SIRT1在丙戊酸對肝細胞毒性中的作用研究

網(wǎng)絡出版時間：2014-12-4 13:45網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.008.html

◇論著◇

SIRT1在丙戊酸對肝細胞毒性中的作用研究

侯相瑜，金晶，李宏亮，柳睿，范曉梅，黃民

(中山大學藥學院藥物代謝與藥動學實驗室，廣東 廣州510006)

中國圖書分類號：R322.47；R329.2；R394.2；R971.6；R977.6

摘要：目的探討沉默信息調節(jié)因子1(SIRT1)在丙戊酸對肝臟HepG2細胞毒性中的作用。方法在HepG2細胞中，丙戊酸(2 mmol·L`(-1))孵育6、12、24、48 h，或丙戊酸(0.5、1、2 mmol·L`(-1))分別孵育48 h，通過Western blot方法檢測丙戊酸對SIRT1蛋白表達的影響；通過瞬時轉染SIRT1表達質粒和si-SIRT1，采用SRB方法，觀察對SIRT1基因進行過表達和抑制后，丙戊酸對HepG2細胞毒性的改變情況。結果丙戊酸對SIRT1的表達有抑制作用，且具有時間和劑量依賴性。過表達SIRT1后，HepG2細胞對丙戊酸的毒性敏感性下降，轉染前后IC50分別為(4.025±0.47)、(10.87±1.50) mmol·L`(-1)；而干擾SIRT1后，HepG2細胞對丙戊酸的毒性敏感性增加，轉染前后IC50分別為(1.938±0.16)、(0.663±0.05) mmol·L`(-1)。結論丙戊酸可抑制SIRT1的蛋白表達，并且過表達SIRT1可拮抗丙戊酸對肝細胞的毒性作用。

關鍵詞：丙戊酸;SIRT1;蛋白表達;肝細胞毒性;HepG2;細胞生長

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.008

文章編號：

文獻標志碼：A1001-1978(2015)01-0031-04

收稿日期:2014-09-25,修回日期:2014-11-12

基金項目:國家自然科學基金資助項目(No 81102886)；廣東省醫(yī)學科研基金資助項目(No B2012077)

作者簡介:侯相瑜(1989-)，男，碩士生，研究方向: 藥物代謝及藥物基因組學,E-mail: houxiangyu1111@126.com;

通訊作者金晶(1980-)，女，博士，講師，研究方向: 臨床藥理學，，Tel: 020-39943034，E-mail: jinjing@mail.sysu.edu.cn; 黃民(1963-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向:臨床藥理學與藥物基因組學，，Tel: 020-39943011，E-mail: huangmin@mail.sysu.edu.cn

Abstract:AimTo detect the role of sirtuin1 (SIRT1) in hepatotoxity caused by valproic acid (VPA). MethodsThe changes of SIRT1 expression of HepG2 cells were detected by Western blot. And then SIRT1 plasmid or siRNA was transfected to construct SIRT1 overexpressed or knocked-down HepG2 cells. Furthermore, SRB assays were taken to observe the changes of viability of these cells exposed to VPA. ResultsVPA suppressed SIRT1 expression in a time and dose-dependent manner. SIRT1 overexpression showed a protective effect to the cytotoxicity caused by

沉默信息調節(jié)因子1(silent information regulator 1, SIRT1)是Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶Sirtuin家族的一個亞型，可以催化組蛋白和非組蛋白的賴氨酸殘基的乙?；牧呀鈁1]。研究表明[2-4]，SIRT1使靶蛋白去乙?；诳寡趸瘧ぁ⒖寡?、抗凋亡，調節(jié)線粒體生物合成及代謝，重塑、學習、記憶等過程中發(fā)揮作用。

丙戊酸(valproic acid，VPA)作為一線抗癲癇藥物，是特發(fā)性全面性癲癇及癲癇全面性發(fā)作的首選用藥，也是部分性發(fā)作、繼發(fā)性發(fā)作及腦病性發(fā)作的次選用藥[5]。然而個體差異大、不良反應多是困擾VPA臨床用藥的關鍵問題。它引起的不良反應主要包括：肝毒性、體重增加、胃腸道不適、血液系統(tǒng)毒性、致畸等[6]。VPA主要通過增加抑制性神經(jīng)遞質γ-氨基丁酸(GABA)水平而起到抗癲癇的作用[6]。此外，有報道稱VPA可以抑制Sirt1，而導致小鼠胚胎發(fā)育畸形[7]。研究表明[8]，VPA可以通過影響ABCG1、CPT1A等轉運體和TGF-β等轉錄因子抑制HepG2的生長，而這種抑制作用是否與SIRT1有關目前還不清楚。因此，本文在細胞水平觀察SIRT1在VPA對肝臟HepG2細胞毒性中的作用。

1材料與方法

1.1藥品和試劑VPA、煙酰胺購買自Sigma公司，SIRT1一抗、β-actin一抗、GAPDH一抗，羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗購買自CST公司，HepG2細胞株購買自中國科學院上海生科院細胞資源中心，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購買自Hyclone公司，Lipofectamine 2000購買自Invitrogen公司，SIRT1過表達質粒購買自Addgene公司，siRNA購買自廣州銳博公司，Kiton Red S (SRB) 購買自阿法埃莎(天津)化學有限公司

1.2細胞培養(yǎng)及轉染HepG2細胞培養(yǎng)于FBS體積分數(shù)為0.1的DMEM培養(yǎng)液中，放置于37°C、5% CO2、90%相對濕度培養(yǎng)箱中。待細胞密度至70%，根據(jù)Lipofectamine 2000轉染試劑的說明書轉染pcDNA 3.1-SIRT1、pcDNA 3.1空載質粒或者siRNA進入細胞中。

1.3藥物處理用培養(yǎng)基將VPA和煙酰胺稀釋成梯度濃度，待細胞密度至70%時給藥或在質粒轉染后24 h、siRNA轉染60 h后給藥，實驗重復 3次。

2結果

2.1VPA抑制SIRT1表達呈現(xiàn)時間依賴性如Fig 1所示，隨著VPA(2 mmol·L-1)與肝HepG2細胞孵育的時間的延長，細胞內SIRT1蛋白表達不斷下降，而在12、24、48 h明顯降低(P<0.05)。提示VPA可以抑制SIRT1表達，并呈現(xiàn)時間依賴性。

2.2VPA抑制SIRT1表達呈現(xiàn)劑量依賴性不同劑量的VPA(0.5、1、2 mmol·L-1)和1 mmol·L-1陽性藥物煙酰胺(nicotinamide，NAM)與HepG2細胞孵育48 h。如Fig 2所示，與對照組相比，隨著VPA劑量的增加，SIRT1蛋白表達明顯降低(P<0.05)；2 mmol·L-1VPA比陽性藥物1 mmol·L-1煙酰胺的抑制效果更明顯。說明VPA可以抑制SIRT1表達，并呈現(xiàn)劑量依賴性。

2.3SIRT1高表達拮抗VPA引起的細胞毒性在HepG2細胞中分別轉染SIRT1表達質粒pcDNA 3.1-SIRT1及其空載質粒pcDNA 3.1 24 h后，加入1 mmol·L-1的VPA孵育48 h。由Fig 3A可知，Western blot結果顯示，與正常組相比，SIRT1過表達組SIRT1含量上調，而且VPA對SIRT1過表達組細胞仍有抑制作用。然后在SIRT1正常組和過表達組中分別加入梯度濃度的VPA孵育48 h后檢測抑制率，IC50分別為(4.025±0.47)、(10.87±1.50) mmol·L-1(P<0.05)，說明SIRT1高表達可拮抗VPA對細胞的毒性作用(Fig 3B)。

Fig 1　Western blot analysis of SIRT1 expression in HepG2 incubated

*P<0.05,**P<0.01vs0 h

Fig 2　Western blot analysis of SIRT1 expression in

*P<0.05vscon

Fig 3Over expression of SIRT1 on VPA cytotoxity. (A) SIRT1 expression in HepG2 cells after transfected with SIRT1 plasmid and incubated with VPA. (B) The inhibitory effect of VPA on HepG2 cells and SIRT1 over-expressed HepG2 cells(n=3)

*P<0.05vsCon

2.4SIRT1 siRNA使細胞對VPA的毒性敏感性增加在HepG2細胞中分別轉染SIRT1 siRNA及其對照si-con 24 h后，加入1 mmol·L-1的VPA孵育48 h。由Fig 4A可知，Western blot結果顯示，SIRT1 siRNA成功干擾SIRT1表達，且VPA進一步抑制SIRT1低表達細胞中SIRT1表達。然后在SIRT1正常組和低表達組的細胞中加入梯度濃度的VPA孵育48 h后檢測抑制率，IC50分別為(1.938±0.16)，(0.663±0.05) mmol·L-1(P<0.05)，說明干擾SIRT1表達使HepG2細胞對VPA的毒性敏感性增加(Fig 4B)。

3討論

VPA是廣譜高效的抗癲癇藥物，然而限制其使用的一個重要缺陷就是它的肝毒性。研究表明[9-10]，VPA的代謝產(chǎn)物為2-丙基-4-戊烯酸(2-propyl-4-pentenoic acid，4-ene VPA)；VPA和4-ene VPA在線粒體基質或胞質中經(jīng)中鏈脂酰輔酶A合成酶活化為VPA-CoA和4-ene VPA-CoA，在胞質中的復合物經(jīng)肉堿棕櫚酰轉移酶轉移進入線粒體基質，從而抑制線粒體β氧化，同時消耗大量輔酶A和肉毒堿，導致肝細胞脂質沉積和空泡變性，是VPA導致肝毒性的主要原因。VPA也可以通過抑制Nrf2、誘導Keap1而誘導內質網(wǎng)應激，造成細胞損傷[11]。

據(jù)報道，VPA的治療窗為40~100 mg·L-1(300~700 μmol·L-1)，而VPA的代謝存在較大的個體差異，血藥濃度范圍可以達到14.6~135 mg·L-1(100～1000 μmol·L-1)[12]。本課題的研究發(fā)現(xiàn)，VPA在1 mmol·L-1和2 mmol·L-1的劑量時會明顯抑制SIRT1的表達，而且這種抑制作用也呈現(xiàn)時間依賴性，同時對肝HepG2細胞產(chǎn)生明顯的毒性。這個實驗結果提示我們臨床上觀察到的VPA的肝毒性可能與抑制SIRT1蛋白表達有關。

Fig 4Knockdoun of SIRT1 on VPA cytoxity (A) SIRT1 expression in HepG2 cells after transfected with SIRT1 siRNA and incubated with VPA. (B) The inhibitory effect of VPA on HepG2 cells and SIRT1 knocked-down HepG2 cells(n=3)

*P<0.05vsSi-con

為驗證SIRT1在VPA引發(fā)毒性中的作用，通過轉染SIRT1表達質粒，觀察VPA對細胞生長的影響，結果顯示，SIRT1高表達的HepG2細胞中VPA的生長抑制作用減弱，提示SIRT1對VPA引發(fā)的肝細胞毒性中起到保護作用。然后通過轉染SIRT1 siRNA，構建低表達SIRT1的HepG2細胞。結果顯示，VPA對SIRT1低表達細胞生長的抑制作用與正常表達細胞相比更明顯，提示SIRT1低表達使細胞對VPA的毒性敏感性增加。SIRT1可以通過使肝細胞中LXR、PGC-1α、PPARα、FOXO1等核受體和轉錄因子去乙酰化而發(fā)揮促進脂肪酸氧化、抑制脂肪酸生成、調節(jié)膽固醇平衡、抗凋亡抗氧化應激等作用，從而起到肝保護作用[2-3,13]。VPA抑制SIRT1后，這些核受體與轉錄因子的活性及其調控的下游有肝保護作用的基因表達是否發(fā)生改變，值得繼續(xù)深入研究。

綜上所述，本研究闡明了VPA可明顯下調SIRT1的蛋白表達水平，并引發(fā)細胞毒性。為使用SIRT1激動劑預防或治療VPA引發(fā)肝毒性存在潛在可能提供理論依據(jù)。

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Valproic acid suppresses SIRT1 inducing hepatotoxicity

HOU Xiang-yu, JIN Jing, LI Hong-liang, LIU Rui, FAN Xiao-mei, HUANG Min

(LabofDrugMetabolismandPharmacokinetics,SchoolofPharmaceuticalSciences,

SunYat-senUniversity,Guangzhou510006,China)

VPA, and the IC50before and after transfection was (4.025±0.47) and (10.87±1.50) mmol·L-1respectively. Moreover, transfection of SIRT1 siRNA sensitized HepG2 cells to VPA, and the IC50before and after transfection was (1.938±0.16) and (0.663±0.05) mmol·L-1respectively. ConclusionVPA suppressed SIRT1 expression in HepG2 cells and overexpression of SIRT1 could reduce cytotoxicity induced by VPA.

Key words: valproic acid; sirtuin 1; protein expression; hepatotoxity; HepG2; cell viability

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