阿魏酸對小膠質(zhì)細胞炎性反應(yīng)的抑制作用

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2014-12-4 13:45網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.021.html

阿魏酸對小膠質(zhì)細胞炎性反應(yīng)的抑制作用

吳建良1， 沈敏敏1，楊水新1，王翔2,馬增春3

(1.湖州市中心醫(yī)院，浙江 湖州313000；2.湖州市第一人民醫(yī)院，浙江 湖州313000; 3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所,北京100850)

中國圖書分類號：R-332；R322.81；R345.57；R364.5；R392.12；R745.7

摘要：目的考察阿魏酸對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠小膠質(zhì)細胞炎性反應(yīng)的抑制作用及其機制。方法采用脂多糖(LPS)刺激小膠質(zhì)細胞(BV-2)活化，研究阿魏酸對炎癥反應(yīng)的抑制作用。采用硝酸還原酶法檢測阿魏酸對一氧化氮(nitric oxide, NO) 的影響，定量PCR和蛋白印跡分析阿魏酸對誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)和環(huán)氧合酶-2(COX-2)的影響，定量PCR技術(shù)和ELISA分析阿魏酸對炎性因子白細胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)的影響，進而檢測阿魏酸對促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)信號通路的影響。結(jié)果1.25～20 μmol·L`(-1)的阿魏酸對細胞活性無明顯影響。阿魏酸濃度依賴性降低NO的濃度，可以明顯抑制iNOS、COX-2的基因和蛋白表達，明顯抑制IL-1β、IL-6、TNF-α的表達，提前給予阿魏酸共同孵育對LPS引起的ERK信號通路的磷酸化有抑制作用。結(jié)論阿魏酸具有抑制小膠質(zhì)細胞活化，抑制神經(jīng)性炎癥的作用，其機制可能是阿魏酸通過ERK信號通路發(fā)揮對炎性分子的抑制作用。

關(guān)鍵詞：阿魏酸；小膠質(zhì)細胞；神經(jīng)性炎癥；一氧化氮合酶；環(huán)氧合酶-2；炎性因子

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.021

文章編號：

文獻標(biāo)志碼：A1001-1978(2015)01-0097-06

收稿日期:2014-09-04,修回日期:2014-11-28

基金項目：國家自然科學(xué)基金青年基金項目(No 81202936)；湖州市科技計劃項目(No 2013GY14)

作者簡介：吳建良(1963-)，男，碩士，副主任藥師，研究方向：中藥藥理學(xué)，Tel:0572-2023301-3401,E-mail: wjl6592@163.com

Abstract：AimTo evaluate the effects of ferulic acid (FA) on lipopolysaccharide (LPS)-induced neuroinflammation in microglia cells and its potential mechanisms. MethodsMicroglial activation was induced by stimulation with LPS, and the effects of FA pretreatment on microglial activation and production of proinflammatory mediators, nitric oxide/iNOS were investigated. The role of the mitogen-activated protein kinases in the antiinflammatory actions of FA in LPS-stimulated microglia was further elucidated. ResultsCell viability experiments revealed that FA did not produce cytotoxicity in microglia. FA significantly inhibited LPS-induced production of tumour necrosis factor-alpha (TNF-α), interleukin-6 (IL-6), interleukin-1beta (IL-1β), and nitric oxide(NO). Protein and mRNA levels of COX-2 and inducible nitric oxide synthase (iNOS) were also attenuated by FA. Further experiments on intracellular signalling mechanisms showed that inhibition of extracellular regulated kinase (ERK) contributed to the anti-neuroinflammatory actions of FA. ConclusionThe results suggest that FA inhibits LPS-induced microglial inflammation by partial targeting of ERK signalling and attenuation of ERK.

馬增春(1970-)，男，博士，研究員，研究方向：中藥藥理學(xué)，Tel:010-66932201,E-mail:13681121635@163.com

小膠質(zhì)細胞為腦內(nèi)的單核吞噬細胞，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的免疫效應(yīng)細胞，發(fā)揮內(nèi)源性免疫防御作用[1]。小膠質(zhì)細胞在特定病理條件下長期持續(xù)活化，會分泌神經(jīng)毒性物質(zhì)和炎性介質(zhì)，如白細胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)，白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、一氧化氮(nitric oxide, NO)等，這些物質(zhì)與小膠質(zhì)細胞相互作用，造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)放大和毒性產(chǎn)物增多，從而引起阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)等神經(jīng)退行性病變[2]。AD 的主要致病因素可能與細胞外積聚的不溶性β淀粉樣肽(β-amyloid peptide, Aβ)，激活小膠質(zhì)細胞引起的神經(jīng)元退行性病變[3]。因此抑制小膠質(zhì)細胞的激活，減少致炎介質(zhì)的釋放成為了篩選治療AD的重要藥物靶點[4]。

阿魏酸(ferulic acid, FA)是當(dāng)歸、川芎、升麻等中藥的有效成分之一，具有抑制Aβ沉積，減輕神經(jīng)細胞炎癥反應(yīng)，改善AD的行為癥狀[5-7]，但對小膠質(zhì)細胞的具體分子機制尚不明確。利用脂多糖( lipopolysaccharide, LPS) 激活小膠質(zhì)細胞建立AD 等神經(jīng)退行性疾病的炎癥模型是國際上公認(rèn)的造模手段[8-9]，本文采用LPS 處理小膠質(zhì)細胞BV-2 細胞株建立炎癥模型，旨在研究阿魏酸對神經(jīng)細胞炎癥反應(yīng)的抑制作用及分子機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞BV-2細胞株購自北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細胞中心，細胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃，5%二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中，細胞呈單層生長，達80%左右時傳代。

1.1.2試劑與儀器阿魏酸購自中國食品藥品檢定研究院，DMEM和胎牛血清購于Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)。NO試劑盒購自南京建成生物工程研究所，CCK-8 (Wako, Osaka, Japan)。RNApure 超純總RNA快速提取試劑盒(博邁德生物)，TransScriptTM One-Step RT-PCR SuperMix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，F(xiàn)ast SYBR@Green Master Mix (Applied Biosystems)。IL-1β、IL-6、TNF-α細胞因子酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒購自美國R&D 公司。兔抗鼠的環(huán)氧合酶-2(COX-2)抗體，β-actin 多克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology，兔抗鼠的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)多克隆抗體購自美國BD 公司，p38促分裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38)、c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases, JNK) 胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated kinase, ERK)、phospho-ERK, phospho-p38, phospho-JNK 等抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司。ECL(enhanced chemoluminescence)發(fā)光液購自Pierce公司。硝酸纖維膜及蛋白分子量marker購自普利萊公司的分裝產(chǎn)品。轉(zhuǎn)膜用濾紙為Bio-Rad 公司產(chǎn)品。

細胞培養(yǎng)箱(NAPCO 5410)，超凈工作臺(北京長城空氣凈化設(shè)備公司)，倒置顯微鏡(Nikon 120型)，Victor X5酶標(biāo)儀(PerkinElmer Waltham, MA, USA))PCR儀 (GeneAmp 2400)，核酸蛋白分析儀(Beckman DU640)，StepOne PlusTM Real Time PCR (Applied Biosystems)。

1.2方法

1.2.1CCK-8檢測細胞培養(yǎng)在96孔板(1×104細胞/孔)中，培養(yǎng)至細胞80%匯合，加入系列濃度的阿魏酸的0.1 mL培養(yǎng)液，培養(yǎng)1 h后，加入LPS (終濃度10 μg·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，各孔加入10 μL CCK-8，孵育4 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度。

1.2.2NO檢測細胞培養(yǎng)在48孔板(2×104細胞/孔)中，培養(yǎng)至細胞80%匯合，加入含有指定濃度的阿魏酸的0.2 mL培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，加入LPS (終濃度10 μg·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集每孔培養(yǎng)液，按NO檢測試劑盒操作方法進行檢測。

1.2.3定量PCR檢測細胞培養(yǎng)在6孔板(1×105細胞/孔)中，培養(yǎng)至細胞80 %匯合，加入含有指定濃度的阿魏酸的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中培養(yǎng)1 h后，加入LPS (終濃度10 μg·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，按試劑盒說明提取細胞總RNA，電泳分析表明 18 S和28 S條帶清晰可見，A260/A280比值在 1.7-2.0，總RNA片段完整未降解可用。取 2 μg RNA按照TransScriptTMOne-Step RT-PCR SuperMix 說明進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，42 ℃ 30 min；85 ℃ 5 min。用ABI StepOne PlusTM Real Time PCR進行PCR反應(yīng)，取 2.0 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物作為PCR反應(yīng)模板，加入上下游引物 20 μmol·L-1各 0.5 μL，F(xiàn)ast SYBR@Green Master Mix 10 μL，補充Rase-free water至 20 μL。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 20 S預(yù)變性，95 ℃ 3 S變性，60 ℃ 30 S退火，共 40個循環(huán)。每次擴增設(shè)置β-actin 內(nèi)參照，進行PCR擴增產(chǎn)物的實時定量分析，用2-(△△Ct) 方法分析。

Tab 1　Primers sequence used in Real Time PCR

1.2.4ELISA檢測細胞培養(yǎng)在24孔板(4×104細胞/孔)中，培養(yǎng)至細胞80%匯合，加入含有指定濃度阿魏酸的培養(yǎng)液，培養(yǎng)1 h后，加入LPS (終濃度10 μg·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，收集每孔培養(yǎng)液，按照ELISA 試劑盒說明書操作。

1.2.5蛋白印跡分析取指數(shù)生長期的BV-2 細胞接種于6 孔板中，1×108·L-1，待細胞貼壁后，加入各濃度藥物預(yù)孵育1 h后，加入LPS (終濃度10 μg·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，用預(yù)冷的PBS洗滌3次, 加100 μL的RIPA 裂解液，冰上作用30 min 后，用細胞刮把細胞刮下，按試劑盒方法提取蛋白，蛋白樣品進行定量分裝后，蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將膜用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，5%脫脂奶粉稀釋的一抗輕搖孵育4℃過夜，TBST洗膜3次，每次15 min，加入用5%脫脂奶粉稀釋的二抗(辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG)，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次15 min，ECL發(fā)光、壓片顯影。

1.2.6統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗結(jié)果符合正態(tài)性分布，組間和組內(nèi)比較采用單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1阿魏酸對細胞活性的影響為檢測對BV-2細胞活性的影響，指數(shù)培養(yǎng)期細胞與1.25~20 μmol·L-1的阿魏酸1 h后，加入LPS (終濃度10 μg·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，各孔加入10 μL CCK-8，孵育4 h后檢測細胞活性，如Fig 1所示，LPS減輕細胞活性，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 1.25～20 μmol·L-1的阿魏酸對細胞活性無明顯影響。以下實驗采用2.5~10 μmol·L-1的濃度范圍。

2.2阿魏酸對NO的影響NO是由神經(jīng)膠質(zhì)細胞活化所產(chǎn)生的炎癥因子之一，是神經(jīng)性炎癥的一個重要檢測指標(biāo)。本實驗采用硝酸還原酶法檢測阿魏酸對LPS 誘導(dǎo)BV-2細胞生成NO 的影響。結(jié)果如Fig 2所示，LPS 組的NO生成量明顯高于正常組，與LPS組相比，阿魏酸呈劑量依賴性降低NO的濃度。

Fig 1Cytotoxicity effects of FA on BV-2 cells

Fig 2Effect of FA on LPS-induced NO production in BV-2 cells

#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsLPS treatment group.

2.3阿魏酸對iNOS和COX-2的影響iNOS 和COX-2 分別是NO和PGE2生成的限速酶，正常時無表達或表達量低，在LPS刺激下表達量增加，并促使NO和PGE2的生成。采用定量PCR技術(shù)檢測阿魏酸對iNOS和COX-2 基因表達的影響，如Fig 3所示，正常組iNOS 和COX-2在基因水平表達量極少，經(jīng)LPS刺激后，iNOS、COX-2 基因表達量明顯上調(diào)，阿魏酸可以明顯抑制iNOS、COX-2的基因表達，并呈劑量依賴性。采用Western blot檢測阿魏酸對iNOS和COX-2蛋白表達的影響，結(jié)果如Fig 4所示，正常組iNOS 和COX-2在蛋白水平表達量極少，經(jīng)LPS刺激后，iNOS、COX-2 蛋白表達量明顯上調(diào)，阿魏酸可以明顯抑制iNOS、COX-2的蛋白表達，并呈劑量依賴性。

Fig 3Effect of FA on LPS-induced iNOS and COX-2

mRNA production in BV-2 cells

#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsLPS treatment group.

2.4阿魏酸對炎性因子的影響小膠質(zhì)細胞參與AD的炎癥反應(yīng)，小膠質(zhì)細胞一方面轉(zhuǎn)化為吞噬細胞，通過吞噬死亡神經(jīng)細胞殘骸和變性的突觸，有利于神經(jīng)元再生和死亡周邊區(qū)神經(jīng)元的存活，另一方面通過釋放和分泌一系列的神經(jīng)毒性物質(zhì)和炎癥因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α等，導(dǎo)致繼發(fā)性腦組織損傷。采用定量PCR技術(shù)檢測阿魏酸對炎性因子基因表達的影響，結(jié)果如Fig 5所示，LPS刺激后，IL-1β、IL-6、TNF-α基因表達量明顯上調(diào)，阿魏酸可以明顯抑制IL-1β、IL-6、TNF-α的基因表達，并呈劑量依賴性。采用ELISA檢測阿魏酸對炎性因子表達的影響，如Fig 6所示，LPS刺激后，IL-1β、IL-6、TNF-α表達量明顯上調(diào)，阿魏酸可以明顯抑制IL-1β、IL-6、TNF-α的表達，并呈劑量依賴性。 2.5Western blot檢測阿魏酸對促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)信號通路的影響通過Western blot檢測，發(fā)現(xiàn)提前給予阿魏酸共同孵育對LPS引起的ERK信號通路的磷酸化有抑制作用，推斷阿魏酸可能是通過ERK信號通路發(fā)揮對炎性分子的抑制作用，見Fig 7。

Fig 4Effect of FA on LPS-induced iNOS and COX-2 protein

production in BV-2 cells

#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsLPS treatment group.

Fig 5Effect of FA on LPS-induced cytokine release in gene level

#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsLPS treatment group.

Fig 6Effect of FA on LPS-induced cytokine

release detected by ELISA

#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsLPS treatment group.

3討論

由小膠質(zhì)細胞過度激活導(dǎo)致的神經(jīng)炎癥是造成神經(jīng)元突觸功能異常和認(rèn)知能力下降的最直接的原因[10]。無論AD的致病機制如何，過度的神經(jīng)炎癥是疾病發(fā)生和發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[11]。因此，以神經(jīng)炎癥為靶點，通過抑制小膠質(zhì)細胞的過度激活和促炎癥細胞因子的釋放能夠有效阻止疾病的惡化[12]。由于阿魏酸具有較強的神經(jīng)保護和抗炎活性[13-14]，因此，我們通過體外培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞建立神經(jīng)性炎癥模型，研究阿魏酸對LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞活化所產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)的抑制作用， 并重點探討阿魏酸抑制小膠質(zhì)細胞活化的分子機制。

iNOS催化產(chǎn)生一氧化氮是引起AD的主要發(fā)病機制，致炎細胞因子刺激膠質(zhì)細胞，誘導(dǎo)iNOS的表達。目前認(rèn)為AD病人腦中反應(yīng)性膠質(zhì)細胞過度表達iNOS是造成神經(jīng)元損傷的重要原因。因此，直接抑制iNOS和NO的產(chǎn)生，是炎癥治療的有效手段之一[15]。阿魏酸能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的BV-2細胞的NO的生成和iNOS蛋白的表達。COX-2是一些炎癥因子的誘導(dǎo)酶，LPS可誘導(dǎo)產(chǎn)生COX-2，阿魏酸能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的BV-2細胞的COX-2蛋白的表達。這可能是阿魏酸通過抑制小膠質(zhì)細胞活化，從而抑制神經(jīng)性炎癥的功能之一。

Fig 7　Effect of FA on LPS-induced MAPK kinases

Cells were preincubated with various concentrations of FA for 1h, and then stimulated with LPS. Total cells lysates were subjected to Western blot for phospho-ERK, phospho-p38, phospho-JNK. Similar results were obtained from at least three independent experiments. Relative phosphorylation levels of MAP kinases were normalized by each total protein.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsLPS treatment group.

在AD的急性炎癥反應(yīng)(包括膠質(zhì)細胞的激活等) 可發(fā)揮保護作用，從而將損傷局限化并增強神經(jīng)元的修復(fù)。如果急性炎癥未能充分消退，將會自然轉(zhuǎn)為在AD中常見的相對難以控制的慢性炎癥，此時膠質(zhì)細胞的活動往往是增加神經(jīng)元的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙進而產(chǎn)生神經(jīng)元的退行性病變。因此，盡管神經(jīng)炎癥并不一定是神經(jīng)退行性疾病的始發(fā)因素，但是持續(xù)的炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致疾病的進行性加重，使神經(jīng)炎癥與神經(jīng)元病變之間構(gòu)成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致更多的神經(jīng)元死亡[15]。小膠質(zhì)細胞長期持續(xù)活化，會分泌神經(jīng)毒性物質(zhì)和炎性介質(zhì)，如IL-1β、IL-6、TNF-α 、NO等[16]。IL-1β、IL-6、TNF-α是神經(jīng)炎癥中主要的促炎癥細胞因子，白介素介導(dǎo)了一個惡性循環(huán)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)過程，其中Aβ是核心的始動因素，引起膠質(zhì)細胞活化及神經(jīng)退行性病變。IL-1β、IL-6是起主導(dǎo)作用的前炎癥因素，當(dāng)異常過度激活時，就會產(chǎn)生損害及損傷。TNF-α在外周是一種炎性細胞因子前體，在AD 患者血清、腦脊液、腦皮層以及Aβ激活的膠質(zhì)細胞中TNF-α濃度都明顯升高[16]。本文研究結(jié)果表明LPS刺激后，IL-1β、IL-6、TNF-α表達量明顯上調(diào)，阿魏酸濃度依賴性抑制IL-1β、IL-6、TNF-α的表達。

MAPK 級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能被多種炎癥因子所激活，并對小膠質(zhì)細胞內(nèi)的iNOS 和致炎因子的表達進行調(diào)節(jié)。LPS 激活的神經(jīng)膠質(zhì)細胞可通過細胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK和p38 MAPK級聯(lián)增加iNOS 和炎性因子的表達[17]。因此，通過抑制MAPK 級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能成為治療神經(jīng)炎癥的一個新的靶點，本文研究結(jié)果表明阿魏酸可能是通過ERK信號通路發(fā)揮對炎性分子的抑制作用。

本文實驗證實，阿魏酸具有抑制小膠質(zhì)細胞活化，抑制神經(jīng)性炎癥的作用，其機制可能是阿魏酸通過ERK信號通路發(fā)揮對炎性分子的抑制作用。AD是一個復(fù)雜多機制的參與過程， 阿魏酸的保護作用是否涉及到其他機制，還有待繼續(xù)研究。

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Inhibitory effect of ferulic acid on neuroinflammation in LPS-activated microglia

WU Jian-liang1, SHEN Min-min1, YANG Shui-xin1, WANG Xiang2, MA Zeng-chun3

(1.HuzhouCentralHospital,HuzhouZhejiang313000,China; 2.TheFirstPeople’sHospitalofHuzhou,Huzhou

Zhejiang313000,China; 3.BeijingInstituteofRadiationMedicine,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100850,China)

Key words: ferulic acid; microglia; neuroinflammation；nitric oxide synthase；cyclo-oxygenase-2; inflammatory factor