫時(shí)劑量為12 mg/只。第4次免疫后7 d采血， 用瓊脂糖免疫擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)抗體效價(jià)，達(dá)到預(yù)期效果后，心臟采血后37 ℃靜置1 h，10 000 r/min離心15 min分離血清，-80 ℃保存。

1.8 Western-blot鑒定重組蛋白免疫原性

將純化后的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將重組蛋白條帶轉(zhuǎn)移到NC膜上，5%脫脂奶37 ℃封閉過夜。TBST洗滌3次，每次10 min，以3次免疫后的兔抗1910RR蛋白血清按1∶100稀釋作為一抗。37 ℃孵育1 h， TBST洗滌3次，每次10 min，1∶5 000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，37 ℃作用1 h， TBST洗膜3次，DAB顯色液顯色至蛋白帶清晰，去離子水終止反應(yīng)。

1.9 瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)多克隆抗體效價(jià)

瓊脂平板打孔后，中間孔加入兔抗1910RR蛋白血清，周圍孔加入2倍倍比稀釋的重組蛋白，以此確定最佳抗原濃度；再將確定稀釋好的重組蛋白加入中間孔，周圍加入2倍倍比稀釋的兔抗1910RR蛋白血清，出現(xiàn)沉淀線的最大稀釋度即為抗體效價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 1910rr基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

使用合成的引物RrI/RrII擴(kuò)增1910rr基因。如圖1所示，PCR擴(kuò)增出1 200 bp左右的片段，與預(yù)期片段1 290 bp大小一致。

2.2 重組表達(dá)載體的酶切鑒定

如圖2所示，pET30a-1910rr重組表達(dá)載體經(jīng)BamHⅠ/Hind Ⅲ雙酶切后出現(xiàn)2條帶，分別在5 000 bp左右和1 200 bp左右，與預(yù)期的5 422 bp和1 290 bp條帶大小一致。陽性重組質(zhì)粒pET30a-1910rr經(jīng)北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序，1910rr基因序列完全正確且讀碼框無誤。

2.3 pET30a-1910RR融合蛋白的表達(dá)與純化

用0.8 mmol/L的IPTG分別誘導(dǎo)12～16 h后，轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒pET30a-1910rr的BL21（DE3）均表達(dá)出56 ku的融合蛋白，而且誘導(dǎo)量無明顯差異。以上清形式表達(dá)的重組蛋白和六聯(lián)組氨酸鎳柱結(jié)合后用75 mmol/L咪唑濃度的洗脫液進(jìn)行洗脫。如圖3所示，上清純化前目的蛋白條帶很濃，而純化后的上清無目的蛋白條帶，說明目的蛋白與六聯(lián)組氨酸鎳柱的結(jié)合效果很好；洗脫液里出現(xiàn)明顯目的蛋白條帶，雜帶很少，得到較純凈的目的蛋白。

2.4 Western-blot鑒定重組蛋白免疫原性

將純化后的融合蛋白與重組蛋白免疫4次后的兔血清反應(yīng)，Western-blot驗(yàn)證血清中多克隆抗體的存在。如圖4所示，Western-blot可以檢測(cè)到在56 ku處有一明顯條帶出現(xiàn)，證實(shí)純化后的目的蛋白可被兔血清識(shí)別，多克隆抗體的制備是成功的。

2.5 瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)抗體效價(jià)

瓊脂平板打孔后，中間孔加入兔抗1910RR蛋白血清，周圍孔加入2倍倍比稀釋的重組蛋白，以此確定最佳抗原濃度為1.0 mg/mL。中間孔加1.0 mg/mL的1910RR蛋白，兔抗1910RR蛋白血清以2倍倍比稀釋，檢測(cè)結(jié)果兔抗1910RR蛋白血清效價(jià)為1∶4（圖5）。

3 小結(jié)與討論

豬鏈球菌2型SC19菌株雙組分1910HK/RR缺失后，在TSB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速率明顯變慢，毒力顯著下降，與野生株相比有219個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了變化，其中105個(gè)基因下調(diào)表達(dá)1.5倍以上，114個(gè)基因上調(diào)1.5倍以上[8]。因此，本研究以豬鏈球菌2型1910RR蛋白為研究對(duì)象，通過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)豬鏈球菌2型1910RR蛋白并制備了多克隆抗體，為進(jìn)一步研究1910RR蛋白功能奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白多以無活性的包涵體形式存在，包涵體主要是由于蛋白合成過快、過多、還來不及正確折疊和二硫健未能正確配對(duì)，相互聚積而成[9]。包涵體蛋白大多沒有活性，需要變性復(fù)性，而且純化效果不好。通過降低IPTG濃度、轉(zhuǎn)速、溫度等條件，降低蛋白的合成速率，可以在一定程度上增加蛋白的可溶性表達(dá)[10]。以上清形式表達(dá)的可溶性融合蛋白的His殘基是暴露的，所以其更易與六聯(lián)組氨酸鎳柱結(jié)合，純化效果要比包涵體好，而且不需要變性復(fù)性。在本研究中，重組質(zhì)粒pET30a-1910rr轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株后，通過添加0.8 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)pET30a-1910RR融合蛋白主要以包涵體的形式表達(dá)。通過蛋白表達(dá)溫度的摸索，獲得了在低溫（22 ℃）條件下以上清形式表達(dá)的pET30a-1910RR融合蛋白。

Western-blot鑒定結(jié)果表明，制備的融合蛋白pET30a-1910RR抗血清可以與重組蛋白反應(yīng)，檢測(cè)到血清中相應(yīng)的多克隆抗體，說明重組蛋白具有較好的免疫原性。但是存在一些雜帶，這在多克隆抗體的制備中是比較常見的，因?yàn)閼?yīng)用動(dòng)物免疫方法制備的多克隆抗體通常含有針對(duì)其他無關(guān)抗原的抗體和血清中其他蛋白質(zhì)成分。

本研究通過原核表達(dá)豬鏈球菌2型雙組分調(diào)控系統(tǒng)1910HK/RR反應(yīng)調(diào)控蛋白1910RR，免疫SPF日本大耳兔，制備了多克隆抗體，為運(yùn)用CHIP-Seq技術(shù)研究雙組分調(diào)控系統(tǒng)1910HK/RR與受調(diào)控基因的作用方式，并獲得與反應(yīng)調(diào)控因子1910RR蛋白結(jié)合的DNA序列及核心位點(diǎn)奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

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