玉米螟高毒力生防菌株篩選與發(fā)酵工藝研究

周榮華　廖先清　劉芳　張志剛　饒犇

摘要：以玉米螟（Pyrausta nubilalis）為對(duì)象篩選出一株高毒力生防菌株蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）NBIC380。通過培養(yǎng)基優(yōu)化，獲得適宜的培養(yǎng)基配方D。補(bǔ)料發(fā)酵研究的結(jié)果表明，固定氮源濃度為80 g/L，發(fā)酵前期補(bǔ)料效果明顯，補(bǔ)料速率為根據(jù)發(fā)酵不同階段進(jìn)行調(diào)整，可以取得更好的發(fā)酵結(jié)果，有利于提高產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。

關(guān)鍵詞：玉米螟（Pyrausta nubilalis）；生防菌株；發(fā)酵

中圖分類號(hào)：S433.4；Q813.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）24-6248-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.039

Abstract： A biocontrol strain Bacillus thuringiensis NBIC380 with high virulence to Pyrausta nubilalis was obtained. According to this strain， appropriate media formulations D was obtained by medium optimization. Fed-batch fermentation experiments showed fermentation pre-feeding effect was obvious by using 80 g/L nitrogen concentration. Feeding rate was adjusted according to the different stages of fermentation. This strategy could improve production and reduce production costs.

Key words： Pyrausta nubilalis； biocontrol strain； fermentation

玉米螟（Pyrausta nubilalis）是世界性害蟲[1]，在中國(guó)各玉米產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，使用化學(xué)防治帶來的農(nóng)藥殘留危及食品安全，尤其是隨著鮮食玉米消費(fèi)量的不斷上升，使得問題更是突出。20世紀(jì)60年代，國(guó)內(nèi)就開始嘗試采用Bt制劑拌土或細(xì)砂后灌心，或者使用飛機(jī)噴霧防治玉米螟低齡幼蟲[2，3]。市面上多數(shù)Bt制劑產(chǎn)品對(duì)玉米螟幼蟲都有一定的效果，但沒有以玉米螟為靶標(biāo)進(jìn)行篩選的專用菌種[4，5]。為此，本研究旨在建立以玉米螟初孵幼蟲為靶標(biāo)的高毒力菌株篩選體系，并開展其工程化技術(shù)研究開發(fā)[6，7]。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：Bt菌種1～15號(hào)，均由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心自行分離并保存，均可用于Bt產(chǎn)品生產(chǎn)。對(duì)照菌株MP-18，由湖北康欣農(nóng)用藥業(yè)有限公司提供。

供試蟲：玉米螟采自黑龍江省，由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心養(yǎng)蟲室保種并培養(yǎng)，提供供試初孵幼蟲。

培養(yǎng)基A、B、C、D均為湖北康欣農(nóng)用藥業(yè)有限公司篩選優(yōu)化的Bt生產(chǎn)用培養(yǎng)基。分批發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源濃度為25 g/L，氮源濃度為55 g/L，pH 6.5～7.0。補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基起始碳源濃度 15 g/L，氮源濃度80 g/L，pH 6.5～7.0。

1.2 方法

1.2.1 混菌法 參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19567.1-2004中棉鈴蟲生物測(cè)定方法進(jìn)行。

1.2.2 分批發(fā)酵方法 從斜面上接一環(huán)菌入搖瓶種子培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后期，以5%接種量接入400 L種子發(fā)酵罐中，裝料240 L，罐壓0.02 MPa，在發(fā)酵過程中通過空氣流量及攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)溶氧進(jìn)行控制， pH不予控制。鏡檢觀察，種子長(zhǎng)到合適的階段后，壓入5 t罐繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，待晶體形成并脫落1%～5%，放罐。

1.2.3 補(bǔ)料發(fā)酵方法 前期的補(bǔ)料發(fā)酵在500 mL三角瓶中進(jìn)行。小試在20 L不銹鋼自動(dòng)發(fā)酵罐中進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵。中試在生產(chǎn)車間5 000 L發(fā)酵罐中進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵。小試發(fā)酵過程中各種數(shù)據(jù)電腦監(jiān)控記錄， pH、溶氧由pH電極和溶氧電極在線檢測(cè)，攪拌轉(zhuǎn)速在100～500 r/min內(nèi)無級(jí)調(diào)速，投料體積12 L；培養(yǎng)基121 ℃滅菌30 min，通氣量2 m3/h。

搖瓶補(bǔ)料發(fā)酵：氮源一次添加，補(bǔ)加碳源為液化淀粉，維持總碳源濃度為30 g/L，發(fā)酵12 h補(bǔ)加剩余碳源，培養(yǎng)至孢晶20%分離時(shí)下?lián)u床。

20 L及5 000 L發(fā)酵罐補(bǔ)料發(fā)酵：根據(jù)pH變化確定補(bǔ)料時(shí)機(jī)，當(dāng)?shù)矸垡夯瓿?、pH即將回升、有機(jī)酸等中間代謝積累物開始快速被利用時(shí)，開始補(bǔ)料。此時(shí)細(xì)胞對(duì)氧的需求加大，生長(zhǎng)速度加快。補(bǔ)料開始時(shí)，降低培養(yǎng)溫度，由起始31 ℃降為28 ℃培養(yǎng)，降低生長(zhǎng)速率，緩解菌體急劇生長(zhǎng)時(shí)供氧與需氧的矛盾，延長(zhǎng)對(duì)數(shù)期；根據(jù)溶氧確定轉(zhuǎn)速的調(diào)控，起始轉(zhuǎn)速為300 r/min，當(dāng)溶氧急劇下降時(shí)，將轉(zhuǎn)速調(diào)為500 r/min；根據(jù)還原糖濃度確定補(bǔ)料速度，采用蠕動(dòng)泵自動(dòng)控制，補(bǔ)料開始時(shí)菌體量較小，補(bǔ)料周期為30 s泵1 s，當(dāng)糖的利用速率大于補(bǔ)糖速率時(shí)，逐步提高補(bǔ)料速率，補(bǔ)料周期最高調(diào)至10 s泵1 s，當(dāng)還原糖含量開始積累時(shí)，停止補(bǔ)料，此時(shí)生長(zhǎng)速率減緩，第14 h停止補(bǔ)料。后期補(bǔ)料將會(huì)導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物殘留過多，芽孢形成率過低。小試?yán)萌鋭?dòng)泵控制補(bǔ)料速率，中試通過400 L罐閥門的開合大小控制補(bǔ)料速率。

1.2.4 分析方法 pH和溶氧利用梅特勒電極在線測(cè)定；發(fā)酵液中還原糖采用艾科精儀血糖儀測(cè)定；含固量采用冷凍干燥法測(cè)定；毒力測(cè)定以玉米螟二齡幼蟲、棉鈴蟲初孵幼蟲為試蟲，采用人工飼料混合法測(cè)定Bt發(fā)酵培養(yǎng)物的LC50；伴孢晶體蛋白含量采用SDS-PAGE法進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 高毒力菌株篩選

以玉米螟初孵幼蟲為試蟲，對(duì)15株保存的高毒力Bt菌株的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)物進(jìn)行了毒力測(cè)定，結(jié)果見表1。綜合3次生測(cè)結(jié)果，選取毒力相對(duì)較高的1號(hào)、6號(hào)和8號(hào)菌株進(jìn)行下一輪菌種篩選和培養(yǎng)基的優(yōu)化。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

選取第一輪篩選出的毒力較高的1號(hào)（NBIC-487）、6號(hào)（NBIC-380）、8號(hào)（NBIC-1586）3個(gè)菌株，采用已有的A、B、C、D 4種Bt發(fā)酵配方，分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，取發(fā)酵液進(jìn)行玉米螟二齡幼蟲的生物測(cè)定，以下是3次重復(fù)生測(cè)的結(jié)果。

結(jié)果表明，BtNBIC-380菌株在4種配方上的表現(xiàn)均優(yōu)于其他菌株，BtNBIC-380和BtNBIC-1586菌株在D配方上的表現(xiàn)均優(yōu)于其他3種配方，它們的殺蟲毒力均為現(xiàn)有生產(chǎn)菌株的9～10倍，故以Bt NBIC-380菌株、D配方進(jìn)入下一步研究。

2.3 搖瓶補(bǔ)料發(fā)酵

2.3.1 不同初始碳源濃度對(duì)搖瓶補(bǔ)料分批發(fā)酵和毒力的影響 氮源一次添加，補(bǔ)加碳源為液化淀粉，維持總碳源濃度為30 g/L，發(fā)酵12 h時(shí)補(bǔ)加剩余碳源，培養(yǎng)至孢晶20%分離時(shí)下?lián)u床，取適量進(jìn)行棉鈴蟲的生物測(cè)定和晶體蛋白含量測(cè)定。結(jié)果（表2）顯示，搖瓶發(fā)酵同步率為95%，生物測(cè)定效價(jià)為5 344 IU/μL，晶體蛋白含量為4.0 mg/mL。

2.3.2 不同補(bǔ)加碳源方式對(duì)搖瓶補(bǔ)料分批發(fā)酵和毒力的影響 初始碳源濃度為18 g/L，氮源一次添加，補(bǔ)加碳源為液化淀粉，維持總碳源濃度為30 g/L，分別在發(fā)酵不同時(shí)間補(bǔ)加剩余碳源，培養(yǎng)至孢晶20%分離時(shí)下?lián)u床，取適量進(jìn)行棉鈴蟲的生物測(cè)定和晶體蛋白含量測(cè)定。從表3可以看出，在8 h開始補(bǔ)，分兩次補(bǔ)加效果較好，發(fā)酵效價(jià)略有提高，與對(duì)照（CK）比，晶體蛋白含量提高約10%。

2.4 Bt NBIC-380菌株20 L罐分批發(fā)酵

Bt NBIC-380高毒力菌株在20 L發(fā)酵罐中的分批發(fā)酵與其他菌株有很多相似之處（圖2），由于糖的代謝，pH的變化呈現(xiàn)雙峰，發(fā)酵末期pH逐步升高，溶氧（DO）在發(fā)酵開始后迅速下降，在14 h左右達(dá)最低點(diǎn)。泡沫在早期較多，到一定時(shí)間后逐漸消失。根據(jù)發(fā)酵的特點(diǎn)，在12～22 h將攪拌轉(zhuǎn)速提高到700 r/min，可有效地防止發(fā)酵過程中溶氧掉零，保證正常的Bt代謝。

2.5 Bt NBIC-380菌株20 L罐補(bǔ)料發(fā)酵工藝研究

2.5.1 氮源濃度為60 g/L的補(bǔ)料發(fā)酵 如圖3所示，發(fā)酵開始5 h后pH止跌緩慢回升，還原糖濃度較低，0.432 g/L時(shí)開始補(bǔ)料，補(bǔ)料所用碳源為葡萄糖，濃度為400 g/L，蠕動(dòng)泵補(bǔ)料周期為30 s泵1 s，補(bǔ)料后還原糖濃度上升，pH下降。7.5 h pH止跌緩慢回升，還原糖濃度停止回升，調(diào)整補(bǔ)料周期為20 s泵1 s。10 h因菌體生長(zhǎng)迅速，還原糖濃度下降，調(diào)整補(bǔ)料周期為10 s泵1 s，14 h還原糖濃度較高，停止補(bǔ)料，共補(bǔ)糖400 g。31 h取樣鏡檢：20%晶體脫落，孢囊形成率90%以上，停止培養(yǎng)，放罐。

2.5.2 氮源濃度為80 g/L的補(bǔ)料發(fā)酵 如圖4所示，發(fā)酵開始5.5 h后pH止跌緩慢回升，還原糖濃度較低，0.432 g/L時(shí)開始補(bǔ)料，補(bǔ)料所用碳源為葡萄糖，濃度為600 g/L，蠕動(dòng)泵補(bǔ)料周期為30 s泵1 s，補(bǔ)料后還原糖濃度上升，pH下降。7.5 h pH止跌緩慢回升，還原糖濃度停止回升，調(diào)整補(bǔ)料周期為20 s泵1 s。10.5 h因菌體生長(zhǎng)迅速，還原糖濃度下降，調(diào)整補(bǔ)料周期為10 s泵1 s，14.5 h還原糖濃度較高，停止補(bǔ)料，共補(bǔ)糖540 g。35 h取樣鏡檢：10%晶體脫落，孢囊形成率90%以上，停止培養(yǎng)，放罐。

對(duì)補(bǔ)料發(fā)酵得到的培養(yǎng)物的毒力、蛋白含量及含固量等進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見表4。由表4可知，通過補(bǔ)料發(fā)酵可提高發(fā)酵液的毒力和蛋白含量。以氮源濃度為80 g/L的補(bǔ)料發(fā)酵，晶體蛋白含量較分批發(fā)酵提高29%，毒力提高36.7%。表明補(bǔ)料發(fā)酵在提高Bt發(fā)酵水平、降低生產(chǎn)成本具有巨大的潛力。

3 小結(jié)與討論

不同Bt菌株對(duì)玉米螟的毒力相差懸殊，Bt NBIC-380菌株為湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心當(dāng)前保存的對(duì)玉米螟毒力最高的Bt菌株，具有明顯的商業(yè)開發(fā)價(jià)值。

同一菌株，不同培養(yǎng)基，獲得的培養(yǎng)物對(duì)玉米螟的毒力相差非常明顯，這一點(diǎn)與發(fā)酵工業(yè)中其他產(chǎn)品生產(chǎn)有所不同。因此，在微生物農(nóng)藥研究開發(fā)中，一味追求某種單一物質(zhì)的產(chǎn)量可能會(huì)進(jìn)入誤區(qū)。

芽孢桿菌發(fā)酵周期一般較短，較少采用補(bǔ)料發(fā)酵，但補(bǔ)料發(fā)酵對(duì)芽孢桿菌生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量提升、單罐效率提高和成本降低同樣有重要作用。

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