阿德福韋酯對(duì)鴨乙肝病毒cccDNA的抗病毒作用研究

·藥物與臨床·

阿德福韋酯對(duì)鴨乙肝病毒cccDNA的抗病毒作用研究

惠凌云1，羅秦英2，張琳1，馮艾1，李娜1，王威1，李義平3，王亞文*

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安

710061；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，西安710061；3.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安710061)

摘要：目的探討阿德福韋酯(ADV)對(duì)鴨乙肝病毒cccDNA的抑制作用。方法 采用ADV(10 mg·kg-1·d-1)和0.01 mol·L-1 PBS(0.5 mL·kg-1·d-1)治療感染鴨乙肝病毒(DHBV)的北京麻鴨。分別在治療第0，10，20和30 d和停藥15 d時(shí)，檢測(cè)外周血DHBVDNA的載量和外周血AST和ALT水平。并分別于治療前、治療30 d和停藥15 d分別通過手術(shù)、B超引導(dǎo)下的肝臟穿刺取鴨肝組織，檢測(cè)DHBV DNA和DHBV cccDNA載量。結(jié)果 外周血DHBV DNA載量ADV陽性藥物組分別在治療10,20和30 d均顯著低于治療基線(P< 0.05)，并隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)，DHBV DNA呈下降趨勢(shì)。停藥15 d，雖與治療基線比較仍有顯著性差異(P< 0.05)，但病毒復(fù)制有反彈現(xiàn)象。在治療20，30 d和停藥15 d時(shí)，ADV治療組均顯著低于PBS陰性對(duì)照組(P< 0.05)。肝組織DHBV DNA載量，ADV陽性藥物組治療30 d時(shí)明顯低于陰性對(duì)照和治療基線(P< 0.05)，但停藥15 d后，肝組織中的DHBV DNA有所反彈，與治療基線和陰性對(duì)照比均無顯著性差異(P> 0.05)。肝組織DHBV cccDNA治療抑制率在治療30 d和停藥15 d后，ADV陽性藥物組均明顯高于陰性對(duì)照(P<0.05)。表明ADV可有效抑制DHBV cccDNA的復(fù)制，停藥15 d后雖能夠有效地維持抑制作用，但有所反彈。AST和ALT結(jié)果顯示，ADV陽性藥物組各時(shí)間點(diǎn)與基線之間，以及與PBS對(duì)照組之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P> 0.05)。結(jié)論 ADV可有效抑制DHBV DNA和cccDNA的復(fù)制。但停藥后仍有反彈。提示臨床ADV治療HBV應(yīng)長(zhǎng)期、聯(lián)合用藥，才能最終治愈乙肝。

關(guān)鍵詞：阿德福韋酯；鴨乙肝病毒cccDNA；抗病毒

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.06.019

中圖分類號(hào)：R978.7文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：81101260)

作者簡(jiǎn)介：惠凌云，女，醫(yī)學(xué)碩士，主管技師

收稿日期：(2015-07-16)

Research of adefovir dipivoxil against duck hepatitis B virus cccDNA

HUI Lingyun1，LUO Qinying2，ZHANG Lin1，F(xiàn)ENG Ai1，LI Na1，WANG Wei1，LI Yiping3，WANG Yawen*(1.Laboratory， the First Affiliated Hospital， Xi′an Jiaotong University， Xi′an 710061，China； 2.Department of Pharmacy， the First Affiliated Hospital，Xi′an Jiaotong University， Xi′an 710061，China； .3. School of Pharmacy， Xi′an Jiaotong University， Xi′an 710061，China)

Abstract:Objective To investigate the inhibition of adefovir dipivoxil (ADV) against duck hepatitis B virus (DHBV) cccDNA.Methods DHBV naturally infected Peikin ducks fed in Xi′an were used as the animal model and were treated orally with 10 mg·kg-1of ADV daily for 30 days，and 0.5 mL of 0.01 mol·L-1 PBS was used as the negative control. The levels of DHBV DNA in the peripheral blood were quantified at day 0，10，20 and 30 of the treatment and at day 15 after the termination of treatment. The serum levels of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) were examined . Liver tissues of every duck in two groups were obtained by surgery，and DHBV DNA and cccDNA were determined at day 30 of the treatment and at day 15 after the termination of treatment.Results The serum DHBV DNA levels in ADV treated ducks at day 10，20 and 30 of the treatment were significantly reduced as compared with those at baseline of treatment (P< 0.05)，and with prolonged treatment，the serum DHBV DNA levels decreased gradually. At day 15 after the termination of treatment，the serum DHBV DNA levels were still significantly lower than those at baseline of treatment (P< 0.05)，but the rebound of the levels of serum DHBV DNA in ADV treated ducks was observed. At day 20 and 30 of the treatment and day 15 after the termination of treatment，the serum DHBV DNA levels were significantly lower than those in the negative controls (P< 0.05). The levels of liver DHBV DNAin ADV treated ducks at day 30 of the treatment were significantly lower than those in the negative controls and those at baseline of treatment (P< 0.05). At day 15 after the termination of treatment，the levels of liver DHBV DNA were comparable with those in the negative controls and those at baseline of treatment (P> 0.05).At day 30 of the treatment and day 15 after the termination of treatment，the inhibition ratio of cccDNA in ADV treated ducks were significantly reduced as compared with those in negative controls，suggesting that ADV can effectively inhibit the replication of DHBV cccDNA. No significant change between baseline and end of treatment was observed in ALT and AST in ADV treated ducks.Conclusion ADV can effectively inhibit the replication of DHBV， particularly， can make DHBV cccDNA decreased. However，when the treatment was stopped，there was a rebound in the levels of DHBV DNA and cccDNA, indicating that ADV should be combined with other antiviral drugs in clinical treatment and be used long-termly.

Key words: adefovir dipivoxil；duck hepatitis B virus cccDNA；antiviral

*通信作者：王亞文，女，教授，碩士生導(dǎo)師

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)嚴(yán)重危害人類健康[1]。病毒DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞核，形成超螺旋的共價(jià)、閉合、環(huán)狀DNA分子(covalently closed circular DNA，cccDNA)[2-4]。肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA的持續(xù)存在是病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并建立感染狀態(tài)的重要標(biāo)志，抑制或清除細(xì)胞內(nèi)cccDNA是評(píng)價(jià)抗病毒藥物的關(guān)鍵指標(biāo)。

阿德福韋酯(adefovirdipivoxil，ADV)為腺嘌呤單磷酸開鏈核苷類似物，通過抑制HBV逆轉(zhuǎn)錄酶或通過整合到病毒DNA鏈后使其復(fù)制終止，因而具有較強(qiáng)的抗病毒作用[5-6]。而干擾素、拉米夫定等其他抗病毒藥物，作用靶點(diǎn)均在HBV cccDNA水平之下，不能降低體內(nèi)HBV cccDNA水平，是停藥后復(fù)發(fā)的主要原因[7]。ADV迅速降低血清HBV DNA水平[8]，同時(shí)可使肝組織HBV cccDNA有不同程度的下降，但相關(guān)研究因治療過程中肝組織取材不易，報(bào)道很少。

HBV感染具有高度的種屬特異性[9]，缺乏可靠的動(dòng)物模型，嚴(yán)重阻礙了HBV致病機(jī)制與治療的研究。鴨乙型肝炎病毒(duck hepatitis B virus，DHBV)，屬于禽嗜肝DNA病毒[10]，其嗜肝性、毒粒形態(tài)、結(jié)構(gòu)和基因復(fù)制等方面與HBV很相似。因此用感染DHBV的北京麻鴨作為動(dòng)物模型，研究HBV復(fù)制、感染機(jī)制與評(píng)估治療策略已被廣泛認(rèn)可[11-12]。

本課題以北京麻鴨為研究對(duì)象，通過篩選自然狀態(tài)下感染DHBV的北京麻鴨，對(duì)口服ADV治療的麻鴨進(jìn)行觀察，比較治療前后鴨外周血DHBV DNA以及肝組織內(nèi)DHBV DNA和cccDNA載量的改變，評(píng)價(jià)ADV是否可以抑制肝組織DHBV cccDNA的水平，進(jìn)一步闡明ADV在HBV治療中的重要作用。

1儀器與材料

1.1儀器美國(guó)BIO-RAD熒光定量PCR儀；Olympus AU5400全自動(dòng)生化分析儀。

1.2試藥ADV口服給藥(10 mg·kg-1·d-1)，0.01 mol·L-1PBS靜脈注射(0.5 mL·kg-1·d-1)；DNA提取液；蛋白酶K；酚氯仿；乙醇；0.3 mol·L-1NaCl(pH 5.2)；RNA酶；Plasmid-SafeTMATP-Dependent DNase，TE。

1.3動(dòng)物西安市三原縣獨(dú)李鎮(zhèn)麻鴨養(yǎng)殖基地飼養(yǎng)的品系純正的北京麻鴨作為受試動(dòng)物。

2方法

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的入選標(biāo)準(zhǔn)及分組篩選同一批次孵化生長(zhǎng)的12月齡雌性麻鴨，體重1.0 kg左右。鴨外周血抗DHBc IgY抗體陽性。鴨外周血DHBV DNA>108copies·mL-1。按照ALT、AST、DHBV DNA的水平，平均分配。共分2組，每組12只。1組為ADV陽性藥物組，口服給藥(10 mg·kg-1·d-1)，1組為0.01 mol·L-1PBS陰性對(duì)照組，靜脈注射(0.5 mL·kg-1·d-1)。實(shí)驗(yàn)期間專業(yè)鴨飼料統(tǒng)一喂養(yǎng)，治療期間觀察受試動(dòng)物體質(zhì)量改變和不正常狀況。

2.2抗病毒實(shí)驗(yàn)研究方案治療前，對(duì)所有受試麻鴨進(jìn)行外科手術(shù)，取肝組織約2×1×3 cm大小。手術(shù)后恢復(fù)10 d，開始治療。治療第0，10，20和30 d以及停藥15 d(實(shí)驗(yàn)開始第45天)時(shí)，采集受試麻鴨腋靜脈血2 mL，EDTA-K2抗凝，檢測(cè)DHBV DNA以及 AST、ALT。治療30 d時(shí)，對(duì)受試麻鴨進(jìn)行B超引導(dǎo)下的肝臟穿刺術(shù)，取鴨肝組織進(jìn)行DHBV DNA及DHBV cccDNA的檢測(cè)。停藥15 d，斷頸殺鴨取肝組織，檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)DHBV DNA 及DHBV cccDNA的載量。

2.3血清DHBV-DNA的提取采用堿裂解法提取血清中DNA，血清50 μL加入50 μL DNA提取液于0.5 mL Eppendorf 管中充分混勻，100 ℃煮沸10 min，4 ℃條件放置過夜，10 000 r·min-1離心5 min，取上清液2 μL加入PCR反應(yīng)管中進(jìn)行擴(kuò)增。

2.4肝臟組織總DNA的提取取肝臟組織，平均分成2份，1份用于提取總DNA。勻漿裂解后蛋白酶K消化2 h，等體積酚、氯仿抽提，2倍體積乙醇沉淀，加入終濃度0.3 mol·L-1的NaCl(pH 5.2)，100 μg RNA酶消化后，溶解于TE中，按1 mg肝組織10 μL計(jì)算加入量。測(cè)定A260和A280，考察核酸提取純度，計(jì)算DNA含量。該方法提取的是鴨肝組織中的總DNA。

DNA(μg·mL-1)=A260×100×50(檢測(cè)時(shí)100倍稀釋)

2.5肝臟組織中DHBV DNA定量檢測(cè)按照每2.65 pg鴨肝組織中含有1個(gè)二倍體基因組(diploid genome)，計(jì)算1 mg肝組織中diploid genome數(shù)量[13-14]。同時(shí)采用熒光定量PCR方法檢測(cè)DHBV DNA含量[15]。

2.6肝臟組織中DHBV cccDNA的提取另外1份組織勻漿裂解液中加入1/10體積5 mol·L-1的KCl(終濃度0.5 mol·L-1)，室溫放置30 min。15 000 r·min-1離心5 min，使蛋白結(jié)合的DNA沉淀，而回收非蛋白結(jié)合的cccDNA上清，等體積的酚、氯仿抽提，2倍體積的乙醇沉淀，干燥后重懸于TE中，1 mg肝組織按2.67 μL計(jì)算加入量[16]。測(cè)定A260和A280，考察核酸提取純度，計(jì)算DNA含量。采用Plasmid-SafeTMATP-Dependent DNase(PSAD)酶切法消化線性DNA。

2.7DHBV cccDNA定量方法1 mg肝組織中diploid genome數(shù)量的計(jì)算同前，熒光定量PCR方法檢測(cè)DHBV cccDNA載量[17 ]。

2.8AST和ALT的檢測(cè)采用Olympus AU5400全自動(dòng)生化分析儀及原裝試劑檢測(cè)血漿谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)。

2.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理數(shù)據(jù)。DHBV DNA數(shù)值進(jìn)行對(duì)數(shù)計(jì)算后，AST、ALT檢測(cè)水平分別采用One-way ANOVA比較各組之間的差異。采用治療抑制率=(治療基線cccDNA-治療后cccDNA)/ 治療基線cccDNA，評(píng)估DHBV cccDNA的抑制作用。治療抑制率采用Non-parametric Mann-Whitney test方法比較各組差異性。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

3結(jié)果

圖1治療不同時(shí)間點(diǎn)DHBV DNA的檢測(cè)結(jié)果比較

A. 鴨外周血DHBV DNA檢測(cè)結(jié)果比較；B.鴨肝組織DHBV DNA檢測(cè)結(jié)果比較

Fig.1Invivoinhibitory effect on duck DHBV DNA levels.

A. DHBV DNA levels in peripheral blood；B.DHBV DNA levels in liver tissue

由圖1-A可見，鴨外周血DHBV DNA檢測(cè)結(jié)果顯示，ADV陽性藥物組從治療10 d開始，在治療20和30 d與治療基線相比有顯著差異(P< 0.05)，其抑制病毒復(fù)制的作用隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)，DHBV DNA載量逐漸下降。停藥15 d，雖然與治療基線比較仍有顯著差異(P< 0.05)，但有反彈現(xiàn)象。在治療20，30 d和停藥15 d時(shí)，ADV陽性藥物組與PBS對(duì)照組之間均有顯著差異(P< 0.05)。由圖1-B可見，鴨肝組織中DHBV DNA檢測(cè)結(jié)果顯示，治療30 d時(shí)，ADV陽性藥物組明顯低于陰性對(duì)照組和治療基線(P< 0.05)，但停藥15 d后，肝組織中的DHBV DNA有所反彈，與治療基線和陰性對(duì)照組比較，均無顯著性差異(P> 0.05)。

3.2治療不同時(shí)間點(diǎn)鴨肝組織DHBV cccDNA 治療抑制率的比較見圖2。

圖2治療不同時(shí)間點(diǎn)鴨肝組織中DHBV cccDNA的抑制率比較

A. 治療30 d時(shí)鴨肝組織DHBV cccDNA抑制率比較；B.停藥15 d時(shí)鴨肝組織DHBV cccDNA抑制率比較

Fig.2Invivoinhibitory effect on duck liver DHBV cccDNA levels.

A. the inhibition ratios of each treatment of duck liver cccDNA at day 30；B.the inhibition ratios of each treatment of duck liver cccDNA at day 15 after the termination of treatment

由圖2-A所示，治療30 d時(shí)ADV陽性藥物組與陰性對(duì)照組相比，鴨肝組織DHBV cccDNA治療抑制率有顯著增高(P<0.05)，表明ADV可有效抑制DHBV cccDNA的復(fù)制。由圖2-B所示，停藥15 d后，ADV陽性藥物組與陰性對(duì)照組相比，有顯著差異(P<0.05)。表明ADV對(duì)DHBV cccDNA的抑制作用仍然能夠有效地維持，但有所反彈。

3.3治療不同時(shí)間點(diǎn)外周血AST、ALT結(jié)果的比較見表1和表2。

表1不同時(shí)間點(diǎn)外周血AST結(jié)果

Tab.1 The results of AST in peripheral blood at different time

± s, n=12)

表2不同時(shí)間點(diǎn)外周血ALT結(jié)果

Tab.2 The results of ALT in peripheral blood at different time

± s, n=12)

表1和表2數(shù)據(jù)顯示，ADV陽性藥物組各時(shí)間點(diǎn)AST和ALT與基線之間以及與PBS對(duì)照組之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P> 0.05)。

4討論

HBV感染機(jī)體進(jìn)入細(xì)胞后[18-19]，在胞漿中脫掉外衣殼，核衣殼部分解聚后，通過核孔復(fù)合體介導(dǎo)脫蛋白病毒松弛環(huán)狀DNA(deproteinized relaxed circular DNA，DP-rcDNA)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。進(jìn)入細(xì)胞核中的DP-rcDNA的負(fù)鏈5′-端的蛋白被去除，同時(shí)正鏈5′-端的寡核苷酸也被去除，待缺失部分的DNA補(bǔ)齊后，完成細(xì)胞DNA修復(fù)器轉(zhuǎn)化rcDNA成為cccDNA的過程。cccDNA是轉(zhuǎn)錄病毒mRNA的模板，它的形成標(biāo)志著病毒成功感染。cccDNA形成后，在感染宿主細(xì)胞的RNA多聚酶催化作用下，cccDNA即開始轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物主要為3.5，2.4，2.1和0.7 kb，其中3.5 kb的RNA即為HBV的pgRNA[18,20,21]。pgRNA不僅起mRNA的作用，還是病毒基因復(fù)制的中間體，pgRNA是逆轉(zhuǎn)錄合成HBV DNA過程的模板。因此，抗病毒治療是否可以徹底治愈的關(guān)鍵在于，能否有效地抑制HBV cccDNA的復(fù)制。肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA含量的動(dòng)態(tài)變化，對(duì)于評(píng)價(jià)療效和篩選新的抗病毒藥物具有十分重要的意義。但藥物在治療過程中，獲得肝臟組織樣本是一件非常不容易的事情，肝臟穿刺的風(fēng)險(xiǎn)大，患者的接受度低，因此，很多藥物的評(píng)價(jià)受到制約。

DHBV與HBV病毒結(jié)構(gòu)及基因組結(jié)構(gòu)非常相似[11]。DHBV cccDNA持續(xù)存在的方式和感染復(fù)發(fā)的機(jī)制與HBV相同。因此，本研究通過DHBV cccDNA定量檢測(cè)，來評(píng)價(jià)ADV體內(nèi)抗病毒的作用。鴨肝組織中的DHBV cccDNA的含量個(gè)體之間差異較大[22-23]，因此采用絕對(duì)DHBV cccDNA的拷貝數(shù)進(jìn)行比較不能真實(shí)地反映各受試對(duì)象的改變，無法評(píng)價(jià)各組之間的治療效果。本課題將體內(nèi)實(shí)驗(yàn)不同時(shí)間點(diǎn)的DHBV cccDNA進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算每個(gè)受試麻鴨的DHBV cccDNA抑制率，這樣將不同個(gè)體之間的抑制率進(jìn)行分析比較更能真實(shí)地反映體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

胡適的時(shí)間觀以“進(jìn)化”“不朽”“經(jīng)濟(jì)”“閑暇”等為關(guān)鍵詞，顯然時(shí)間的客觀結(jié)構(gòu)、特征不是其思考重點(diǎn)?！斑M(jìn)化”強(qiáng)調(diào)古今異質(zhì)以及革故鼎新的進(jìn)步趨勢(shì)，這種不可逆轉(zhuǎn)的、線性的時(shí)間觀賦予個(gè)體追趕潮流、力求“經(jīng)濟(jì)”的時(shí)間意識(shí)?！安恍唷苯沂竟沤裣嗬m(xù)，強(qiáng)調(diào)“小我”在無窮時(shí)空的延展中不可磨滅的影響，這既有對(duì)過往的尊重，或?qū)κ嘏f的抗?fàn)?，也有?duì)未來的警示和擔(dān)當(dāng)。“經(jīng)濟(jì)”的時(shí)間強(qiáng)調(diào)高效，也使“閑暇”有了可能。

阿德福韋酯是阿德福韋(adefovir，PMEA)的前體藥物。通過在體內(nèi)迅速完全代謝為PMEA，并在細(xì)胞激酶作用下磷酸化為活性代謝產(chǎn)物二磷酸鹽PMEAPp，與dATP競(jìng)爭(zhēng)，抑制HBV逆轉(zhuǎn)錄酶或通過整合到病毒DNA鏈后使其復(fù)制終止，因而具有較強(qiáng)的抗病毒作用[5-6]。目前，應(yīng)用的主要抗病毒藥物如干擾素、拉米夫定等核苷類藥物均不能降低體內(nèi)HBV cccDNA水平，是停藥后復(fù)發(fā)的主要原因[7]。阿德福韋酯能迅速降低血清HBV DNA水平[8]。有報(bào)道說經(jīng)阿德福韋酯治療后，肝組織HBV cccDNA會(huì)有不同程度的下降，但因治療過程中肝組織取材不易，導(dǎo)致臨床觀察研究非常困難。本研究通過感染DHBV的北京麻鴨口服ADV，觀察外周血、肝組織中DHBV DNA和肝組織中DHBV cccDNA的改變情況，評(píng)價(jià)ADV治療過程中病毒復(fù)制的情況。研究結(jié)果表明，隨著ADV給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，外周血和肝組織中DHBV DNA的水平逐漸降低，但停藥后，仍有反彈。肝組織中DHBV cccDNA水平隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，有明顯的降低，說明ADV的確有抑制病毒cccDNA復(fù)制的作用。治療時(shí)間如果不徹底，殘存在肝細(xì)胞中的DHBV cccDNA仍可繼續(xù)復(fù)制。

5結(jié)論

ADV在治療過程中，可有效抑制DHBV cccDNA和DNA的復(fù)制，但如治療不徹底，肝組織中的cccDNA不能徹底清除，病毒復(fù)制仍會(huì)有反彈。因此主張聯(lián)合應(yīng)用其他抗病毒藥物治療CHB[24-25]。一方面利用ADV有效抑制HBV cccDNA的作用，另外選擇一個(gè)HBV DNA抑制作用較強(qiáng)的核苷類藥物，或者干擾素，聯(lián)合治療CHB，才能保證感染HBV的肝細(xì)胞中的cccDNA被徹底清除，最終治愈CHB。

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