銀杏酮酯對(duì)缺血性卒中患者血漿促炎因子及認(rèn)知功能的作用研究

程弘禹，張新江，李?yuàn)檴櫍瑒⒈?，邵淵，徐運(yùn)，張梅娟

缺血性卒中的高發(fā)病率、高致殘率、高病死率給社會(huì)和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)[1-2]。缺血性卒中也是導(dǎo)致血管性認(rèn)知功能損害的重要原因，研究顯示，17%～92%的卒中患者會(huì)出現(xiàn)輕度認(rèn)知功能損害[3]。腦缺血后腦免疫炎癥反應(yīng)在腦缺血損傷及血管性癡呆形成的病理生理機(jī)制中具有重要作用[4]。

銀杏葉提取物是一種來自于銀杏葉中的植物藥。黃酮類和萜類內(nèi)酯為銀杏葉提取物的主要有效成分，其在抗氧化、改善腦血流、保護(hù)心腦血管等方面具有重要的作用[5-7]，在抑制炎癥反應(yīng)方面，也有相關(guān)基礎(chǔ)研究的報(bào)道。2005年，Jiao等[8]研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物可顯著降低動(dòng)脈粥樣硬化大鼠腦組織中炎癥因子白細(xì)胞介素（interleukin，IL）1β和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）的信使核糖核酸及蛋白水平，提高抗炎因子IL-10及其受體的水平；隨后，有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)報(bào)道銀杏酮酯可以降低大鼠海馬組織IL-1β和TNF-α的水平[9-10]。本研究組前期多中心大樣本臨床研究結(jié)果顯示，在急性缺血性卒中患者中，銀杏酮酯分散片聯(lián)合阿司匹林治療組短期的神經(jīng)功能、180 d認(rèn)知功能均顯著優(yōu)于單用阿司匹林治療組。本文的目的是研究銀杏酮酯保護(hù)缺血性卒中的機(jī)制是否與調(diào)控外周炎癥反應(yīng)有關(guān)。目前尚未見與這一研究相關(guān)的報(bào)道。

1 對(duì)象與方法

本研究采用前瞻性、多中心臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)方法。

1.1 研究對(duì)象 2012年10月-2014年6月在南京鼓樓醫(yī)院和揚(yáng)州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的急性缺血性卒中患者。計(jì)劃共入組60例，其中試驗(yàn)組和對(duì)照組各30例，由電腦編號(hào)并隨機(jī)抽取。

入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡在18～80歲；②發(fā)病7 d之內(nèi)，臨床及影像診斷為急性缺血性卒中[11]；③急性卒中治療低分子肝素試驗(yàn)（Trial of Org 10 172 In Acute Stroke Treatment，TOAST）分型為大動(dòng)脈粥樣硬化性卒中；④入組時(shí)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）評(píng)分為4～20分；⑤首次發(fā)病，或既往有缺血性卒中病史，但本次發(fā)病前NIHSS評(píng)分＜4分；⑥根據(jù)病情，患者需要接受抗血小板聚集藥物治療；⑦意識(shí)清晰，且無全身嚴(yán)重并發(fā)癥；⑧患者及家屬知情同意，并簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠或哺乳期；②神經(jīng)影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)顱內(nèi)出血者；③既往有自發(fā)性顱內(nèi)出血或蛛網(wǎng)膜下腔出血病史者；④缺血性卒中類型為非大動(dòng)脈粥樣硬化性；⑤存在對(duì)抗血小板聚集藥物治療禁忌證者；⑥合并有嚴(yán)重的心、肺、肝、腎功能不全者；⑦合并有嚴(yán)重的精神疾患；⑧合并有重要臟器感染，或其他嚴(yán)重全身感染者，或傳染性疾病；⑨難以控制的高血壓，即經(jīng)過正規(guī)降壓治療后，血壓仍≥180/110 mmHg者；⑩自身免疫病，近期大手術(shù)病史，腫瘤等相關(guān)疾病。

1.2 分組及藥物治療方案 分成試驗(yàn)組和對(duì)照組兩組，入組患者按1∶1等量隨機(jī)分配至試驗(yàn)組30例、對(duì)照組30例。

給藥方案：試驗(yàn)組：銀杏酮酯分散片聯(lián)合阿司匹林治療，用法為銀杏酮酯分散片，口服，每日3次，每次0.15 g；阿司匹林腸溶片，口服，每日1次，每次0.1 g。對(duì)照組僅服用阿司匹林腸溶片，每日1次，每次0.1 g。兩組均連續(xù)用藥180 d。

合并用藥：伴有高血壓、糖尿病、高脂血癥的患者根據(jù)病情應(yīng)用相關(guān)降壓、降糖、調(diào)脂藥物。禁用藥物：腦保護(hù)劑尼莫地平、吡拉西坦、奧拉西坦（因此類藥物可能會(huì)影響前期認(rèn)知功能評(píng)分試驗(yàn)），凝血酶抑制劑阿加曲班（因同抗血小板聚集藥物合用可能會(huì)增加出血概率），其他銀杏葉制劑等。

1.3 炎癥因子的檢測(cè)方法 用藥前、用藥后（13±1）d分別抽取患者空腹靜脈血，離心留取上清液，保存于-80℃冰箱。血清炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-15、IL-17A、IL-23、TNF-α的檢測(cè)采用人輔助性T細(xì)胞（T helper cells，Th17）MAG-14K-06（Millipore）試劑盒，儀器為Milliplex多功能液相芯片儀（MAGPIX12158001，默克密理博公司）；分析軟件：Milliplex Analyst.V5.1軟件。

1.4 神經(jīng)功能缺損評(píng)估 在治療前及治療后（13±1）d、（30±7）d、（90±7）d、（180±7）d分別完成神經(jīng)功能及認(rèn)知功能量表評(píng)分。采用的量表包括NIHSS評(píng)分、改良Rankin量表（modified Rankin Scale，mRS）評(píng)分（mRS≤2定義為預(yù)后良好）評(píng)估近期和遠(yuǎn)期卒中后神經(jīng)功能缺損；簡(jiǎn)易精神狀態(tài)量表（Minimetal State Examination，MMSE）、蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表（Montreal Cognitive Assessment，MOCA）評(píng)估認(rèn)知水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以）來表示，其中組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)。所有假設(shè)檢驗(yàn)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，以P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料和臨床特征 研究計(jì)劃共入組60例，其中試驗(yàn)組和對(duì)照組各30例，因采集的血清標(biāo)本出現(xiàn)溶血而剔除8例，其中試驗(yàn)組3例，對(duì)照組5例，脫落率為13.33%，故最終納入統(tǒng)計(jì)分析的試驗(yàn)組27例，對(duì)照組25例。

兩組患者用藥前性別、年齡、既往卒中病史、NIHSS評(píng)分、血壓、肝腎功能、凝血四項(xiàng)、血糖、血脂等基線資料，以及血清炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-15、IL-17A、IL-23、TNF-α指標(biāo)的比較均無顯著差異（表1）。

2.2 兩組用藥后有效性比較 兩組受試者在各隨訪時(shí)間點(diǎn)的NIHSS評(píng)分和mRS評(píng)分未見顯著差異（表2）。

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)MMSE、MOCA評(píng)分缺失情況：實(shí)驗(yàn)組用藥前、（13±1）d、（30±7）d脫落2例，（90±7）d、（180±7）d脫落1例；對(duì)照組用藥前、（13±1）d、（30±7）d、（90±7）d各脫落1例。

用藥后（30±7）d、（90±7）d、（180±7）d與用藥前MMSE相比，試驗(yàn)組比對(duì)照組改善更明顯（表3）；而MOCA評(píng)分在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組之間無顯著差異（表4）。

表1 兩組患者基線資料及用藥前血清炎癥因子指標(biāo)的比較結(jié)果

表2 銀杏酮酯治療組與對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)的NIHSS評(píng)分

表3 銀杏酮酯治療組和對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)的MMSE評(píng)分

表4 銀杏酮酯治療組和對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)MOCA評(píng)分

2.3 兩組各隨訪點(diǎn)血清炎癥因子比較 治療后（13±1）d試驗(yàn)組血清IL-1β、IL-6、IL-15、IL-17A、IL-23、TNF-α分別為（1.55±0.43）pg/ml、（5.57±4.96）pg/ml、（1.88±0.82）pg/ml、（5.15±1.51）pg/ml、（0.42±0.88）pg/ml和（15.12±6.97）pg/ml，均較治療前顯著下降，P值分別為＜0.001、P＜0.001、0.042、＜0.001、＜0.001和0.009。對(duì)照組治療（13±1）d血清IL-1β、IL-15、IL-6、IL-17A、IL-23、TNF-α分別為（1.60±0.32）pg/ml、（4.89±4.20）pg/ml、（2.01±0.72）pg/ml、（5.57±1.33）pg/ml、（0.32±0.20）pg/ml和（17.48±9.15）pg/ml，其中IL-15較治療前顯著下降（P=0.036），其余炎性因子較治療前均無顯著差異。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，銀杏酮酯分散片聯(lián)合阿司匹林治療能顯著降低缺血性卒中后患者血清中IL-1β、IL-15、IL-17A、IL-23的表達(dá)水平。表明在其他用藥方案一致的前提下，試驗(yàn)組加用銀杏酮酯分散片可顯著降低血清炎癥因子的水平，提示銀杏酮酯分散片具有明顯的抑炎作用。本實(shí)驗(yàn)首次在卒中患者中證實(shí)了銀杏酮酯分散片能降低人血清Th17分泌的炎癥因子IL-1β、IL-15、IL-17A和IL-23的水平，這為以后銀杏酮酯在炎癥機(jī)制方面的研究開辟了新的思路。

銀杏酮酯分散片有效成分為：銀杏內(nèi)酯B＞2.5%，游離黃酮＞20%，萜類內(nèi)酯＞10%，總黃酮＞44%。近年來，銀杏葉提取物在腦血管疾病中的研究頗多，如銀杏葉提取物可通過抑制缺血性卒中后的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)卒中后神經(jīng)修復(fù)和再生，以減少腦梗死體積，保護(hù)受到缺血損傷的神經(jīng)組織和細(xì)胞[12-16]，但這些研究基本都局限在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域，臨床研究尚未廣泛開展。我們前期試驗(yàn)通過一系列評(píng)分完成了第五代銀杏葉提取物（銀杏酮酯分散片）對(duì)改善急性缺血性卒中患者神經(jīng)功能及其預(yù)后、認(rèn)知執(zhí)行功能的研究，證實(shí)了銀杏酮酯分散片在臨床上治療缺血性卒中的有效性和安全性。本次試驗(yàn)，我們用Milliplex Map多重檢測(cè)技術(shù)來首次檢測(cè)急性缺血性卒中患者通過銀杏酮酯分散片治療短期內(nèi)血清多種炎癥因子的濃度，進(jìn)而從炎癥反應(yīng)角度上為銀杏酮酯在臨床上治療缺血性卒中炎性損傷提供了證據(jù)。

Th17細(xì)胞作為輔助性T細(xì)胞家族中的獨(dú)立于Th1和Th2細(xì)胞亞群，最早于2005年由Park等人和Harrington等人發(fā)現(xiàn)并命名[17-18]，Th17細(xì)胞主要是根據(jù)其產(chǎn)生的效應(yīng)因子IL-17A來定義，除此之外，Th17細(xì)胞還產(chǎn)生IL-17F、IL-21、IL-22及粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）等炎性因子[19]。在卒中后，IL-17A同其受體的結(jié)合則觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的發(fā)生，該信號(hào)即誘導(dǎo)促炎因子如IL-1β、IL-6、CXC趨化因子（CXC chemokines，如CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11）、TNF等炎癥因子，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)[20-21]。臨床研究中發(fā)現(xiàn)，在卒中事件發(fā)生的早期，外周血中IL-17、IL-1β的表達(dá)水平明顯增高，且與卒中的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[22]。在卒中的動(dòng)物模型中，本課題組之前的研究顯示缺血1 d后腦組織中IL-17的核糖核酸水平明顯增高，IL-17水平的增高可以持續(xù)到缺血再灌注后的6 d[23-24]，而阻斷IL-17所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)能減輕缺血性腦損傷[25]。同時(shí)，有證據(jù)表明在癡呆患者血清中IL-17和IL-6高于正常人的水平，提示IL-17可能在癡呆的發(fā)生和發(fā)展中也具有重要的價(jià)值[26-28]。本研究發(fā)現(xiàn)銀杏酮酯可以降低急性缺血性卒中患者血清的IL-17和IL-6水平，提示銀杏酮酯可能通過抑制上述炎癥途徑來保護(hù)患者的認(rèn)知功能。

本組研究未顯示銀杏酮酯對(duì)神經(jīng)功能評(píng)分有明顯的改善，可能與樣本量小有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)亦存在許多不足之處：比如缺少年齡相仿的健康成年人的對(duì)照；同時(shí)，本研究是隨機(jī)分組，但并不是雙盲試驗(yàn)，所以在臨床患者的評(píng)分方面不能完全排除主觀性。因此，需要更大規(guī)模的臨床試驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證。

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【點(diǎn)睛】通過銀杏酮酯分散片聯(lián)合阿司匹林與單用阿司匹林的對(duì)照研究顯示，聯(lián)合用藥可以降低急性缺血性卒中患者急性期體內(nèi)炎性介質(zhì)（白細(xì)胞介素和腫瘤壞死因子）的水平，另外聯(lián)合用藥組較單藥組的認(rèn)知功能有改善趨勢(shì)。