鐵皮石斛多糖對(duì)高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞Bax、Bcl-2表達(dá)的影響

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2014-12-4 13:45網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.015.html

鐵皮石斛多糖對(duì)高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞Bax、Bcl-2表達(dá)的影響

張貝貝,劉文洪,李俊峰,葉志青

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州310053)

中國(guó)圖書(shū)分類號(hào)：R284.1；R322.123；R329.25；R587.106；R587.2

摘要：目的優(yōu)化鐵皮石斛多糖提取工藝，研究其對(duì)高糖誘導(dǎo)的靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的保護(hù)作用機(jī)制。方法在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化多糖的提取工藝；體外培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分為空白對(duì)照組、正常血糖組、高糖刺激組和不同鐵皮石斛多糖濃度+高糖刺激組，分別作用24和48 h后，采用MTT法檢測(cè)的HUVEC凋亡的影響，用RT-PCR法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞Bax、Bcl-2的表達(dá)情況。結(jié)果鐵皮石斛多糖提取的最優(yōu)條件為：提取次數(shù)為2.8次，液(mL)料比(g)15.75 ∶1，提取時(shí)間2 h，在此條件下，理論計(jì)算提取率達(dá)到25.1%，實(shí)測(cè)提取率為24.9%，與模型高度擬合。與正常組相比，高糖組抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，增強(qiáng)Bax的表達(dá)，抑制Bcl-2的表達(dá)，在高糖誘導(dǎo)下，鐵皮石斛多糖促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制Bax的表達(dá)，增強(qiáng)Bcl-2的表達(dá)。結(jié)論通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化的工藝，得率高，提取效果好。鐵皮石斛多糖可通過(guò)抑制高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞Bax的表達(dá)，增強(qiáng)Bcl-2的表達(dá)，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，在一定程度上可防治糖尿病血管病變。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛；多糖；響應(yīng)面優(yōu)化；糖尿病；內(nèi)皮細(xì)胞；Bax；Bcl-2

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.015

文章編號(hào)：

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A1001-1978(2015)01-0064-07

收稿日期:2014-09-02,修回日期:2014-10-20

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 31270051)；浙江省中醫(yī)藥研究計(jì)劃項(xiàng)目(2009CA003)，浙江省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(No 201121522)

作者簡(jiǎn)介：張貝貝(1989-)，男，碩士，研究方向：生物化工，E-mail:934889216@qq.com;

通訊作者劉文洪(1975-)，男，碩士，副教授，研究方向：生物制藥，，E-mail: lwh687@163.com

Abstract:AimTo optimize extraction of polysaccharides from Dendrobium officinale (DOP) and investigate the effects of DOP on the expression of Bax and Bcl-2 in vascular endothelial cell of human umbilical vein (HUVEC) by the induction of high sugar. MethodsResponse surface methodology (RSM) was employed to optimize the conditions for extraction of DOP on the basis of single factor experiment. The HUVEC cells were divided into the blank control group, the normal blood sugar group, the high sugar stimulation group and different drug concentration group plus the high sugar stimulation group. The growth condition of cells was examined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT), and RT-PCR was used to detect the expression of Bcl-2 Assaciated X protein (Bax) and B-cell lymphoma-2(Bcl-2) in vascular endothelial cells after 24 and 48 hours. ResultsThe optimal extraction time was 2 h and the optimal liquid-solid ratio was 15.75 ∶1(mL/g), and the optimal extraction frequency was 2.8. Under these optimized conditions, the extraction rate of polysaccharides was 25.1%, while the experimental extraction rate was 24.9%, which was highly fit with the regression model. Compared with normal sugar group, high sugar group reduced the growth of cells and enhanced the expression of Bax, and inhibited the expression of Bcl-2. DOP promoted the growth of cells in high sugar induction, inhibited the expression of Bax, and enhanced the expression of Bcl-2. ConclusionsThe process optimized through RSM has the extraction effect, and has certain practical significance. Through the down-regulation of the expression of Bax in vascular endothelial cells and the up-regulation of the expression of Bcl-2 by the induction of high sugar, DOP can restrain HUVEC, which could prevent and cure diabetic angiopathy to some extent.

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo，DOP)是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，具有益胃生津、滋陰清熱等功效，多糖是其主要活性成分[1]。研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛多糖體外能促進(jìn)脾細(xì)胞增殖，增加自然殺傷性細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活性[2]；體內(nèi)具有免疫調(diào)節(jié)活性，且不同分子量的多糖具有不同的免疫調(diào)節(jié)活性[3]，促進(jìn)干燥癥病人唾液分泌[4]，促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)[5]等作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，鐵皮石斛多糖對(duì)高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB因子的過(guò)量表達(dá)有較好的抑制作用，提示其可能對(duì)糖尿病血管病變具有保護(hù)作用[6]。

糖尿病對(duì)機(jī)體的危害源于糖尿病并發(fā)癥，尤其是糖尿病血管并發(fā)癥[7]，糖尿病血管并發(fā)癥是人類致死、致殘的重要原因。內(nèi)皮細(xì)胞受損被認(rèn)為是血管病變的首要步驟。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究都證實(shí)高糖可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[8]，促發(fā)活性氧自由基(ROS)的生成[9]，影響B(tài)ax，Bcl-2等基因表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。

鐵皮石斛的市場(chǎng)需求持續(xù)旺盛，但其野生資源有限，加之鐵皮石斛生活環(huán)境不斷遭受破壞，導(dǎo)致鐵皮石斛野生資源瀕臨滅絕，無(wú)法滿足市場(chǎng)需求。因此，提高鐵皮石斛多糖提取率，充分利用現(xiàn)有的藥材，是值得關(guān)注的，故本試驗(yàn)采用響應(yīng)曲面法探討鐵皮石斛多糖的最佳提取工藝條件，以期從工藝上提高藥材的使用效率。同時(shí)，鐵皮石斛已經(jīng)成為一種廣受關(guān)注的保健用品，探討其對(duì)一些疾病，尤其是慢性病的作用機(jī)制具有較好的研究?jī)r(jià)值，實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞培養(yǎng)及分子生物學(xué)技術(shù)，研究鐵皮石斛多糖對(duì)高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響及其Bax、Bcl-2的表達(dá)干預(yù)情況，從體外實(shí)驗(yàn)的角度探討鐵皮石斛多糖防治糖尿病血管病變的機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料鐵皮石斛原球莖，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系HUVEC由浙江中醫(yī)藥大學(xué)生物與制藥工程實(shí)驗(yàn)中心惠贈(zèng)。

1.2主要試劑葡萄糖、苯酚、濃硫酸、DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco，批號(hào)：H2387)、胰蛋白酶(1 ∶250，Gibco，批號(hào)：2750018)、胎牛血清(杭州四季青公司)、TRIzol(Invitrogen公司)、RT-PCR試劑盒(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3實(shí)驗(yàn)分組共分6組。A組(空白組)：新鮮DMEM培養(yǎng)基；B組(高糖刺激組)：新鮮DMEM培養(yǎng)液+葡萄糖22 mmol·L-1；C組(正常血糖組)：新鮮DMEM培養(yǎng)液+葡萄糖5.6 mmol·L-1；D組(鐵皮石斛多糖低劑量組)：含50 mg·L-1鐵皮石斛多糖的DMEM培養(yǎng)液+葡萄糖22 mmol·L-1；E組(鐵皮石斛多糖中劑量組)：含300 mg·L-1鐵皮石斛多糖的的DMEM培養(yǎng)液+葡萄糖22 mmol·L-1；F組(鐵皮石斛多糖高劑量組)：含500 mg·L-1鐵皮石斛多糖的DMEM培養(yǎng)液+葡萄糖22 mmol·L-1。

1.4鐵皮石斛多糖的提取的工藝優(yōu)化

1.4.1多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定采用苯酚-硫酸法[11]測(cè)定多糖。精密量取對(duì)照品溶液(0.6 g·L-1)0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別置50 mL容量瓶中，各加水至刻度，搖勻。分別精密量取上述溶液2 mL，置具塞試管中，各加4%苯酚溶液1 mL，混勻，迅速加入硫酸7.0 mL，搖勻，置40℃水浴中保溫30 min，取出后置冰水浴中放置5 min，取出，以相應(yīng)試劑為空白。照分光光度法，在490 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(Fig 1)。

Fig 1　Standard curve of polysaccharides

1.4.2鐵皮石斛多糖含量的測(cè)定采用繪制標(biāo)準(zhǔn)法相同的方法，根據(jù)多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線得出供試品溶液中鐵皮石斛多糖的重量(mg)，計(jì)算提取率。多糖提取率按下式計(jì)算：多糖提取率/%=多糖含量/藥材質(zhì)量×100%。

1.4.3工藝流程原球莖60 ℃烘干→粉碎→熱水浸提→離心→濃縮→85%乙醇沉淀→離心分離→沉淀物無(wú)水乙醇抽洗3次，乙醚抽洗2次→鐵皮石斛原球莖多糖→水溶解→Sevage法去蛋白→再用85%乙醇沉淀為粗品多糖。

1.4.4單因素試驗(yàn)以多糖提取的初始工藝為基礎(chǔ)(液料比10 ∶1，提取時(shí)間為3 h，提取次數(shù)3次)，以鐵皮石斛多糖提取率為指標(biāo)分別考察提取時(shí)間、提取次數(shù)、液料比3個(gè)因素對(duì)鐵皮石斛多糖提取的影響，每個(gè)因素設(shè)定5個(gè)梯度，各因素水平如下：液料比為5 ∶1、10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1，提取時(shí)間為1、2、3、4、5 h，提取次數(shù)為1、2、3、4、5次。分析各因素對(duì)鐵皮石斛多糖提取的影響，確定影響因素水平。

1.4.5響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝根據(jù)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)所得結(jié)果，選取液料比、提取時(shí)間、提取次數(shù)3個(gè)對(duì)多糖提取率影響顯著的因素，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法優(yōu)化鐵皮石斛多糖提取工藝(Tab 1)。并利用統(tǒng)計(jì)軟件design-expert對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，預(yù)測(cè)鐵皮石斛多糖提取的最佳工藝參數(shù))。

Tab 1　Factors and levels used for response surface analysis

1.5MTT法檢測(cè)HUVEC細(xì)胞的活性取指數(shù)生長(zhǎng)期1×108·L-1細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞融合度達(dá)85%以上，A和B對(duì)照組及C、D、E、F鐵皮石斛多糖處理組，加入相應(yīng)劑量的鐵皮石斛多糖，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置6個(gè)平行孔。培養(yǎng)24或48 h后，將帶有藥物的培養(yǎng)液移除，加入MTT作用4 h后，吸出MTT，加入DMSO震蕩10 min，測(cè)570 nm波長(zhǎng)處吸光度(A)值，按照以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率/%=(1-處理組OD570值/空白對(duì)照組OD570值)×100%。

1.6RT-PCR法檢測(cè)Bax、Bcl-2 mRNA的表達(dá)

1.6.1細(xì)胞總RNA的提取收集刺激后的細(xì)胞，用PBS洗2次，加入1 mL TRIzol，反復(fù)吹打，室溫孵育5 min后，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入200 μL氯仿，大力搖晃15 s，冰上孵育5 min，4 ℃，12 000 r·min-1離心15 min(下同)。將上相轉(zhuǎn)移至另1.5 mL離心管中，加入500 μL異丙醇，振蕩混勻后室溫孵育10 min，12 000 r·min-1離心15 min，棄上清。加入1 mL 75%乙醇，振蕩混勻，12 000 r·min-1離心15 min，棄去上清。自然干燥5~10 min，加入適量0.1% DEPC水，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2RT-PCRβ-actin、Bcl-2和Bax基因引物均根據(jù)Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件自行設(shè)計(jì)，再由上海生物工程公司合成：β-actin F:5′- TCCTGGGTGAGTGGAGACTG-3′；R:5′-ATGCCTGAGAGGGAAATGAGG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為105 bp。Bcl-2 F:5′-GAAGCACAGATGGTTGATGG-3′；R:5′-CAGCCTCACAAGGTTCCAAT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為496 bp。Bax F:5′-CACAACTCAGCGCAAACATT-3′；R:5′-ACAGCCATCTCTCTCCATGC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為519 bp。

cDNA合成體系(30 μL)：15 μL細(xì)胞總RNA，5×RT Buffer 6 μL，dNTP Mixture(10 mmol·L-1)3 μL，Oligo-dT 1.5 μL，RNase inhibitor(40 U/μL)1.5 μL，AMV Reverse Transcriptase 1.5 μL， RNase free H2O 1.5 μL。反應(yīng)條件：室溫放置10 min，55 ℃45 min，95 ℃ 5 min，冰浴5 min。

PCR擴(kuò)增體系(50 μL)：cDNA2 μL，Premix Taq (LA TaqVersion 2.0) 25 μL，Bcl-2F、Bcl-2R、β-actinF、β-actinR各1 μL(濃度均為20 nmol·L-1)，無(wú)菌水21 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，36個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，4 ℃ 5min。Bax基因擴(kuò)增條件同Bcl-2，退火溫度改為54 ℃。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，使用凝膠圖像分析軟件測(cè)定目的條帶和β-actin的灰度值，以兩者的比值表示RT-PCR目的產(chǎn)物的相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1單因素實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鐵皮石斛多糖隨著各因素的變化而變化，提取次數(shù)大于3次以后，多糖提取率基本保持不變(Fig 2)；鐵皮石斛多糖提取率隨著液料比的增加而增加，當(dāng)液料比大于15 ∶1時(shí)，多糖提取率反而下降(Fig 3)；提取時(shí)間為2.0 h時(shí)，提取率最大，此后，不增反減(Fig 4)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，提取次數(shù)為3次，液料比為15 ∶1，提取時(shí)間為2.0 h是鐵皮石斛多糖提取的最佳工藝水平。

Fig 2　Impact of extraction frequency on extraction of DOP

Fig 3　Impact of solid-liquid ratio on extraction of DOP

Fig 4　Impact of extraction time on extraction of DOP

2.2響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)及結(jié)果對(duì)鐵皮石斛多糖提取工藝的結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)對(duì)鐵皮石斛多糖提取工藝的結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，可得鐵皮石斛多糖提取率化率(Y)對(duì)液料比(A)、提取時(shí)間(B)、提取次數(shù)(C)的二元多次回歸模型為：Y=24.92+0.75A-0.61B+0.66C-0.20AB+0.85AC+0.43BC-3.07A2-1.45B2-2.20C2

Tab 2　Design results of Box-Behnken

Tab 3　Variance analysis of regression equantion

2.2.2各因素之間的交互作用根據(jù)以上得到的回歸方程來(lái)繪制分析圖，考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀，F(xiàn)ig 5、6、7直觀地給出各個(gè)因素交互作用的響應(yīng)面的3D圖。圖的分析結(jié)果表明，液料比和提取時(shí)間鋅之間的交互關(guān)系非常明顯，表現(xiàn)為曲面較陡，等高線為橢圓形(Fig 6)；液料比和提取次數(shù)、提取次數(shù)和提取時(shí)間交互關(guān)系差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表現(xiàn)為曲面平緩，等高線為圓形(Fig 5、7)。這與方差分析結(jié)果一致。從響應(yīng)面圖可以看出此試驗(yàn)?zāi)Ｐ投寄軌蜻_(dá)到極值點(diǎn)。

Fig 5Effect of liquid-solid ration and extraction times on yield of DOP

Fig 6Effect of liquid-solid ration and extraction time on yield of DOP

Fig 7Effect of extraction times and extraction time on yield of DOP

2.2.3響應(yīng)面預(yù)測(cè)及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)通過(guò)回歸模型預(yù)測(cè)的鐵皮石斛多糖提取的最佳工藝條件為：液料比15.75，提取次數(shù)為2.8次，提取時(shí)間為2 h在此條件下，多糖提取率理論上可達(dá)25.1%。在響應(yīng)面分析法求得的最佳條件下對(duì)鐵皮石斛多糖提取3次，多糖提取率平均為24.9%，驗(yàn)證值與回歸方程所預(yù)測(cè)值相吻合得很好，驗(yàn)證了此響應(yīng)面分析方法的可行性。

2.3不同濃度的鐵皮石斛多糖對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響作用24 h后，不同給藥組細(xì)胞完全貼壁。在倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)A和C組細(xì)胞正常生長(zhǎng)，為短梭形或扁平多角形(Fig 8A、C)；B組細(xì)胞變圓，喪失原有的細(xì)胞形態(tài)，變得不均一，排列不規(guī)則，出現(xiàn)大量的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象(Fig 8B)；隨著鐵皮石斛多糖濃度的增加，HUVEC細(xì)胞形態(tài)逐漸恢復(fù)。D組細(xì)胞變圓，但是細(xì)胞凋亡較少(Fig 8D)，E組總體細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，趨向于正常細(xì)胞，但仍有少數(shù)的不規(guī)則圓形細(xì)胞(Fig 8E)；F組細(xì)胞輪廓清楚，細(xì)胞與正常組細(xì)胞無(wú)差異(Fig 8F)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，高糖誘導(dǎo)下，鐵皮石斛多糖能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制細(xì)胞的凋亡。

Fig 8　The growth condition of different

A ：blank control B： high sugar stimulation C： normal blood sugar D： low dose drug E： middle dose drug F ：high dose drug.

2.4MTT法檢測(cè)HUVEC細(xì)胞的活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度鐵皮石斛多糖作用于HUVEC細(xì)胞24 h和48 h后，與正常血糖組A相比，B組細(xì)胞明顯受到抑制，差異有顯著性(P<0.01)；同一時(shí)間，不同濃度處理組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，且隨著劑量的增加，抑制率降低；同一濃度，隨作用時(shí)間延長(zhǎng)，抑制率升高(Tab 4)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，通過(guò)高糖誘導(dǎo)，鐵皮石斛多糖呈劑量依賴性抑制HUVEC細(xì)胞的凋亡，時(shí)間依賴性促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

Tab 4　Effects of polysaccharides of Dendrobium candidum

**P<0.01vsC;★★P<0.01vsB;#P<0.05,##P<0.01vsD.

2.5鐵皮石斛多糖對(duì)Bcl-2mRNA表達(dá)的影響不同濃度的鐵皮石斛多糖處理刺激HUVEC 24 h后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和正常血糖組比較，高糖刺激組Bcl-2 mRNA表達(dá)量降低；高糖(22 mmol·L-1)誘導(dǎo)下，Bcl-2 mRNA表達(dá)量隨著鐵皮石斛的濃度增加而增加(Fig 9-a)。條帶的灰度值統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，與B組比較，A、C組Bcl-2/β-actin灰度比值降低，不同劑量的多糖組Bcl-2/β-actin灰度比值，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨著鐵皮石斛多糖的鐵皮石斛多糖濃度增加，Bcl-2/β-actin灰度比值逐漸增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(Fig 9-b)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高糖誘導(dǎo)下，鐵皮石斛多糖能夠抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，鐵皮石斛多糖提取液對(duì)Bcl-2 mRNA表達(dá)上調(diào)作用存在劑量依賴關(guān)系。

2.6鐵皮石斛多糖對(duì)Bax mRNA表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高糖(22 mmol·L-1)刺激HUVEC 24 h后，可增加Bax mRNA表達(dá)量，而在鐵皮石斛多糖的作用下，可抑制高糖誘導(dǎo)的Bax mRNA表達(dá)，且隨著鐵皮石斛活性成分濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)(Fig 10A)。條帶的灰度值統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，與B組比較，A和C組Bax/β-actin灰度比值降低，鐵皮石斛低、中和高劑量組Bax/β-actin灰度比值降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與D組比較，Bax/β-actin灰度比值逐漸降低，差異均有顯著性(P<0.05)(圖10B)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高糖誘導(dǎo)下，鐵皮石斛多糖能夠抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，鐵皮石斛多糖提取液對(duì)Bax mRNA表達(dá)下調(diào)作用存在劑量依賴關(guān)系。3討論

鐵皮石斛是珍貴的藥用植物，早在上世紀(jì)80年代野生鐵皮石斛被國(guó)家列為重點(diǎn)保護(hù)的珍惜瀕危藥用植物，具有極高的藥用價(jià)值。鐵皮石斛能夠保持胃張力，提高生產(chǎn)的體液和緩解癥狀(如喉嚨干渴與視力模糊干澀[12])?，F(xiàn)代臨床和藥理研究證明，鐵皮石斛具有抗衰老、抗腫瘤、降低血糖和提高免疫等作用，對(duì)惡性腫瘤的輔助治療，對(duì)慢性胃炎、糖尿病、慢性咽炎和久病體虛免疫功能低下等方面都有廣泛的應(yīng)用[13]。鐵皮石斛主要活性成分多糖具有明顯的抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)功能，研究表明，多糖類物質(zhì)不僅能夠提高免疫系統(tǒng)功能，而且具有較好的抗癌[14]、抗氧化[15]等生物活性。

Fig 9　Effects of each group on expression of

M:2.0 kb marker; A ：blank control B： high sugar stimulation C： normal blood sugar; D： low dose drug E： middle dose drug F ：high dose drug.*P<0.05vsB;##P<0.01vsD.

Fig 10　Effects of each group on expression of Bax mRNA

M:2.0 kb marker; A ：blank control B： high sugar stimulation C： normal blood sugar; D： low dose drug E： middle dose drug F ：high dose drug.**P<0.01vsB;##P<0.01vsD.

實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素和響應(yīng)面優(yōu)化鐵皮石斛多糖的提取工藝，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)提取次數(shù)為2.8次，液料比15.75 ∶1，提取時(shí)間2 h時(shí)，鐵皮石斛的提取率達(dá)到最大，此時(shí)提取率為25.1%，影響鐵皮石斛多糖提取的因素順序依次為：液料比>提取次數(shù)>提取時(shí)間；體外細(xì)胞培養(yǎng)觀察和細(xì)胞活性的檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明，鐵皮石斛多糖呈劑量依賴性抑制HUVEC的凋亡，時(shí)間依賴性促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，而在高糖誘導(dǎo)下，鐵皮石斛多糖促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞的凋亡；RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)藥物刺激作用24 h時(shí)，鐵皮石斛多糖可以不同程度的抑制高糖誘導(dǎo)的Bax基因表達(dá)，增強(qiáng)Bcl-2基因表達(dá)，并呈劑量依賴性。研究結(jié)果說(shuō)明，鐵皮石斛提取物可能從基因水平抑制高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Bax mRNA表達(dá)，增強(qiáng)Bcl-2 mRNA表達(dá)，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，這可為鐵皮石斛及其活性物質(zhì)在臨床應(yīng)用及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為防治糖尿病血管病變提供參考。

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Effects of polysaccharides fromDendrobiumofficinaleon expression

of Bax and Bcl-2 in vascular endothelial cells induced by high sugar

ZHANG Bei-bei, LIU Wen-hong, LI Jun-feng, YE Zhi-qing

(ZhejiangUniversityofTraditionalChineseMedicine,Hangzhou310053,China)

Key words：Dendrobiumofficinale; polysaccharides; response surface methodology; diabetes Mellitus; endothelial cells; Bax; Bcl-2