毛菊苣根-種子不同配伍的乙醇提取物對小鼠肝損傷的保護作用

·藥理·

毛菊苣根-種子不同配伍的乙醇提取物對小鼠肝損傷的保護作用

哈木拉提·哈斯木，徐磊，帕依曼·亥米提，胡夢穎，孫玉華，楊偉俊*

(新疆維吾爾藥重點實驗室，新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，烏魯木齊830004)

摘要：目的探討毛菊苣(MJJ)根和種子2種藥用部位不同比例的配伍對小鼠化碳性肝損傷和免疫性肝損傷的保護作用。方法將MJJ根(root，R)和種子(seed，S)按不同(R∶S， 0∶1，1∶1，1∶2，1∶3，2∶1和1∶0)質(zhì)量比例進行配伍，再以8倍體積分?jǐn)?shù)70%乙醇提取后獲得6種配伍提取物。建立四氯化碳(CCl4)致小鼠化學(xué)性肝損傷模型和卡介苗(BCG)加脂多糖(LPS)致小鼠免疫性肝損傷模型，將小鼠隨機分為空白對照組、模型組、聯(lián)苯雙酯組和MJJ不同比例的配伍提取物組，各組以20 mL·kg-1灌胃給藥。檢測各組小鼠血清中天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)活性，計算臟器系數(shù)，觀察肝組織病理性變化。結(jié)果MJJ根-種子以質(zhì)量比1∶0(R1S0)、1∶1(R1S1)和2∶1(R2S1)配伍的乙醇提取物能明顯降低CCl4致小鼠急性化學(xué)性肝損傷模型中血清AST和/或ALT活性；MJJ根-種子以R1S1和R2S1配伍的乙醇提取物亦能明顯降低BCG+LPS致急性免疫性肝損傷模型中血清AST和ALT活性；MJJ根-種子以R1S1和R2S1配伍的乙醇提取物還能改善模型小鼠肝細(xì)胞壞死、變性、炎性細(xì)胞浸潤等病理現(xiàn)象。結(jié)論MJJ根和種子不同配伍的提取物對肝損傷有不同的改善作用，根-種子以R1S1和R2S1配伍組可有效保護肝功能和緩解肝病理變化。

關(guān)鍵詞：毛菊苣；CCl4；肝損傷；保護作用

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.06.015

中圖分類號：R964文獻標(biāo)志碼：A

基金項目：新疆維吾爾自治區(qū)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費資助項目(2013)

作者簡介：哈木拉提·哈斯木，男，碩士研究生

收稿日期：(2015-03-10)

Protective effects of ethanol extracts in different proportion of roots and seeds fromCichoriumglandulosumBoiss. et Huet against acute liver injury in mice

Hamulati HASIMU，XU Lei，Payiman HAIMITI，HU Mengying，SUN Yuhua，YANG Weijun*(Key Laboratory of Uighur Medicine，Xinjiang Institute of Materia Medica，Urumqi 830004，China)

Abstract:ObjectiveTo study the protective effects of Cichorium glandulosum Boiss. et Huet (MJJ) different proportion of roots(R) and seeds(S) against acute hepatic injury in mice．MethodsKunming mice were randomly divided and pretreated with MJJ extracts by oral gavage 20 mL·kg-1. There were totally 6 proportions of roots and seeds as 0∶1，1∶1，1∶2，1∶3，2∶1 and 1∶0(R∶S) according to the amounts. Carbon tetrachloride (CCl4)-induced-acute hepatic damage and Bacillus Calmette-Guerin (BCG) and lipopolysaccharide (LPS) induced-immunological liver injury were both established in mice. Levels of aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) in blood were detected to evaluate hepatic injury. Liver histopathological observation was perfonmed for the hepatic injury evaluation degree. ResultsR1S1 and R2S1 extract significantly decreased the levels of ALT and AST in serum of the 2 liver injury models compared with model groups. Moreover，histopathological results also showed the obvious protection of liver injury in R1S1 and R2S1 extract groups. ConclusionDifferent proportions of MJJ root-seed extract may influence the liver damage in mice with different degrees and especially， R1S1 and R2S1 extracts showed protective effects on hepatotoxicity．

Key words:CichoriumglandulosumBoiss. et Huet ；carbon tetrachloride；acute hepatic injury；protective effects

*通信作者：楊偉俊，男，副研究員

毛菊苣CichoriumglandulosumBoiss. et Huet(簡寫為MJJ)為菊科2年生或多年生宿根植物，其嫩葉、葉球或根可食用或藥用[1]?！毒S吾爾藥志》中記載：“菊苣可入藥，味微苦、咸，性涼。”維吾爾醫(yī)臨床廣泛應(yīng)用于肝炎、膽囊炎等肝膽疾病的治療[2]。臨床上MJJ多用于治療肝炎、腎炎、腸炎、氣管炎等疾病，國內(nèi)外也對其降脂活性、抗腫瘤、抗糖尿病、抗菌驅(qū)蟲等作用的研究較為深入[3-6]。

維吾爾醫(yī)保肝制劑多以MJJ種子和全草為主藥，臨床療效明顯，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已證實其化學(xué)成分主要含三萜、倍半萜、香豆素、花色素類等有效活性物質(zhì)[7]。目前，雖有報道證實MJJ提取物具有緩解肝損傷的作用，然而在維吾爾醫(yī)醫(yī)學(xué)典籍和臨床實踐中，毛菊苣的根和種子卻常以不同比例的配伍形式出現(xiàn)在防治肝病的處方中，組方配伍原理至今不明。因此，為闡明其配伍作用特點和規(guī)律，本實驗以MJJ根和種子不同配伍的提取物為研究對象，探討其對小鼠化學(xué)性肝損傷和免疫性肝損傷中肝功能和肝組織病理變化的影響。

1儀器與材料

1.1儀器SABA-18全自動生化分析儀，意大利生產(chǎn)；BS323S電子天平，Startorius中國； JY10001電子天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；Sigma 3K30高速低溫離心機，德國Sigma公司。

1.2試藥MJJ根和種子不同配伍的提取物均由新疆藥物研究所民族藥研究室提供；聯(lián)苯雙酯(1.5 mg/粒)，浙江股份有限公司新昌制藥廠，批號：131120108；四氯化碳：分析純，天津市化學(xué)試劑三廠，批號：131028；卡介苗：由新疆疾病預(yù)防控制中心提供，批號201310a063-3；脂多糖：Sigma公司，L-2880；ALT試劑盒：中生北控生物科技股份有限公司，批號131181；AST試劑盒：中生北控生物科技股份有限公司，批號130581。

1.3實驗動物昆明小鼠(SPF級)，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，由新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物研究中心提供。實驗動物許可證號：SCXK(新)2011-0001。在濕度為40%～60%、溫度為20～24 ℃、12 h光照交替的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由攝食飲水。

2實驗方法

2.1分組及處理小鼠隨機分組，實驗均設(shè)空白對照組、模型組和聯(lián)苯雙酯滴丸組，以及MJJ的6種提取物組，每組10只，雌雄各半，灌胃體積均為20 mL·kg-1。

2.2MJJ提取物制備MJJ根(Roots，R)、種子(Seeds，S)以及根-種子按不同比例(1∶3，1∶2，1∶1和2∶1)配伍，總藥材量均為500 g，粉碎后，用8倍體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液微沸回流提取2次，每次1 h，提取液減壓濃縮，真空干燥，粉碎成細(xì)粉，制備6種提取物(見表1)，實驗時均用蒸餾水配制成所需質(zhì)量濃度。

2.3CCl4所致小鼠化學(xué)性肝損傷模型的建立灌胃給藥，每天1次，連續(xù)5 d。第4 天各組動物腹腔注射體積分?jǐn)?shù)為0.1%的CCl4(橄欖油配制)0.02 mL·g-1，空白對照組給予同體積的生理鹽水，禁食不禁水，16 h后摘眼球取血。

表1受試樣品分組及編號

Tab.1 Group and number of test samples

R/S配伍比例根所占比例R/(R+S)體積分?jǐn)?shù)70%乙醇提取物編號0∶10.00S提取物1∶30.25R1S3提取物1∶20.33R1S2提取物1∶10.50R1S1提取物2∶10.66R2S1提取物1∶01.00R提取物

2.4BCG+LPS所致小鼠免疫性肝損傷模型的建立灌胃給藥，每天1次，連續(xù)11 d。給藥第1天各組小鼠尾靜脈注射BCG 0.2 mL·只-1，第10天小鼠尾靜脈注射LPS 0.2 mL·只-1(8 μg)誘導(dǎo)肝損傷，空白對照組小鼠尾靜脈注射同等體積的生理鹽水。注射LPS后16 h摘眼球取血。

2.5檢查項目及方法全血3 500 r·min-1離心10 min，分離血清，測定ALT和AST指標(biāo)。同時剖取肝臟，計算肝臟指數(shù)(肝臟指數(shù)=肝臟濕質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100%)，并用10%甲醛溶液固定，制作切片，HE染色，進行病理學(xué)檢查并拍照。

3結(jié)果

3.1對CCl4所致小鼠化學(xué)性肝損傷的影響結(jié)果表明，與對照組比較，模型組小鼠血清中AST和ALT水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組小鼠血清中AST和ALT水平均有所降低，其中R1S1、R2S1提物組小鼠血清中AST和ALT水平均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，R1S0提取物組ALT水平差異也顯示有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。陽性對照藥聯(lián)苯雙酯滴丸組二者水平顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，各給藥組臟器系數(shù)雖有波動，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2不同配伍比例提取物對CCl4肝損傷小鼠血清ALT、AST和肝臟指數(shù)的影響

Tab.2Effects of MJJ on CCl4induced hepatic injury

± s， n=10)

注：與空白對照組比較##P<0.01;與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

3.2對BCG+LPS所致小鼠免疫性肝損傷的影響結(jié)果表明，與對照組比較，模型組小鼠血清中AST、ALT水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組小鼠血清中AST、ALT均有所降低，其中R1S1、R2S1提取物組和聯(lián)苯雙酯滴丸組血清中AST、ALT水平呈顯著降低(P<0.01);與模型組比較，各給藥組臟器系數(shù)雖有波動，但均無顯著性差異，見表3。

表3不同配伍對BCG+LPS肝損傷小鼠血清ALT、AST和肝臟指數(shù)的影響

Tab.3Effects of MJJ with BCG and LPS induced-immunological liver injury

± s， n=10)

注：與正常對照組比較##P<0.01；與模型組比較*P<0.05；**P<0.01。

3.3組織病理學(xué)檢查病理結(jié)果表明，在CCl4所致小鼠化學(xué)性肝損傷和BCG+LPS所致免疫性肝損傷實驗中，肝臟以HE染色，×10鏡下，正常組小鼠肝細(xì)胞未出現(xiàn)壞死、變性及脂質(zhì)空泡及炎性細(xì)胞浸潤等病理改變。CCl4和BCG+LPS肝損傷組小鼠肝臟都出現(xiàn)嚴(yán)重的急性肝損傷反應(yīng)，主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞壞死、變性(水腫)，脂質(zhì)空泡(脂變)，散在的炎性細(xì)胞浸潤。各給藥組小鼠肝臟病變程度、范圍上較模型組有部分減輕，其中，R1S1提取物組、R2S1提取物組、聯(lián)苯雙酯滴丸組對肝損傷的改善較為明顯(見圖1和圖2)。

圖1CCl4所致小鼠化學(xué)性肝損傷病理切片圖(×10)

A.空白對照組；B.模型組；C.聯(lián)苯雙酯組；D. R1S1提取物組；E. R2S1提取物組

Fig.1Pathological slices of hepatic tissue in mice with CCl4induced hepatic injury

A.control group；B.model group；C.bifendatatum group；D.R1S1extract group；E.R2S1extract group

4討論

肝損傷是由多因素介導(dǎo)的復(fù)雜病理生理變化，表現(xiàn)為肝功能異常、肝細(xì)胞變性、炎細(xì)胞浸潤、纖維組織增生等病理特征，并最終導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡甚至肝衰竭，是臨床常見的危害人類健康的重大疾病。因此，尋找防治肝損傷的藥物，是當(dāng)前基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)的重點課題之一。

肝損傷是肝臟疾病的共同病變結(jié)果，多種有害因素均可導(dǎo)致肝壞死、膽汁淤積、肝纖維化，甚至肝硬化、肝癌。本研究根據(jù)肝臟可受多因素致病的病變基礎(chǔ)，建立了2種實驗性肝損傷模型，旨在比較毛菊苣根-種子2個不同藥用部位配伍的保肝作用特點，探尋最佳配伍比例。

圖2BCG+LPS所致小鼠免疫性肝損傷病理切片圖

A.空白對照組；B.模型組；C.聯(lián)苯雙酯組；D.R1S1提取物組；E.R2S1提取物組

Fig.2Pathological slices of hepatic tissue in mice with BCG and LPS induce immunological liver injury

A.control group；B.model group；C.bifendatatum group；D.R1S1extract group；E.R2S1extract group

CCl4致急性肝損傷模型是肝臟毒理學(xué)中常見的病理模型。CCl4主要經(jīng)呼吸道和消化道進入體內(nèi)，對人和動物均可導(dǎo)致較強的肝損傷。它對肝損傷的毒性作用是通過脂質(zhì)過氧化作用進行的，一般認(rèn)為主要通過2條途徑[9-10]：一是CCl4經(jīng)P450酶系代謝，產(chǎn)生三氯甲烷自由基(CCI3·)，CCl3·迅速與氧結(jié)合為過氧化三氯甲烷自由基(CCl3O2·)，使細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，從而引起線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和細(xì)胞膜的變性損傷；二是CCl4對細(xì)胞膜具有直接溶膜作用。一定量CCl4可引起肝細(xì)胞的損傷，從而導(dǎo)致能量代謝障礙，使肝細(xì)胞膜通透性增加，因此肝細(xì)胞中可溶性酶、AST、ALT因濃度梯度而釋放入血，故血清中AST、ALT水平的高低能夠反映肝細(xì)胞損傷程度[8-10]。本研究亦證實，在該模型中，CCl4致肝損傷小鼠的血清ALT、AST水平顯著增高，肝臟指數(shù)有所增加(未見顯著差異)，病理損傷嚴(yán)重。

此外，免疫性肝損傷動物模型類似于人類肝炎發(fā)生的病理生理過程，是篩選保肝藥物較為理想的模型之一。BCG+LPS致肝損傷模型屬巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性肝損傷，激活的巨噬細(xì)胞釋放多種免疫效應(yīng)分子，如活性氮、活性氧和細(xì)胞因子等，最終導(dǎo)致肝臟嚴(yán)重的過氧化損傷。在本研究中，小鼠尾靜脈注射BCG和10 d后注射LPS后，引起小鼠肝臟炎癥，血清轉(zhuǎn)氨酶升高。

藥物復(fù)方配伍是維吾爾醫(yī)藥學(xué)理論的重要組成部分，也是維吾爾醫(yī)藥文化的精髓，由于維吾爾醫(yī)理論具有其獨特性，用藥方式也不同于中藥和其他民族藥。在傳統(tǒng)維吾爾藥復(fù)方中，有一類配伍尤其特別，即同一藥材的不同用藥部位常常在同一處方中按相對固定的比例配伍使用，從而達(dá)到提高其療效的目的。MJJ的根及種子系維吾爾醫(yī)習(xí)用藥材，藥理學(xué)研究表明，MJJ根和種子提取物具有保肝作用[11-12]。在維吾爾傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)典籍中，MJJ的根和種子常常在同類處方中以不同比例配伍出現(xiàn)，且常有4種配伍比例(1∶3，1∶2，1∶1和2∶1)，本實驗中將MJJ根和種子按6個質(zhì)量比例(1∶0，0∶1，1∶1，1∶2，1∶3和2∶1)配伍后分別用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇提取后得到6個提取物，研究了不同配伍比例與保肝藥效的相關(guān)性。

對于CCl4所致急性肝損傷和BCG+LPS所致免疫性肝損傷，MJJ根和種子的各組配伍提取物降低血清AST、ALT的作用大多優(yōu)于單用根或種子，根和種子以1∶1和2∶1比例配伍的醇提物(R1S1提取物、R2S1提取物)療效最好，其中，2∶1配伍組保護肝功能的作用略優(yōu)于1∶1配伍組。根-種子不同配伍組對肝臟病理組織的影響也與對AST、ALT的影響基本呈正相關(guān)。該結(jié)果符合維藥典籍記錄和臨床實踐，根與種子的不同配比組方對于保肝護肝的療效著實優(yōu)于單一部位的使用。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究已經(jīng)解析了MJJ不同部位的有效成分和保肝作用的特點。MJJ根的醇提物含有三萜、倍半萜內(nèi)酯類、黃酮類等活性成分，各種醇提物均能緩解肝損傷，并可對抗氧化應(yīng)激和防止肝纖維化[13]；MJJ種子提取物保護肝臟的活性則不及其全草提取物，有效活性部分主要位于乙酸乙酯和正丁醇部位[13]。其中山萵苣素和山萵苣苦素等倍半萜內(nèi)酯類是MJJ根的主要保肝成分，具有抑制氧化應(yīng)激、解毒排毒等護肝作用[14]；秦皮乙素等香豆素類在MJJ種子中含量最高，通過降低脂質(zhì)過氧化、清除自由基、抗凋亡等作用，保護肝臟超微結(jié)構(gòu)[15]。由于上述成分在植物不同部位富集程度不同，故不同藥用部位以一定比例組合，可將其中活性成分有機組合，進一步提高肝細(xì)胞抗氧化能力，保護肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整及功能，從而對抗CCl4、BCG+LPS等引起的損害作用。

綜上所述，本研究通過建立實驗性肝損傷模型比較了維藥毛菊苣根與種子2個不同藥用部位配伍的保肝作用，證實了根-種子以1∶1和2∶1比例配伍，用8倍量體積分?jǐn)?shù)70%乙醇提取的成分有良好的保肝作用，為探討維吾爾藥MJJ的配伍特點和認(rèn)識其保肝功效本質(zhì)提供了科學(xué)依據(jù)。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中國藥典2010年版[S].二部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2012:291.

[2]陳勇民.維吾爾藥志:上冊[M].烏魯木齊:新疆衛(wèi)生出版社，2005:100.

[3]Ahmed B，Al-Howiriny TA，Siddiqui AB. Antihepatotoxic acticity of seeds ofCichoriumlntybus[J]. J Ethnopharmacol，2003，87(2/3):237-240.

[4]Pushparaj P N，Low H K，Manikandan J，et al. Anti-diabetic effects ofCichoriumlntybusin streptozotocin-induced diabrtic rats[J]. J Ethnopharmacol，2007，111(2):430-434.

[5]Athanasiadou S，Gray D，Younie D，et al. The use of chicory for parasite control in organic ewes and their lambs [J]. Parasitology，2007，134(Pt2):299-307.

[6]Amirghofran Z. Azadbakht M，Karimi MH. Evaluation of the immunomodulatory effects of five herbal plants [J]. J Ethnopharmacol，2000，72(1/2):167-172.

[7]于欣源，楊曉虹，周小平.菊科植物化學(xué)成分及藥理作用的研究進展[J]．吉林大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2005，31(1):159-162.

[8]崔燕芒，李鵬，陳錦文.祁門紅茶多酚提取物對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷保護作用的研究[J].西北藥學(xué)雜志，2014，29(4):381-385.

[9]孫設(shè)宗，盧方安，朱名安，等．鎂離子、維生素E對小鼠急性肝損傷的保護作用[J]．中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2006，16(3):339-345．

[10]趙春景，魏來．葛根素對 CCl4所致大鼠急性肝損傷的保護作用[J]．第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2005，27(7):625-627.

[11]吳德躍，吳俊標(biāo)，周玖瑤，等.虎杖水提液利膽保肝作用研究[J].西北藥學(xué)雜志,2014，29(2): 167-169.

[12]秦冬梅，胡利萍，文志萍，等.維藥毛菊苣提取物對小鼠四氯化碳急性肝損傷的保護作用[J].中國藥理學(xué)通報，2012，28(8):1180-1181.

[13]楊建華，李淵，閆冬，等.維藥毛菊苣對四氯化碳致小鼠肝損傷的保護作用[J].時珍國醫(yī)國藥，2012，23(10):2383-2386.

[14]再娜布·吐合達(dá)洪，仲婕，信學(xué)雷，等.毛菊苣藥材不同部位主要活性成分含量[J].中國中藥雜志，2010，35(8): 1018-1021.

[15]李淵.維藥毛菊苣保肝作用及有效成分含量測定[D].烏魯木齊：新疆醫(yī)科大學(xué)，2012：22-44.