模擬微重力對NIH3T3細(xì)胞近日節(jié)律基因表達(dá)的影響

模擬微重力對NIH3T3細(xì)胞近日節(jié)律基因表達(dá)的影響*

楊云云楊淑紅劉延友成姝婷后望李世平王正榮

(四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院·衛(wèi)生部時間生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

【摘要】目的探討模擬微重力對NIH3T3細(xì)胞近日節(jié)律基因Per1, Per2與Cry1 mRNA表達(dá)的影響。方法體外培養(yǎng)培養(yǎng)NIH3T3細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。實(shí)驗(yàn)組采用RCCS模擬微重力環(huán)境培養(yǎng)NIH3T3細(xì)胞；而對照組在正常重力環(huán)境下靜置培養(yǎng)。兩組均采用PMA刺激細(xì)胞，RT-qPCR檢測Per1，Per2與Cry1 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果對照組與實(shí)驗(yàn)組的近日節(jié)律基因Per1，Per2與Cry1的mRNA都呈現(xiàn)節(jié)律性。與對照相比，實(shí)驗(yàn)組節(jié)律基因的振幅減小，相位延遲。結(jié)論模擬微重力影響NIH3T3細(xì)胞近日節(jié)律基因Per1，Per2，Cry1的表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】模擬微重力； 近日節(jié)律基因； NIH3T3；

【中圖分類號】R 318.01【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃項(xiàng)目(2011CB71 1000)

通訊作者：劉延友，E-mail：liuyanyou@126.com

收稿日期：( 2015-01-30； 編輯： 張文秀)

The effect of stimulated microgravity on expression of circadian genesYANG Yunyun, YANG Shuhong, LIU Yanyou,etal

(KeyLaboratoryofChronobiology,MinistryofHealth(SichuanUniversity),WestChinaSchoolofPreclinicaland

ForensicMedicine,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of simulated microgravity on circadian genes in NIH3T3 cells. MethodsNIH3T3 cells cultured in vitro were divided into control group and experiment group. The experiment group was cultured in Rotary Cell Culture System (RCCS) stimulated microgravity. The control group was cultured under static condition. Both two groups were stimulated by PMA. The expression of Per1, Per2 and Cry1 were detected by RT-qPCR. ResultsThe mRNA level of Per1, Per2 and Cry1 demonstrated rhythmic oscillation in control group and experiment group. The amplitudes of Per1, Per2 and Cry1 of experiment group were lower than that of control group. The phases of Per1, Per2 and Cry1 of experiment group delayed compared that of control group. ConclusionSimulated microgravity can influence the expression of Per1, Per2 and Cry1.

【Key words】Stimulated microgravity; Circadian genes; NIH3T3

近日節(jié)律廣泛存在于生物界。在自然狀態(tài)下，生物鐘接受外界光-暗和溫度等周期信號，調(diào)整自身的相位，與外界環(huán)境保持同步[1]。生物節(jié)律由近日節(jié)律基因的轉(zhuǎn)錄-翻譯的正負(fù)反饋環(huán)路產(chǎn)生[2，3]。生物體內(nèi)約有10%的基因參與調(diào)節(jié)近日節(jié)律[4，5]。目前，已通過基因分析找到與近日節(jié)律有關(guān)的節(jié)律基因，如Perl、Per2、Per3、Clock、Bmal、Tim、Cryl、Cry2和Tau等，其中Per1，Per2，Cry1為近日節(jié)律的核心元件。

隨著航天事業(yè)的發(fā)展，微重力對有機(jī)體的影響成為研究熱點(diǎn)。微重力可以破壞細(xì)胞的骨架，改變細(xì)胞的形態(tài)，使細(xì)胞發(fā)生水腫，微管蛋白減少，部分細(xì)胞發(fā)生凋亡等[6，7]。在微重力條件下，人T淋巴細(xì)胞減少，免疫因子的表達(dá)出現(xiàn)明顯的下降。人體溫度調(diào)節(jié)系統(tǒng)在微重力狀態(tài)下也發(fā)生一定的變化[8]。微重力對生物的近日節(jié)律也有著明顯的影響[9]。在微重力影響下，人的睡眠周期推遲2小時[10]。但是，微重力對生物節(jié)律的影響機(jī)制尚不清楚，需要深入研究。本文以NIH-3T3細(xì)胞為研究對象，利用旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(RCCS)模擬太空微重力環(huán)境，研究微重力對NIH-3T3細(xì)胞節(jié)律基因表達(dá)的影響，從分子層面研究微重力對生物體近日節(jié)律的影響。

1材料與方法

1.1PCR引物PCR引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，引物序列見表1。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)條件： 10%新生小牛血清和1%的雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，5%CO2，37℃。對照組：將NIH-3T3細(xì)胞(密度：2.0×105個/平皿)接種在25mm的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞密度為80%時，用無血清的培養(yǎng)基處理。24小時后，用PBS溶液清洗，然后用不含血清濃度為100nM的PMA的DMEM溶液誘導(dǎo)，將誘導(dǎo)時間定為0h。誘導(dǎo)2小時后，分別在0、1、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44和48h時間點(diǎn)用0.25%的胰酶溶液消化細(xì)胞。離心收集細(xì)胞，加Trizol試劑裂解細(xì)胞取樣，于-80℃凍存。實(shí)驗(yàn)組：將NIH-3T3細(xì)胞接種在100mm的培養(yǎng)皿，當(dāng)密度至80%時，將細(xì)胞接種在cytodex-3上，置入RCCS中培養(yǎng)。24小時后，將含10%新生小牛血清的培養(yǎng)基更換為無血清的培養(yǎng)基，24小時后用與對照組濃度相同的PMA刺激，然后與對照組在相同時間點(diǎn)取樣。

表1　PCR引物序列

1.3實(shí)時熒光定量PCR根據(jù)Trizol試劑說明書提取NIH-3T3細(xì)胞的總RNA，用紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度。分別取2μg的RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑合反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。RT-qPCR反應(yīng)體系：10μl Mix，1μl上游引物，1μl下游引物，2μl cDNA模版，補(bǔ)加滅菌蒸餾水至總體積20μl。反應(yīng)條件，預(yù)變性：95℃，10m；擴(kuò)增條件：95℃，10s；55-65℃，20s；72℃，20s；40個循環(huán)；融解曲線：65℃～95℃，5s。其中Gapdh，Per1，Per2，Cry1各自的退火溫度分別為56.9℃，55℃，62.5℃，60℃。

1.4統(tǒng)計分析Per1，Per2與Cyr1基因的mRNA 的相對表達(dá)水平以2-ΔΔCt方法計算。數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件分析，并進(jìn)行兩因素方差分析法，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1模擬微重力對節(jié)律基因Per1的影響以GAPDG為內(nèi)參基因，采用RT-qPCR法檢測正常重力組和實(shí)驗(yàn)組Per1基因的mRNA的相對表達(dá)水平。如圖1所示：正常重力組(1g)和實(shí)驗(yàn)組(0g)per1的表達(dá)都呈現(xiàn)出節(jié)律性振蕩。與1g 組相比，0g組 per1的振幅和相位都發(fā)生了明顯的變化，兩因素方差分析結(jié)果表明，1g組與0g組per1的相對表達(dá)水平有顯著差異(P<0.001)。1g組per1的波峰大約出現(xiàn)在32h左右，波谷大約出現(xiàn)在20 h，振幅最大值為2.03；0g組per1波峰大約出現(xiàn)在20 h，相對表達(dá)量為1.82，波谷大約出現(xiàn)在32 h，相對表達(dá)量為0.075。0g組與1g組相比，振幅減少，相位也發(fā)生了延遲。

圖1模擬微重力對Per1相位的影響

Figure 1Influence of simulated microgravity on phase of Per1

2.2模擬微重力對節(jié)律基因Per2的影響以GAPDG為內(nèi)參基因，采用RT-qPCR法檢測正常重力組和實(shí)驗(yàn)組Per2基因的mRNA的相對表達(dá)水平。如圖2所示：1g組和0g組Per2 mRNA表達(dá)水平也呈節(jié)律性振蕩。與1g 組相比，0g組 per2的振幅和相位都發(fā)生了明顯的變化，兩因素方差分析結(jié)果表明，1g組與0g組per1的相對表達(dá)水平有顯著差異(P<0.001)。1g組的波峰大約出現(xiàn)在32h，相對表達(dá)量2.16，波谷大約出現(xiàn)在44 h，相對表達(dá)量為0.57；0g組波峰大約出現(xiàn)在20 h，相對表達(dá)量為1.39，波谷大約出現(xiàn)在8 h，相對表達(dá)量為0.05。0g組與1g組相比，振幅減少，相位也發(fā)生了延遲。

圖2模擬微重力對Per2相位的影響

Figure 2Influence of simulated microgravity on phase of Per2

2.3模擬微重力對節(jié)律基因Cry1的影響以GAPDG為內(nèi)參基因，采用RT-qPCR法檢測正常重力組和實(shí)驗(yàn)組Cry1基因的mRNA的相對表達(dá)水平。如圖3所示：1g組和0g組Cry1 mRNA表達(dá)水平都呈節(jié)律性振蕩，但是，與1g 組相比，0g組cry1的振幅和相位都發(fā)生了明顯的變化，兩因素方差分析結(jié)果表明，1g組與0g組cry1的相對表達(dá)水平有顯著差異(P<0.001)。1g組的波峰大約出現(xiàn)在28h，相對表達(dá)量1.9，波谷大約出現(xiàn)在12，相對表達(dá)量為0.43；0g組波峰大約出現(xiàn)在16 h，相對表達(dá)量為0.47，波谷大約出現(xiàn)在1 h，相對表達(dá)量為0.13。0g組與1g組相比，振幅減少，相位也發(fā)生了延遲。

圖3模擬微重力對Cry1相位的影響

Figure 3Influence of simulated microgravity on phase of Cry1

3討論

地球上所有的生物都處在太陽系中，近日生物鐘系統(tǒng)的存在使得生物體能夠適應(yīng)環(huán)境周期性變化。重力作為一個恒定的環(huán)境因素深刻地影響著地球上生物體的生命活動。研究表明，失重或者微重力環(huán)境對機(jī)體造成的影響是多方面，可以導(dǎo)致許多臟器長期或短期的功能異常，如體液重新分布、腎小球?yàn)V過增加、心血管功能改變、肌肉萎縮、骨質(zhì)丟失、代謝紊亂、免疫功能的改變等[11]。同時也會引起一些精神性疾病，睡眠障礙，錯覺，太空定位、認(rèn)知障礙等[12]。已有大量實(shí)驗(yàn)表明，微重力條件下，機(jī)體的生物節(jié)律也發(fā)生了相應(yīng)的變化。實(shí)驗(yàn)報道，采用人體Head-Down Bed Rest(HDBR)的方法進(jìn)行微重力的模擬，通過檢測排泄物的成份發(fā)現(xiàn)，微重力條件下，排泄物中的各成人的含量發(fā)生了周期性的變化[12]。Shimda等在模擬微重力下對斑馬魚胚胎發(fā)育影響的研究中發(fā)現(xiàn)，微重力對不同組織器官基因表達(dá)存在著敏感反應(yīng)時間段[13]。太空實(shí)驗(yàn)中記錄獼猴運(yùn)動情況、心率以及腋窩和大腦的溫度，與地面對照組相比，太空飛行過程中，獼猴溫度節(jié)律相位延遲，平均心率降低[14]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模擬微重力影響了NIH3T3細(xì)胞Per，Per2，Cry1的近日節(jié)律振蕩，表現(xiàn)為振幅減小，相位發(fā)生延遲。正常環(huán)境下，體外培養(yǎng)的細(xì)胞節(jié)律基因的表達(dá)不呈現(xiàn)近日節(jié)律振蕩，而作為PKC的經(jīng)典誘導(dǎo)劑PMA，能夠誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生近日節(jié)律振蕩，其誘導(dǎo)機(jī)制是PMA激活PKC，緊接著激活了MAPK激酶信號通路，同步化每個細(xì)胞的相位，從而重置了細(xì)胞的近日節(jié)律振蕩[15]。模擬微重力環(huán)境下近日節(jié)律基因的振幅減小，相位發(fā)生了延遲。已有研究證實(shí)，模擬微重力環(huán)境下，成纖維細(xì)胞內(nèi)的MAPK信號通路被激活，而MAPK信號通路又參與了成纖維細(xì)胞近日鐘重置的過程[16]，所以，模擬微重力環(huán)境刺激了MAPK信號通路，使其參與近日鐘重置過程，這可能是導(dǎo)致NIH3T3細(xì)胞的近日生物鐘系統(tǒng)發(fā)生變化，從而引起相關(guān)節(jié)律基因的表達(dá)發(fā)生了變化。也有研究表明，微重力條件下，下丘腦-垂體系統(tǒng)也會發(fā)生改變，前葉激素的分泌呈降低的趨勢[17]，而生物節(jié)律的中央調(diào)控位于下丘腦的SCN區(qū)域，由此可間接推測微重力條件下生物節(jié)律的改變可能是由于下丘腦-垂體系統(tǒng)的改變影響了相關(guān)激素的分泌，最終也引起了生物節(jié)律的變化。而報道最多的可能的機(jī)制是ERK/MAPK信號通路，本實(shí)驗(yàn)中也從側(cè)面驗(yàn)證了MAPK通路的參與。

4結(jié)論

模擬微重力影響了近日節(jié)律基因的表達(dá)水平。以本研究為基礎(chǔ)，進(jìn)一步研究微重力條件下節(jié)律基因的分子調(diào)控機(jī)制，節(jié)律基因?qū)Υx的調(diào)控等，將有助于揭示航天環(huán)境因素產(chǎn)生的生物節(jié)律特異調(diào)節(jié)途徑，從而為空間生理，病理性疾病的預(yù)防和治療提供新的思路和理論基礎(chǔ)。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Traon APL, Heer M, Narici MV,etal. From space to Earth: advances in human physiology from 20 years of bed rest studies (1986-2006) [J]. European Journal of Applied Physiology, 2007, 101:143-194.

[2]Thresher RJ, Martha HV, Yasuhide M,etal. Role of mouse cryptochrome blue-light photoreceptor in circadian photoresponses [J]. Science, 1998, 282,1490-1494.

[3]Welsh DK, Takahashi JS, Kay SA. Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties [J]. Annu Rev Physiol, 2010, 72, 551-577.

[4]Akhtar RA, Reddy AB, Maywood ES,etal. Circadian cycling of the mouse liver transcriptome, as revealed by cDNA microarray, is driven by the suprachiasmatic nucleus [J]. Curr Biol, 2002, 12,540-550.

[5]Panda S, Antoch MP, Miller BH,etal. Coordinated transcription of key pathways in the mouse by the circadian clock [J]. Cell, 2002, 109, 307-320.

[6]Marina YK, Norita S, Salina O,etal. Alteration of cell cytoskeleton and functions of cell recovery of normal human osteoblast cells caused by factors associated with real space flight[J]. Malaysian J Pathol, 2013, 35(2):153 -163.

[7]Rui Meng, Huiyun Xu, Shengmeng Di,etal. Human mesenchymal stem cells are sensitive to abnormal gravity and exhibit classic apoptotic features [J]. Acta Biochim Biophys Sin, 2011, 43:133-142.

[8]Zhenzhong Yang, Jinxue Fei, De Song,etal. Effects of simulated natural air movement on thermo regulatory response during head-down bed rest [J]. Journal of Thermal Biology, 2013, 38: 363-368.

[9]Dijk DJ, Neri DF, Wyatt JK,etal. Sleep, performance, circadian rhythms, and light-dark cycles during two space shuttle flights [J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2001, 281:1647-1664.

[10] Gundel A, Polyakov VV,Zulley J. The alteration of human sleep and circadian rhythms during spaceflight [J]. Sleep Res,1997,6:1-8.

[11] LeBlanc AD, Spector ER, Evans HJ,etal. Skeletal responses to space flight and the bed rest analog : a review [J]. Musculoskelet Neuronal Interact, 2007, 7:33-47.

[12] Manzey D, Lorenz B. Mental performance during short-term and long-term space flight [J]. Brain Res Rev, 1998, 28:215-221.

[13] Shimada N,Sokunbi G,Moorman SJ. Changes in gravitational for affect gene expression in developing organ systems at different developmental times [J]. BMC Developmental Biology, 2005, 5(1):10.

[14] Fuller CA, Hoban-Higgins TM, Klimovitsky VY,etal. Primate circadian rhythms during spaceflight: results from Cosmos 2044 and 2229 [J]. J Appl Physiol, 1996, 81(1): 188-193.

[15] Brogs L, Beukelaers P, Vandenbosch R,etal. Cell" circadian" cycle a new role for mammalian core clock gene[J].Cell cycle,2009,8(6):832-837.

[16] Akashi M, Nsishida E. Involvement of the MAPinase cascade in resetting of the mammalian circadian clock[J]. Genes Dev, 2000, 14(6): 645-649.

[17] Alekseev EI. Morphofunctional state of the hypothalamic-pituitary neurosecretory system of rats flown on Cosmos-1667[J]. Kosm-Biol-Aviakosm-Med,1987, 21(6):27-31.