HPLC法測定藥材貫葉金絲桃中金絲桃苷和槲皮素的含量

HPLC法測定藥材貫葉金絲桃中金絲桃苷和槲皮素的含量

田紅林1，成杰2，軒轅歡1*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，烏魯木齊830004；2.武警新疆總隊(duì)醫(yī)院藥局，烏魯木齊830091)

摘要：目的建立測定藥材貫葉金絲桃中槲皮素和金絲桃苷含量的方法。方法采用高效液相色譜法(HPLC)。色譜柱：Hypersil CN(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-4 mL·L-1磷酸(30/70)，流速1.0 mL·min-1；檢測波長(241，360 nm)；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。結(jié)果槲皮素和金絲桃苷濃度分別在0.02～10和0.03～8 μg·mL-1質(zhì)量范圍內(nèi)與峰面積積分分值呈良好線性關(guān)系。加樣回收率分別為98.0%和98.1%。結(jié)論該方法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性好，可作為該藥材測定槲皮素和金絲桃苷質(zhì)量控制的方法。

關(guān)鍵詞：貫葉金絲桃；槲皮素；金絲桃苷

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.06.009

中圖分類號(hào)：R282文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

作者簡介：田紅林，男，副主任中藥師

收稿日期：(2015-03-10)

Content determination of hyperoside and quercetin inHypericumperforatumby HPLC

TIAN Honglin1，CHENG Jie2，XUANYUAN Huan1*(1.Department of Pharmacy，the Sixth Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University，Urumqi 830004，China；2.Armed Police Xinjiang Hospital Pharmacy，Urumqi 830009，China)

Abstract:ObjectiveTo establish a method for the determination of hyperoside，quercetin in Hypericum perforatum by HPLC. MethodsThe chromatographic conditions were as follows：Hypersil CN (150 mm×4.6 mm，5 μm) column；a mobile phase of methanol -4 mL·L-1 phosphate (30/70)，a flow rate of 1 mL·L-1；the detection wavelength 241，360 nm；the column temperature 30 ℃；the sample size 20 μL. ResultsHyperin and quercetin, with in the concentration of 0.02-10 and 0.03-8 μg·mL-1respectively showed a good linear relationship. Recoveries were 98.0% and 98.1% respectively. ConclusionThe method has high specificity，sensitivity，and good reproducibility，and can be used as a method for quercetin and hyperoside determination.

Key words:Hypericumperforatum；quercetin；hyperin

*通信作者：軒轅歡,男,助理中藥師

貫葉金絲桃HypericumperforatumL.又名貫葉連翹，為藤黃科Guttiferae金絲桃屬HypericumLinn多年生草本植物[1]，其味苦、辛、性寒，具有疏肝解郁、清熱利濕、消腫通乳之功效[2-4]，主治濕寒性或黏液質(zhì)性關(guān)節(jié)痛及濕寒創(chuàng)傷久而不愈等[5-6]?，F(xiàn)代研究表明，其主要成分有黃酮類、酚類、揮發(fā)油等，貫葉金絲桃中的金絲桃素在體內(nèi)具有抗抑郁、抗病毒、治療創(chuàng)傷等多種作用[7]。本研究針對(duì)貫葉金絲桃采用高效液相色譜法(HPLC)測定金絲桃苷、槲皮素的含量，為貫葉金絲桃藥材的質(zhì)量控制和安全有效提供理論依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器高效液相色譜儀(包括LC-15C泵，SPD-10A檢測器)(Shimadzu，日本)；島津高效液相色譜LC工作站；色譜柱：Hypersil CN(50 mm×4.6 mm，5 μm)(大連依利特分析儀器有限公司)；XW-80A型漩渦混合器；DSHZ-300型恒溫水浴振蕩器(江蘇實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)。

1.2試藥貫葉金絲桃(購自新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊維吾爾藥市場)，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院魏敏助理研究員鑒定為貫葉金絲桃HypericumperforatumL.的干燥地上部分；槲皮素對(duì)照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%，中國食品藥品檢驗(yàn)所提供，批號(hào)20091020)；金絲桃苷對(duì)照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%)；甲醇(色譜純)；正辛醇、磷酸、二甲亞砜(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Hypersil CN(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-4 mL·L-1磷酸(30/70)；流速1.0 mL·min-1；檢測波長：241 和360 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。見圖1。

圖1HPLC圖

A.空白甲醇；B.槲皮素和金絲桃苷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液；C.供試品溶液；1.槲皮素；2.金絲桃苷

Fig.1HPLC chromatograms

A.methanol；B.quercetin，hyperin mixed standard solution；C.test sample；1.quercetin；2.hyperin

2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取金絲桃苷、槲皮素對(duì)照品適量，分別加甲醇制成 40.1和44.8 mg·L-1的溶液，搖勻，即得。

2.3供試品溶液的制備取貫葉金絲桃藥材適量粉碎，過三號(hào)篩，粉末精密稱定0.40 g，置于50 mL量瓶中,加甲醇適量，超聲處理(功率500 W，頻率400 kHz)30 min，用甲醇定容至刻度，搖勻，濾液經(jīng)0.45 mm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4陰性液制備及干擾實(shí)驗(yàn)按處方制備不含貫葉金絲桃的陰性樣品，按2.3項(xiàng)下方法制備貫葉金絲桃空白溶液，依法測定，結(jié)果無干擾。

2.5系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)精密稱取槲皮素和金絲桃苷對(duì)照品1 mg，用DMSO配制成質(zhì)量濃度為1 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇配制成質(zhì)量濃度為0.02，0.10，0.20，1.00，5.00，20.00和50.00 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，置于4 ℃下保存，于上述色譜條件下測定，重復(fù)3次。色譜峰面積(Y)與質(zhì)量濃度(X)呈良好的線性關(guān)系，所得線性方程即為標(biāo)準(zhǔn)方程。槲皮素線性方程為：Y=55.078X+2 726.9，r=0.999 9；金絲桃苷線性方程為：Y=39.077X+2 335.5，r=0.999 9。結(jié)果表明：槲皮素和金絲桃苷在0.02～10.0和0.03～8.00 μg·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，與峰面積積分分值呈良好線性關(guān)系。

2.6精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，進(jìn)樣體積20 μL，在上述色譜條件下，測定色譜峰面積，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，日內(nèi)及日間精密度均小于2%，精密度較好。

2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密吸取同一供試品溶液20 μL，每隔2 h進(jìn)樣1次(4次)，在上述色譜條件下，測定槲皮素和金絲桃苷的峰面積，結(jié)果供試品在8 h內(nèi)的RSD分別為1.42%和1.37%，結(jié)果穩(wěn)定。

2.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn)按2.3項(xiàng)下方法制備同一批供試品6份溶液，按上述色譜條件測定槲皮素和金絲桃苷含量，RSD分別為0.32%和0.27%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.9回收率實(shí)驗(yàn)按2.3項(xiàng)下方法制備本品，取0.2 g，精密稱定6份，置于50 mL量瓶中，第1份作為空白，其余6份精密加入槲皮素和金絲桃苷對(duì)照品，在2.1項(xiàng)色譜條件下，進(jìn)行含量測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1槲皮素和金絲桃苷加樣回收率測定

Tab.1 Recovery of quercetin，hyperin

試藥稱樣量/g樣品含量/mg測定含量/mg回收量/mg回收率/%加樣回收率/%RSD/%槲皮素0.20020.43281.23090.451997.0598.041.420.20050.41031.13020.441498.890.20010.43371.20090.432098.18金絲桃苷0.20150.41281.21320.450897.1798.101.370.20190.43091.13890.431799.440.20080.41921.23410.429897.48

2.10 樣品測定取3批樣品，按2.3項(xiàng)下方法制備，分別精密吸取供試品溶液20 μL，在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測定，記錄峰面積，計(jì)算樣品中槲皮素和金絲桃苷的含量，結(jié)果3批貫葉金絲桃中槲皮素含量為7.15，6.79和7.55 mg·g-1，金絲桃苷含量為5.14，5.48和5.01 mg·g-1。

3討論

本研究中考察了甲醇、無水乙醇超聲法提取供試品[8-9]，結(jié)果發(fā)現(xiàn),無水乙醇提取的供試品分離色譜峰較少，其中只含有槲皮素成分，且雜質(zhì)峰較多，難以達(dá)到實(shí)驗(yàn)一測評(píng)價(jià)2種成分含量的效果。甲醇提取色譜峰分離得較好、提取效率較高。故選用甲醇為溶劑，超聲提取法提取。

HPLC測定金絲桃苷測定方法多采用《中國藥典》2010年版一部貫葉金絲桃藥材項(xiàng)下含量測定方法[2]，采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱，流動(dòng)相(乙腈-1 mL·L-1磷酸(16∶84))，本研究經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)、重復(fù)比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同時(shí)測定槲皮素和金絲桃苷的分離效果較差，因此本實(shí)驗(yàn)采用甲醇-4 mL·L-1磷酸[8]，槲皮素和金絲桃苷色譜峰分離度良好，基線平穩(wěn)。該方法測定貫葉金絲桃藥材中槲皮素和金絲桃苷含量，具有專屬性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。本研究組針對(duì)貫葉金絲桃專屬性成分進(jìn)一步研究，將提供詳實(shí)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]李艷，曹學(xué)麗，付鵬，等．貫葉金絲桃活性成分及其分離純化與檢測方法的研究進(jìn)展[J]．藥學(xué)進(jìn)展，2007，32(1)：15-18．

[2]國家藥典委員會(huì).中國藥典[S].一部. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:2-15.

[3]呂彩霞，張群.貫葉金絲桃膠囊的制備及臨床應(yīng)用[J].西北藥學(xué)雜志，2006，21(3):19-24.

[4]張愛均，李峰．益心酮泡騰片中金絲桃苷的含量測定[J]．江西中醫(yī)藥，2008，39(1)：51-53．

[5]樊敏偉，馬能溢，王冰，等．高效液相色譜法測定貫葉金絲桃提取物緩釋膠囊中金絲桃苷的含量[J]．中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2007，13(11)：9-10．

[6]譚道鵬，桂新，王崢濤．HPLC測定千柏鼻炎片中對(duì)羥基桂皮酸和金絲桃苷的含量[J]．中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2010，27(6)：532-535．

[7]王峰，高天兵，田金改. RP-HPLC法測定貫葉連翹片劑中有效成分金絲桃素和金絲桃苷的含量[J].藥物分析雜志，2000，20 (1):10-14.

[8]李敏芳，李慧，王學(xué)美.金絲桃苷藥理研究進(jìn)展[J].中國中醫(yī)藥信息雜志， 2008，15(4):102-104.

[9]曾建國，張勝.HPLC法分析貫葉連翹不同部位中金絲桃素的含量[J].西北藥學(xué)雜志，2000，15(4):56-59.