微小RNA－21在小鼠肺成纖維細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的表達(dá)變化及意義

微小RNA-21在小鼠肺成纖維細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的表達(dá)變化及意義

趙紅，姚平波，戴利，何軍，董素素，張平

(南華大學(xué)護(hù)理學(xué)院，湖南衡陽(yáng)421001)

摘要：目的觀察小鼠肺成纖維細(xì)胞炎癥反應(yīng)中微小RNA-21(miR-21)及其下游靶基因含Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶(ADAMTS-1)的表達(dá)變化,并探討其臨床意義。方法體外培養(yǎng)小鼠NIH3T3成纖維細(xì)胞，分為對(duì)照組和TGF-β1組。TGF-β1組加入終濃度為5 μg/L的TGF-β1，分別作用24、48、72、96、120 h。對(duì)照組不加入TGF-β1。收集兩組上清液，采用ELISA法測(cè)定TNF-α、IL-1β、IL-6水平，應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)miR-21及ADAMTS-1的表達(dá)。結(jié)果TGF-β1組24、48、72、96、120 h時(shí)TNF-α、IL-1β、IL-6水平及miR-21表達(dá)均高于對(duì)照組，ADAMTS-1表達(dá)均低于對(duì)照組(P均<0.05或0.01)。結(jié)論 在TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠肺成纖維細(xì)胞的炎癥反應(yīng)中，miR-21表達(dá)增高、ADAMTS-1表達(dá)降低；miR-21可成為預(yù)防和治療肺纖維化新的分子靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；微小RNA；炎癥；成纖維細(xì)胞；肺

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.42.004

中圖分類(lèi)號(hào)：R563.9文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

基金項(xiàng)目：湖南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(14JJ7044)；湖南省教育廳高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目?jī)?yōu)秀青年項(xiàng)目(14B156)。

作者簡(jiǎn)介：第一趙紅(1978-)，女，講師，研究方向?yàn)楹粑鼉?nèi)科疾病的診斷與治療。E-mail: zhaohong779900@163.com

收稿日期：(2015-08-10)

Expression changes of microRNAs-21 in inflammation reaction of

lung fibroblast cells of mice and the significance

ZHAOHong,YAOPing-bo,DAILi,HEJun,DONGSu-su,ZHANGPing

(SchoolofNursing,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression changes of microRNAs-21 (miR-21) and its downstream target genes (a disintegrin and metalloprotease with thrombospond in type 1 motifs, ADAMTS-1) in inflammation reaction of lung fibroblasts cells of mice and the clinical significance. MethodsThe fibroblast cell line NIH3T3 of mic+9e were cultured in vitro and then were divided into the control group and the TGF-β1 group. The TGF-β1 group was added with 5 μg/L TGF-β1 for stimulating 24, 48, 72, 96 and 120 h. The control group was not treated. The supernatant of the two groups was collected at different time points. Using the enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) to detect the levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α), inflammatory cytokine interleukin-1β (IL-1β) and interleukin-6 (IL-6). The cells were collected at different time points. We used the real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (PCR) to detect the expression of miR-21 and ADAMTS-1. Results The expression levels of TNF-a , IL-1β, IL-6 and miR-21 in the TGF-β1 groups at 24, 48, 72, 96 and 120 h were higher than those of the control group; the expression level of ADAMTS-1 was lower than that of the control group (all P<0.05 or P<0.01). Conclusions In the TGF-β1-induced inflammatory responses of lung fibroblast cells of mice, the miR-21 expression is up-regulated, while the ADAMTS-1 expression is down-regulated; miR-21 may be a new molecular target for the prevention and treatment of pulmonary fibrosis

Key words: transforming growth factor -β1; microRNAs-21; inflammation; fibroblast cells; lung

微小RNA(miRNA)是一類(lèi)能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的內(nèi)源性非編碼RNA[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與了機(jī)體免疫及炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，其中miRNA-21(以下簡(jiǎn)稱(chēng)miR-21)與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[2]。但miR-21是否參與肺成纖維細(xì)胞的炎癥反應(yīng)尚不明確。2014年1月～2015年6月，我們檢測(cè)了在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)誘導(dǎo)的小鼠肺成纖維細(xì)胞炎癥反應(yīng)中，miR-21及其下游靶基因含Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶(ADAMTS-1)的變化，探討miR-21在肺纖維化炎癥反應(yīng)中的作用。

1材料與方法

1.1材料小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH3T3購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；鼠 TNF-α、IL-1β、IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Abcam公司；TRIzol購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒購(gòu)于Fermants公司；逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)方法NIH3T3細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM在5%CO2、37 ℃下恒溫培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化、傳代。將細(xì)胞均勻接種在3孔板上，待細(xì)胞亞融合后改用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液同步化饑餓24 h，分為對(duì)照組和TGF-β1組。TGF-β1組在培養(yǎng)基中加入終濃度為5 μg/L的TGF-β1，分別作用24、48、72、96、120 h后收集上清液及細(xì)胞備檢。對(duì)照組不加入TGF-β1。

1.3炎癥因子水平檢測(cè)收集兩組上清液，采用ELISA法測(cè)定TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。

1.4miR-21及ADAMTS-1表達(dá)檢測(cè)收集兩組細(xì)胞，應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)miR-21及ADAMTS-1的表達(dá)。應(yīng)用TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度及純度。按miScriptⅡ反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA?？偡磻?yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件為孵育37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，使用無(wú)酶水稀釋后-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。引物由MRC Gene公司設(shè)計(jì)合成， 配制反應(yīng)混合物。每個(gè)反應(yīng)體系為10 μL，使用羅氏Light Cycler480熒光定量PCR儀檢測(cè)，反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s預(yù)變性，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s重復(fù)40個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；95 ℃15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s制備融解曲線。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算mRNA和ADAMTS-1表達(dá)量，并計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果

TGF-β1組在24、48、72、96、120 h時(shí)TNF-α、IL-1β、IL-6水平及miR-21表達(dá)均高于對(duì)照組，ADAMTS-1的表達(dá)均低于對(duì)照組(P均<0.05或0.01)。見(jiàn)表1。

表1　兩組不同時(shí)間點(diǎn)上清液炎癥因子水平及細(xì)胞miR-21、ADAMTS-1表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，﹟P<0.01。

3討論

肺纖維化疾病的特征為肺間質(zhì)過(guò)多的膠原及細(xì)胞外基質(zhì)沉積，其發(fā)病機(jī)制尚不完全明確。目前認(rèn)為，肺纖維化與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、肺損傷等密切相關(guān)[3]。炎癥反應(yīng)在肺纖維化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可通過(guò)TGF-β/Smad信號(hào)通路活化核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)促炎因子如TNF-α、IL-β、IL-6大量表達(dá)，最終可導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生[4]。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可誘導(dǎo)大鼠肺成纖維細(xì)胞TNF-α、IL-β、IL-6表達(dá)增高，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[1,5]。本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1組24、48、72、96、120 h時(shí)TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)均高于對(duì)照組，提示TGF-β1誘導(dǎo)了大鼠肺成纖維細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

miRNAs參與機(jī)體內(nèi)炎癥過(guò)程的調(diào)節(jié)，并與肺纖維化有關(guān)。郭東等[6]研究發(fā)現(xiàn)，miR-21表達(dá)增高可減少TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，提示過(guò)表達(dá)miR-21可影響心臟成纖維細(xì)胞的增殖與分化。研究表明，多種miRNAs可通過(guò)炎癥反應(yīng)參與肺纖維化過(guò)程，如miR-155、miR-149等[7～9]。

miR-21是與纖維化疾病密切相關(guān)的miRNA，在多種器官纖維化的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。劉理靜等[9～11]研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在博萊霉素誘導(dǎo)的纖維化小鼠組織和NIH3T3細(xì)胞中均呈高表達(dá)，使用miR-21反義探針可以顯著減輕博來(lái)霉素引起的小鼠肺纖維化，提示miR-21在肺纖維化小鼠肺組織中表達(dá)上調(diào)，miR-21高表達(dá)可促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)分化以及膠原蛋白的合成。本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1組24、48、72、96、120 h時(shí)miR-21的表達(dá)均高于對(duì)照組，提示TGF-β1可上調(diào)成纖維細(xì)胞miR-21表達(dá)，可能與炎癥反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)。

ADAMTS-1能夠抑制膠原蛋白聚集和增加細(xì)胞外基質(zhì)分解，在纖維結(jié)締組織形成及平滑肌增生中起重要作用，還可抑制大鼠過(guò)敏性肺炎的纖維化和炎癥過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21對(duì)肺纖維化的演化及推動(dòng)作用與TGF-β1/ADAMTS-1信號(hào)通路密切相關(guān)[12～14]。miR-21可通過(guò)調(diào)控ADAMTS-1參與小鼠肺纖維化過(guò)程[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1組24、48、72、96、120 h時(shí)miR-21表達(dá)均增高、ADAMTS-1表達(dá)均降低，提示miR-21的上調(diào)及ADAMTS-1的下調(diào)可能參與了TGF-β1刺激后肺纖維化的發(fā)生過(guò)程，可能與兩者均參與對(duì)肺纖維化的調(diào)控有關(guān)。

綜上所述，在TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠肺成纖維細(xì)胞的炎癥反應(yīng)中，miR-21表達(dá)增高，miR-21有望成為預(yù)防和治療肺纖維化的新的分子靶點(diǎn)。然而，miR-21對(duì)炎癥因子表達(dá)的影響及其調(diào)控機(jī)制尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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