新型香豆素類酰腙－銅配合物對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的體內(nèi)外抑制作用

新型香豆素類酰腙—銅配合物對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的體內(nèi)外抑制作用

陸勤1，歐秋霞2，朱文嬌1，朱濤峰1

(1宜興市人民醫(yī)院，江蘇宜興214200；2宜興市和橋醫(yī)院)

摘要：目的觀察新型香豆素類酰腙—銅配合物(以下縮寫為CCCD)在體內(nèi)外對(duì)肺癌A549細(xì)胞的抑制作用，并探討其機(jī)制。方法培養(yǎng)肺癌A549細(xì)胞，分別加入5、10、20、30、50、80、120、160 μmol/L的CCCD，干預(yù)72 h后，采用MTT法，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(IR)。將A549細(xì)胞分為干預(yù)組、對(duì)照組，干預(yù)組分別加入10、20、40 μmol/L CCCD，對(duì)照組加入PBS，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況并計(jì)算細(xì)胞凋亡率，采用Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)。取18只裸鼠建立肺癌荷瘤鼠模型，分為觀察1組、觀察2組、對(duì)照組，每組各6只，分別予尾靜脈注射4、8 mg/kg CCCD及PBS，1次/周，共干預(yù)3周，干預(yù)結(jié)束后測(cè)算各組腫瘤體積并計(jì)算抑瘤率。隨后處死各組裸鼠，取瘤體組織，應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)各組腫瘤細(xì)胞凋亡情況并計(jì)算凋亡指數(shù)(AD)。結(jié)果加入5、10、20、30、50、80、120、160 μmol/L CCCD后，A549細(xì)胞IR分別為8.80%、16.52%、37.24%、55.75%、77.22%、87.16%、95.25%、98.70%，隨著藥物濃度增高，IR呈增高趨勢(shì)。干預(yù)組加入10、20、40 μmol/L CCCD后，細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組(P均<0.05)。干預(yù)組Caspase-3蛋白表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)。觀察1組、觀察2組、對(duì)照組AD分別為16.83%±8.44%、24.65%±11.24%、3.30%±2.12%，各組間比較P均<0.05。觀察1組、觀察2組抑瘤率分別為51.08%、56.78%。結(jié)論 CCCD在體內(nèi)外均可抑制肺癌A549細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與經(jīng)Caspase-3途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞：肺癌；香豆素類酰腙酰腙—銅配合物；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.42.006

中圖分類號(hào)：R734.2；R979.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

基金項(xiàng)目：江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)臨床科技發(fā)展

作者簡(jiǎn)介：第一陸勤(1981-)，女，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)榉伟┑脑\斷與治療。E-mail: luqinyx@sina.com

作者簡(jiǎn)介：通信朱濤峰(1983-)，女，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)榉伟┑脑\斷與治療。E-mail: 48506822@qq.com

收稿日期：(2015-07-01)

Inhibitory effect of new copper (Ⅱ) complex with coumarin derivatives

on lung cancer cells A549 in vivo and vitro

LUQin1, OU Qiu-xia, ZHU Wen-jiao, ZHU Tao-feng

(1YixingPeople′sHospital,Yixing214200,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the inhibitory effect of a new copper (Ⅱ) complex with coumarin derivatives (CCCD) on lung cancer cell line A549 in vivo and in vitro and to investigate the mechanism. MethodsThe lung cancer A549 cells were cultured and were treated with 5, 10, 20, 30, 50, 80, 120, 160 μmol/L CCCD for 72 h, then the inhibition rate (IR) of tumor cells was calculated by using MTT assay. A549 cells were divided into the intervention group which was treated with 10, 20 and 40 μmol/L CCCD and the control group which was treated with PBS. The apoptosis and the apoptosis rate were analyzed by flow cytometry, and the expression of caspase-3 was detected by Western blotting. Furthermore, 18 tumor-bearing nude mice were divided into the observation group 1, observation group 2 and the control group, which were treated with 4, 8 mg/kg CCCD and PBS once a week for three weeks, and then they were executed to detect the tumor volume and tumor inhibition rate. After that, the tumor tissues were obtained to detect the apoptosis and apoptosis index (AD) by TUNEL method.ResultsThe inhibition rates of A549 cells were 8.80%, 16.52%, 37.24%, 55.75%, 77.22%, 87.16%, 95.25% and 98.70% after being treated with 5, 10, 20, 30, 50, 80, 120 and 160 μmol/L CCCD. The IR showed an increased tendency with the increased concentration of the drugs.And being after treated with 10, 20 and 40 μmol/L CCCD, the apoptosis rate and expression level of caspase-3 in the intervention group were significantly higher than those of the control group (all P<0.05). The AD in the observation groups 1, 2 and the control group were 16.83%±8.44% , 24.65%±11.24% and 3.30%±2.12% (all P<0.05). And the tumor inhibition rates in the observation groups 1 and 2 were 51.80% and 56.78%, respectively. ConclusionsCCCD may inhibit the growth of A549 cells in vivo and in vitro and enhance the apoptosis, and its mechanism might be related to inducing tumor cell apoptosis through activating caspase-3.

Key words: lung carcinoma; copper (Ⅱ) complex with coumarin derivatives; cell proliferation; apoptosis; caspase-3

鉑類抗腫瘤藥物是應(yīng)用最廣泛的化療藥物，但易產(chǎn)生耐藥性，且對(duì)腎臟、肝臟、骨髓及神經(jīng)系統(tǒng)等具有毒副作用，限制了其在臨床上的應(yīng)用[1～3]。設(shè)計(jì)和制備新型、高效、低毒的抗腫瘤藥物已成為抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)。銅是人體中血藍(lán)蛋白的重要組成元素。目前研究顯示，許多有機(jī)銅配合物具有抗腫瘤活性，在體內(nèi)外均對(duì)腫瘤細(xì)胞具有抑制作用[4～7]。香豆素類化合物具有良好的抗腫瘤活性，其抗腫瘤活性的強(qiáng)度與作用時(shí)間及劑量呈正相關(guān)[6～10]。本課題組前期研究中合成了新型香豆素類酰腙—銅配合物(以下縮寫為CCCD)，發(fā)現(xiàn)其在體外能抑制肝癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞及前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[6]。2015年1～6月，我們觀察了CCCD在體內(nèi)外對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制作用，進(jìn)一步探討其抗腫瘤作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物及材料雌性BALB/c裸鼠4周齡18只，體質(zhì)量12～16 g，購(gòu)自揚(yáng)州農(nóng)學(xué)院；肺腺癌A549細(xì)胞購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心；Annexin V/PI檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；TUNEL試劑盒購(gòu)自南京凱基生物有限公司；MTT試劑盒購(gòu)自Sigma公司；Caspase-3抗體購(gòu)自圣克魯斯生物技術(shù)公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自Gibco公司。

1.2CCCD對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用觀察采用MTT法。將A549細(xì)胞以1×105/mL單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，分為干預(yù)組、對(duì)照組及調(diào)零組。干預(yù)組分別加入5、10、20、30、50、80、120、160 μmol/L的CCCD，對(duì)照組不加入CCCD，調(diào)零組僅加入100 μL的培養(yǎng)基而不加入A549細(xì)胞，每組均設(shè)立3個(gè)平行孔。將各組細(xì)胞在37 ℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h每孔加入MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后再加入DMSO 100 μL，振蕩搖勻。采用全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，測(cè)定各孔在570 nm波長(zhǎng)處的光密度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(IR)及半抑制濃度(IC50)值。IR=[1-(干預(yù)組OD值-調(diào)零組OD值)/(對(duì)照組OD值-調(diào)零組OD值)]×100%。用Origin7.0的非線性擬合對(duì)IR曲線進(jìn)行擬合，將IR為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的藥物濃度定義為IC50。

1.3A549細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用AnnexinV/PI流式細(xì)胞術(shù)。將A549細(xì)胞以1×106/mL單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，分為干預(yù)組及對(duì)照組，其中干預(yù)組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。待A549細(xì)胞覆蓋80%板底后，在干預(yù)組3個(gè)復(fù)孔中分別加入10、20、40 μmol/L的CCCD，對(duì)照組加入PBS溶液。48 h后去除上清液，PBS洗滌，胰酶消化離心，加入Binding Buffer中，細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/mL，先后加入Annexin V和PI各5 μL，室溫避光作用30 min后，立即上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.4Caspase-3蛋白表達(dá)檢測(cè)采用Western blot法。細(xì)胞培養(yǎng)及分組方法同1.3。待A549細(xì)胞覆蓋80%板底后，干預(yù)組加入20 μmol/L CCCD，對(duì)照組加入PBS溶液。48 h后去除上清液，PBS洗滌，將A549細(xì)胞胰酶消化離心后，用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核蛋白，對(duì)蛋白樣品進(jìn)行Western blot分析，用Gel-Pro軟件對(duì)條帶進(jìn)行相對(duì)灰度值測(cè)定。

1.5肺癌荷瘤鼠模型制備及CCCD對(duì)腫瘤的抑制作用觀察將A549單細(xì)胞懸液調(diào)整為細(xì)胞密度5×106/mL，以0.1 mL/只注射于裸鼠右側(cè)腋窩皮下，待瘤體生長(zhǎng)至1～2 cm3時(shí)分離出新鮮的魚肉狀腫瘤組織，均勻分割成1 mm3大小組織塊，傳代接種，建立肺癌荷瘤鼠模型。待荷瘤鼠瘤體體積生長(zhǎng)至0.5 cm3左右時(shí)，隨機(jī)分為3組，分別為觀察1組、觀察2組、對(duì)照組，每組各6只。觀察1組、觀察2組及對(duì)照組分別予4、8 mg/kg CCCD及PBS進(jìn)行尾靜脈注射，1次/周，共3周。干預(yù)結(jié)束后1周測(cè)量各組腫瘤短徑(a)及長(zhǎng)徑(b)，計(jì)算腫瘤體積(V=a2×b×0.52)及抑瘤率[抑瘤率=(對(duì)照組平均腫瘤體積-觀察組平均腫瘤體積)/對(duì)照組平均腫瘤體積×100%]。隨后處死所有裸鼠，取皮下瘤體組織，制成10 μm厚的石蠟切片，應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡情況。在400×視野下選擇陽(yáng)性細(xì)胞分布均勻的區(qū)域，連續(xù)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，并計(jì)數(shù)其中熒光標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞，重復(fù)3次，在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)各組移植瘤的凋亡指數(shù)(AD)。AD=凋亡細(xì)胞數(shù)/(凋亡細(xì)胞數(shù)+未凋亡細(xì)胞數(shù))×100%。

2結(jié)果

2. 1A549細(xì)胞生長(zhǎng)抑制情況加入5、10、20、30、50、80、120、160 μmol/L CCCD后，A549細(xì)胞IR分別為8.80%、16.52%、37.24%、55.75%、77.22%、87.16%、95.25%、98.70%，隨著CCCD濃度增高，IR呈增高趨勢(shì)，見圖1。IC50為23.0 μmol/L。

圖1　不同濃度CCCD干預(yù)后A549細(xì)胞IR變化

2.2細(xì)胞凋亡情況干預(yù)組予10、20、40 μmol/L CCCD及PBS干預(yù)后，細(xì)胞凋亡率分別為15.63%±6.57%、30.65%±11.43%、51.90%±16.23%及6.24%±2.52%，干預(yù)組細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組(P均<0.05)。

2.3Caspase-3蛋白表達(dá)干預(yù)組、對(duì)照組的Caspase-3相對(duì)灰度值分別為1.18±0.019、0.22±0.024，干預(yù)組Caspase-3蛋白表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.4AD及抑瘤率觀察1組、觀察2組、對(duì)照組AD分別為16.83%±8.44%、24.65%±11.24%、3.30%±2.12%，各組間比較P均<0.05。觀察1組、觀察2組抑瘤率分別為51.08%、56.78%。

3討論

銅是人體中重要的微量元素，能與蛋白、核酸等生物分子結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)活性。金屬銅有良好的配位特性，金屬銅類配合物可直接作用于脫氧核糖核酸藥物，切斷DNA鏈，抑制癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。目前研究發(fā)現(xiàn)，許多有機(jī)銅配合物具有抗腫瘤活性，有些有機(jī)金屬銅配合物的抗腫瘤活性甚至超過了順鉑[11,12]。

香豆素是一類具有苯駢-δ吡喃內(nèi)酯環(huán)的重要有機(jī)雜環(huán)化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易進(jìn)行化學(xué)合成和修飾，一些香豆素衍生物能夠選擇性作用于腫瘤細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用，且在體內(nèi)的毒性較低。但是天然香豆素存在生物活性低、生物利用度差等缺陷，限制了其臨床應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，以香豆素為先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾后，可增強(qiáng)香豆素的生物學(xué)活性，如香豆素與銅進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾后，制備出的香豆素類酰腙—銅配合物可具備一定的抗腫瘤活性。香豆素衍生銅配合物發(fā)揮抗腫瘤作用主要通過分子水平與蛋白和DNA直接作用，導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)與功能改變，發(fā)生裂解與凋亡，或誘導(dǎo)產(chǎn)生氧自由基，間接引起生物分子的降解等[6～8]。本課題組制備的CCCD能在體外很好地結(jié)合到小牛胸腺DNA上，能促進(jìn)肝癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞及前列腺癌細(xì)胞的凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，干預(yù)組加入不同濃度的CCCD后，隨著藥物濃度增高，IR呈增高趨勢(shì)，提示CCCD可明顯抑制A549細(xì)胞的生長(zhǎng)，且隨著濃度增高，對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用逐漸增強(qiáng)；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，觀察1組、觀察2組抑瘤率分別為51.08%、56.78%，提示CCCD在體內(nèi)也可發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，且隨著藥物濃度增加，抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用增強(qiáng)。

腫瘤發(fā)生的機(jī)制之一是細(xì)胞在正常凋亡過程中失控，導(dǎo)致細(xì)胞不受控制的過度增殖，因此誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是治療腫瘤的途徑之一。目前臨床上應(yīng)用的許多抗腫瘤藥物都具有不同程度的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用[13]，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡己成為腫瘤治療的有效策略[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，干預(yù)組不同濃度的CCCD干預(yù)后，細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組，提示CCCD可明顯誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，并隨著藥物濃度增加，A549細(xì)胞凋亡增多；觀察1組、觀察2組AD均高于對(duì)照組，提示CCCD在體內(nèi)也具有誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的作用，并隨著藥物濃度增加，細(xì)胞凋亡增多。

細(xì)胞凋亡是由眾多的凋亡相關(guān)蛋白參與的細(xì)胞程序性死亡過程。研究發(fā)現(xiàn)，Caspase家族蛋白是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，目前已發(fā)現(xiàn)14種以上Caspase家族成員，其中Caspase-3是該家族中最重要的成員，是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素[15,16]。本研究發(fā)現(xiàn)，干預(yù)組Caspase-3蛋白的表達(dá)高于對(duì)照組，提示CCCD可促進(jìn)Caspase-3活性增加，可能是CCCD發(fā)揮誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用機(jī)制之一。

綜上所述，CCCD在體內(nèi)外均可抑制肺癌A549細(xì)胞的生長(zhǎng)，可能與其促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)，本研究為CCCD應(yīng)用于肺癌的治療提供了依據(jù)。

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