HDAC9基因SNPs與大動(dòng)脈粥樣硬化缺血性卒中的相關(guān)性研究

柳維林，林云嬌，陶靜，彭軍，李光譜，4，陳立典

HDAC9基因位于7號(hào)染色體q21.1，全長(zhǎng)935.47kb，可變剪切產(chǎn)生29種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。HDAC9基因是組蛋白Ⅱ類HDACs家族成員之一，調(diào)控染色體結(jié)構(gòu)和基因轉(zhuǎn)錄[1]。已知HDAC9基因在肌肉、心臟和腦組織中高表達(dá)[2]。近年研究表明，該基因與大動(dòng)脈粥樣硬化性（large vessel atherosclerosis，LVD）缺血性卒中相關(guān)聯(lián)。2012年對(duì)歐洲人群缺血性卒中患者進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association study，GWAS）發(fā)現(xiàn)，HDAC9基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）rs11984041位點(diǎn)是大動(dòng)脈粥樣硬化性缺血性卒中的首個(gè)遺傳危險(xiǎn)因子（OR=1.42，95%CI1.28～1.57）[3]。隨后METASTROKE大規(guī)模meta分析發(fā)現(xiàn)HDAC9基因rs2107595位點(diǎn)增加39%患病風(fēng)險(xiǎn)（OR=1.39，95%CI1.27～1.53）[4]。2015年Su等[5]通過1632病例-對(duì)照檢測(cè)rs2107595位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)該等位基因與中國南方漢族人群缺血性卒中患者無相關(guān)。2013年對(duì)漢族人群缺血性卒中患者GWAS分析，發(fā)現(xiàn)HDAC9基因rs2389995（OR=1.33，95%CI1.01～1.75）和rs2240419位點(diǎn)（OR=1.29，95%CI1.02～1.63）與大動(dòng)脈粥樣硬化性缺血性卒中密切相關(guān)[6]。前面歐洲人群GWAS研究通過10個(gè)獨(dú)立隊(duì)列中心大樣本量的驗(yàn)證，而漢族人群僅1個(gè)研究團(tuán)隊(duì)對(duì)237例大動(dòng)脈粥樣硬化性缺血性卒中患者的SNPs進(jìn)行GWAS初篩研究。因此，HDAC9基因不同SNPs對(duì)漢族人群大動(dòng)脈粥樣硬化性缺血性卒中的遺傳易感性仍有待進(jìn)一步研究證實(shí)，且HDAC9基因SNPs在大動(dòng)脈粥樣硬化性缺血性腦卒中的作用機(jī)制目前知之甚少。本研究利用國際人類基因組單體型圖計(jì)劃（the international HapMap project，HapMap）公布的北京漢族人群（Han Chinese in Beijing，China，CHB）信息，對(duì)HDAC9基因的最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）、連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）、單體域（haplotype block）、單體型頻率和標(biāo)簽SNPs（haplotype tagging SNPs，htSNPs）以及HDAC9潛在功能預(yù)測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)程度進(jìn)行分析，旨在為進(jìn)一步關(guān)聯(lián)研究中SNPs的確定及機(jī)制研究提供分析基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 本文研究對(duì)象為千人基因組計(jì)劃所確定的北京漢族樣本45例，信息為該計(jì)劃公布的HDAC9基因SNPs基因型測(cè)定數(shù)據(jù)。

1.2 方法

1.2.1 SNPs確定標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)GWAS發(fā)現(xiàn)HDAC9在大動(dòng)脈粥樣硬化性缺血性卒中的熱點(diǎn)區(qū)域和陽性突變位點(diǎn)集中在末端（3'端）區(qū)域[3]。歐洲和漢族大動(dòng)脈粥樣硬化性缺血性卒中人群中已報(bào)道的4個(gè)SNPs均出現(xiàn)在HDAC9（Chr7：18086949-19002416，ENSG00000048052.17）的末端區(qū)域，如rs11984041（Chr7：189923121）、rs2107595（Chr7：19009765），rs2389995（Chr7：18933395）和rs2240419（Chr7：18935566）。因此，本研究選擇中國漢族人群（CHB，release#27，Chr7）HDAC9（Chr：18930kb-19020kb），長(zhǎng)度為80kb的基因區(qū)域，利用Haploview軟件對(duì)該區(qū)域進(jìn)行信息分析。確定SNPs的標(biāo)準(zhǔn)：基因型測(cè)定率大于80%、Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）、MAF＞0.05。

1.2.2 MAF和LD分析 對(duì)任一給定SNPs位點(diǎn)，MAF的計(jì)算公式為MAF=（2n1+n2）/2N。其中N代表樣本個(gè)體數(shù)，n1表示基因型為最小等位基因純合子的個(gè)體數(shù)，n2表示雜合子的個(gè)體數(shù)[7]。

對(duì)MAF＞5%且滿足Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）的SNPs，進(jìn)行LD plot分析。連鎖不平衡程度采用LD系統(tǒng)D’和SNPs間的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度r2檢驗(yàn)。D’的計(jì)算公式為D’=D/Dmax，其中參數(shù)D=Pij-PiPj，D的最大可能值Dmax=min[Pi（1-Pj），（1-Pi）Pj]，i和j分別代表相鄰的兩個(gè)基因位點(diǎn)，Pi和Pj分別為相應(yīng)基因位點(diǎn)的等位基因頻率。對(duì)任意2位點(diǎn)i和j間r2估計(jì)的計(jì)算公式為r2=2（PAB-PAPB）/PAPaPBPb，其中PA、Pa分別為位點(diǎn)i等位基因和最小等位基因頻率，PB、Pb分別為位點(diǎn)j等位基因和最小等位基因頻率，PAB代表i～j單體型為AB時(shí)的單體型頻率[8]。

1.2.3 單體域構(gòu)建和單體型頻率分析 根據(jù)SNPs的連鎖不平衡程度采用confidence intervals（Gabriel等）（CI）算法[9]、four Gamete rule（FGR）算法[10]和solid spine of LD（SSOL）算法[8]構(gòu)建單體域和單體型頻率的計(jì)算。

1.2.4 htSNPs的選擇標(biāo)準(zhǔn) 取r2≥0.8，兩點(diǎn)最大似然值[11]LOD≥3.0和aggressive-tagging（two- and three- maker）選擇htSNPs。LOD（θ）=LOD10[L（）/L（0.5）]。θ為重組分?jǐn)?shù)，為重組分?jǐn)?shù)估計(jì)值。

1.2.5 htSNPs潛在功能和風(fēng)險(xiǎn)程度 通過SNP function prediction、miRWalk軟件預(yù)測(cè)htSNPs潛在功能和HDAC9基因3'端htSNPs位點(diǎn)與miRNA結(jié)合關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 基本情況 HDAC9末端區(qū)域（Chr7：18930kb-19010kb），共包括75個(gè)SNPs。不符合條件的SNPs共24個(gè)，其中2個(gè)不符合Hardy-Weinberg平衡（P＜0.05），16個(gè)屬于純合子基因型（21.3%），6個(gè)SNPs最小等位基因頻率存在性別差異（P＜0.05）。符合條件的SNPs共51個(gè)（68.0%）。

2.2 單體域及單體型頻率

2.2.1 基于confidence intervals算法的單體域和單體型頻率 基于confidence intervals計(jì)算HDAC9末端區(qū)域（Chr7：18930kb-19010kb）構(gòu)建了11個(gè)單體域（圖1）。分別包含8，5，5，3，2，5，4，3，3，3，9個(gè)單體型，第4，5，9個(gè)單體域兩個(gè)相鄰SNPs發(fā)生完全連鎖（D’=1）；其他單體域以1～4個(gè)單體型為主，累計(jì)頻率88.6%，95.2%，89.9%，66.7%，68.5%，70.8%，84.0%，82.8%（表1）。

圖1 基于confidence intervals計(jì)算HDAC9末端單體域

表1 基于confidence intervals計(jì)算HDAC9的單體型及頻率

圖2 基于four Gamete rule計(jì)算HDAC9末端單體域

表2 基于four Gamete rule計(jì)算HDAC9的單體型及頻率

2.2.2 基于four Gamete rule計(jì)算單體域和單體型頻率 基于four Gamete rule計(jì)算HDAC9末端區(qū)域（Chr7：18930kb-19010kb）構(gòu)建了14個(gè)單體域（圖2）。分別包含6，3，4，5，2，3，3，3，4，5，3，3，3，4個(gè)單體型，第2，3，4，6，7，8，9，12，13個(gè)單體域相鄰SNPs發(fā)生完全連鎖（D’=1）；其他單體域以2～3個(gè)單體型為主，累計(jì)頻率80.9%，73.8%，70.9%，84.0%，97.6%（表2）。

2.2.3 基于solid spine of LD計(jì)算單體域和單體型頻率 基于solid spine of LD計(jì)算HDAC9末端區(qū)域（Chr7：18930kb-19010kb）構(gòu)建了8個(gè)單體域（圖3）。分別包含8，4，6，3，9，4，7，10個(gè)單體型，第2，4個(gè)單體域相鄰SNPs發(fā)生完全連鎖（D’=1）；其他單體域以3～4個(gè)單體型為主，累計(jì)頻率78.5%，88.1%，85.1%，94.7%，71.4%，83.4%（表3）。

2.3 HDAC9重組熱點(diǎn) HDAC9基因Chr7：18930kb-19010kb區(qū)域間發(fā)現(xiàn)一個(gè)重組熱點(diǎn)，rs2717356位點(diǎn)低LD，不在單體域內(nèi)。該位點(diǎn)相對(duì)背景強(qiáng)度增加約40倍（圖4）。

2.4 htSNPs及其特征 符合研究條件的51個(gè)SNPs中，經(jīng)過3種不同連鎖不平衡計(jì)算方法，結(jié)合htSNs選擇的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，30個(gè)SNPs確定為htSNPs，占58.8%（表4）。標(biāo)簽SNPs中，MAF＞0.10組段占100%；MAF＞0.20組段占90%；MAF＞0.30組段占50%；MAF＞0.40組段占20%。

2.5 HDAC9 htSNPs位點(diǎn)與micoRNAs結(jié)合情況以及相關(guān)功能 對(duì)30個(gè)htSNPs通過SNP function prediction預(yù)測(cè)其功能，發(fā)現(xiàn)rs2526630位點(diǎn)位于HDAC9的3’UTR區(qū)域，miRand、miRWalk和Targetscan軟件分析，發(fā)現(xiàn)rs2256630[C/T]結(jié)合has-miR-1184，hsamiR-1273，hsa-miR-190，hsa-miR-545，hsamiR-576-3p，hsa-miR-576-5p，hsa-miR-616，hsa-miR-891a和hsa-miR-922，與神經(jīng)系統(tǒng)病理生理密切相關(guān)，包括神經(jīng)干細(xì)胞分化、血管新生和炎癥、動(dòng)脈硬化等（表5）。

圖3 基于solid spine of LD計(jì)算HDAC9末端單體域

圖4 HDAC9末端重組熱點(diǎn)區(qū)域

表3 基于solid spine of LD計(jì)算HDAC9的單體型及頻率

3 討論

HDAC9主要位于細(xì)胞質(zhì)，但能夠穿梭于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間，調(diào)控組蛋白及非組蛋白的乙?；揎梉25]。作為組蛋白乙?；揎椪{(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)節(jié)因子，使基因啟動(dòng)子不易接近轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，從而抑制轉(zhuǎn)錄。非組蛋白的乙?；腿ヒ阴；胶獾母淖冇绊懠?xì)胞多方面的功能。近1/4的卒中患者屬于由動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致的大血管卒中。大血管卒中與冠狀動(dòng)脈疾病（coronary artery disease，CAD）間有一些共同的風(fēng)險(xiǎn)因素，并且兩者均具有很強(qiáng)的遺傳成分。至今為止，染色體7p21.1處HDAC9基因區(qū)域發(fā)現(xiàn)是與大血管卒中關(guān)系最密切的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)[26]。通過外周血單核細(xì)胞基因表達(dá)的重復(fù)驗(yàn)證研究顯示，大規(guī)模meta分析報(bào)道的動(dòng)脈粥樣硬化缺血性卒中rs2107595風(fēng)險(xiǎn)等位基因（與頸動(dòng)脈斑塊的存在相關(guān)）攜帶者中，HDAC9 mRNA水平增加，但相鄰基因（TWIST1/FERD3L）沒有改變。與HDAC9+/+、ApoE-/-小鼠相比，HDAC9-/-、ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化病變體積顯著降低，并且晚期病變降低。此外，HDAC9-/-、ApoE-/-小鼠動(dòng)脈斑塊內(nèi)，Mac-3陽性巨噬細(xì)胞的比例更高，這可能歸因于晚期病變比例的降低。人類動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的分析顯示，此前rs2107595與特異的斑塊特征無關(guān)[27]。

HapMap計(jì)劃是人類基因組計(jì)劃的延伸，由日本、英國、加拿大、中國、尼日利亞和美國的科學(xué)家們共同合作完成，它向公眾免費(fèi)開放全部數(shù)據(jù)，為基因及病因?qū)W研究提供了基本數(shù)據(jù)。SNPs是病因?qū)W研究中重要的遺傳標(biāo)記，無論對(duì)疾病危險(xiǎn)因子的篩選還是重復(fù)驗(yàn)證性的遺傳關(guān)聯(lián)研究，SNPs的篩選均為研究的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，對(duì)提高研究發(fā)現(xiàn)的把握度和研究效率有至關(guān)重要的意義[28]。

表4 北京漢族人群HDAC9基因18930kb-19010kb區(qū)域的標(biāo)簽SNPs及其MAF值

HapMap計(jì)劃將MAF＞0.05的SNPs作為首要研究目標(biāo)，MAF廣泛應(yīng)用于復(fù)雜疾病的全基因組關(guān)聯(lián)研究。在關(guān)聯(lián)研究中，有研究表明，MAF＞0.01所構(gòu)建的圖譜可捕獲最多的遺傳信息，同時(shí)成本也最高，MAF閾值一般取大于0.05或0.10[29]。本研究顯示HDAC9基因Chr7：18930kb-19020kb區(qū)域共測(cè)定75個(gè)SNPs，其中Hardy-Weinberg平衡P＜0.05，且最小等位基因頻率P＞0.05的SNPs共51個(gè)。對(duì)SNPs進(jìn)行連鎖不平衡及單體域分析有研究推薦采用confidence intervals、four Gamete rule和solid spine of LD3種計(jì)算方法[30]。本研究利用3種計(jì)算方法分別構(gòu)建了11、14和8個(gè)單體域，每個(gè)單體域包括了1～4個(gè)主要單體型。此外，還發(fā)現(xiàn)rs2717356位點(diǎn)低LD，不在單體域內(nèi)，成為HDAC9基因的重組熱點(diǎn)區(qū)域。

表5 rs2526630與miRNA結(jié)合情況

利用標(biāo)簽htSNPs進(jìn)行大樣本量的篩查疾病易感基因SNPs位點(diǎn)或重復(fù)驗(yàn)證，不僅可以大大減少用于基因型與疾病關(guān)聯(lián)分析中SNPs的數(shù)量，還能提高研究效能、降低成本。由于強(qiáng)關(guān)聯(lián)SNPs之間可相互隨機(jī)替代[31]。本研究利用Haploview軟件取r2≥0.8，且LOD≥3.0確定30個(gè)SNPs為htSNPs，且MAF均大于0.10。為進(jìn)一步研究不同人群HDAC9基因SNPs易感位點(diǎn)的篩選或重復(fù)驗(yàn)證提供依據(jù)。因此，今后需要對(duì)漢族其他人群進(jìn)行大動(dòng)脈粥樣硬化卒中患者HDAC9基因易感位點(diǎn)篩選，就可以采用本人所篩選的30個(gè)標(biāo)簽SNPs位點(diǎn)。

此外，對(duì)htSNPs功能分析中，發(fā)現(xiàn)rs2526630位點(diǎn)[C/T]位于HDAC9的3’UTR區(qū)域，與has-miR-1184，hsa-miR-1273，hsamiR-190，hsa-miR-545，hsa-miR-576-3p，hsa-miR-576-5p，hsa-miR-616，hsa-miR-891a和hsa-miR-922，其中hsa-miR-545，hasmiR-576，hsa-miR-616與神經(jīng)系統(tǒng)病理生理密切相關(guān)，包括神經(jīng)干細(xì)胞分化、血管新生和炎癥，動(dòng)脈硬化等息息相關(guān)。因此，本研究推測(cè)hsa-miR-545，has-miR-576，hsa-miR-616作為大動(dòng)脈粥樣硬化缺血性腦卒病理生理機(jī)制研究具有一定的價(jià)值。

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