不同菌株發(fā)酵沙棘果渣、沙棘葉、沙棘籽渣營(yíng)養(yǎng)成分變化的研究

■戚曉舟 宋晨光 凌 飛 高錦明 王高學(xué)

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院，陜西楊凌 712100）

畜牧業(yè)是中國(guó)北方許多省區(qū)的支柱產(chǎn)業(yè)，但是，由于飼料嚴(yán)重不足，長(zhǎng)期以來(lái)限制了畜牧業(yè)的正常發(fā)展。因此，開發(fā)飼料資源，尋找代用品，也是我國(guó)農(nóng)業(yè)實(shí)施可持續(xù)發(fā)展策略的迫切需要。

沙棘(Hippophae rhamnoides Linn)是近年來(lái)在中國(guó)北方地區(qū)廣為栽培的一種優(yōu)良灌木樹種，它不僅適應(yīng)性強(qiáng)，能生長(zhǎng)在干旱貧瘠之地，而且枝葉、果實(shí)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，作為飼料開發(fā)的潛力很大[1]。研究表明，沙棘葉是一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)種類多。含量豐富、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的優(yōu)質(zhì)畜禽飼料資源[2-3]。有研究人員對(duì)沙棘葉、渣的毒理學(xué)特性作了試驗(yàn),結(jié)果表明，長(zhǎng)期飼喂動(dòng)物安全可靠，無(wú)蓄積性毒害，對(duì)畜禽的生長(zhǎng)、生產(chǎn)性能具有不同程度的促進(jìn)作用[4]。劉緒川等[4-5]的研究表明，雞添加3%～5%的沙棘葉,可提高產(chǎn)蛋率8.7%～11.3%,并使蛋黃色澤明顯變深,膽固醇含量降低。馬三保[6]研究表明，沙棘枝葉比小麥秸、玉米秸、大豆秸和苜蓿草粉的干物質(zhì)降解率有明顯的提高，超過了其它秸稈、飼草的降解水平，因此沙棘葉作為一種粗纖維飼料，提高了其粗纖維的利用率。研究表明，沙棘果渣對(duì)畜禽的生長(zhǎng)和生產(chǎn)性能的提高具有不同程度的促進(jìn)作用，能提高飼料利用率和蛋黃胡蘿卜素含量，并具有降低膽固醇、促進(jìn)免疫器官生長(zhǎng)發(fā)育的功能[2，7]。然而目前對(duì)發(fā)酵后沙棘果渣、沙棘葉的營(yíng)養(yǎng)成分的分析研究較少。

本試驗(yàn)以沙棘果渣，沙棘葉，沙棘籽渣為試驗(yàn)材料，通過利用不同菌種，在一定條件下對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵，探討發(fā)酵對(duì)沙棘果渣、沙棘葉、沙棘籽渣營(yíng)養(yǎng)成分變化的影響，為其飼料化高效利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

黑曲霉（A.niger）、木霉（T.viride）、毛霉（Mucoraceae）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、酒酵母(S.cerevisine)，由西北農(nóng)林科技大學(xué)來(lái)航線教授贈(zèng)送。

1.1.2 試驗(yàn)原料

沙棘果渣、沙棘籽渣、沙棘葉由西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院高錦明教授提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

普通肉湯培養(yǎng)基：牛肉浸膏3～5 g、蛋白胨10 g、磷酸氫二鉀0.5 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 000 ml，pH值7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min。

YPD培養(yǎng)基：1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖。A液：溶解10 g酵母膏，20 g蛋白胨于900 ml水中，121℃滅菌20 min；B液：于100 ml水中溶解20 g葡萄糖，121℃滅菌20 min。在無(wú)菌環(huán)境下將A、B液混勻。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 ml。將馬鈴薯去皮切成小塊，于鍋中加水1 000 ml煮沸0.5 h，用雙層紗布過濾，取其濾液加糖及瓊脂完全溶解后加水補(bǔ)充至1 000 ml，pH值自然，121℃滅菌20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)

枯草芽孢桿菌：將100 μl菌種接到100 ml普通肉湯液體培養(yǎng)基，37℃恒溫?fù)u床（180 r/min）培養(yǎng)8 h。

酒酵母：將100 μl液體菌種接到Y(jié)PD培養(yǎng)基，30℃恒溫?fù)u床（180 r/min）培養(yǎng)8 h。

黑曲霉、木霉、毛霉：將斜面上保種的菌絲接種到PDA固體培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。

1.2.2 種子液的制備

枯草芽孢桿菌、酒酵母：取一定量擴(kuò)大后的液體菌種分別接到新的培養(yǎng)基，按上述條件分別培養(yǎng)，并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，使菌液濃度達(dá)到108cfu/ml。

黑曲霉、木霉、毛霉：將擴(kuò)大培養(yǎng)的霉菌用無(wú)菌水沖洗到已滅菌的50 ml離心管中，制備成孢子懸浮液，并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

1.2.3 固態(tài)發(fā)酵

分別取500 g的沙棘果渣、沙棘籽渣、沙棘葉，按照80%的料水比與水混勻后分別裝入聚丙烯袋中，121℃高壓滅菌25 min。待發(fā)酵原料降至室溫后，接種種子液，其中沙棘果渣接種黑曲霉、木霉、毛霉；沙棘葉接種黑曲霉、木霉、枯草芽孢桿菌、酒酵母；沙棘籽渣接種黑曲霉、木霉、毛霉、枯草芽孢桿菌、酒酵母，接種量為5%，接種后置于35℃發(fā)酵72 h。發(fā)酵結(jié)束后，樣品55℃烘干并粉碎。

1.3 測(cè)定方法

粗蛋白用定氮儀（瑞典特卡托，F(xiàn)OSS-2300）測(cè)定；氨基酸用全自動(dòng)氨基酸分析儀（日本日立，L-8900）測(cè)定；蛋白酶含量按中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB-T 28715—2012測(cè)定；

纖維素酶含量按中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)NY/T 912—2004測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果使用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，Duncan's多重比較檢驗(yàn)均值的差異顯著性,當(dāng)P＜0.05時(shí)，表示差異顯著，結(jié)果用“平均值(x)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)”表示，用 Excel 2003進(jìn)行圖表分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗蛋白含量的變化

經(jīng)不同菌種發(fā)酵后的沙棘果渣、沙棘籽渣、沙棘葉粗蛋白含量的變化見圖1。

從圖1可以看出，發(fā)酵前各原料的粗蛋白含量依次為：沙棘籽渣＞沙棘葉＞沙棘果渣；經(jīng)發(fā)酵后，沙棘果渣粗蛋白含量與對(duì)照組相比提高6.5%～13.31%，其中以黑曲霉和木霉提高較為顯著（P＜0.05），分別提高了13.31%和11.73%；沙棘籽渣經(jīng)發(fā)酵后與對(duì)照組相比提高0.69%～8.07%，其中經(jīng)黑曲霉、毛霉、酒酵母發(fā)酵后含量增加顯著（P＜0.05），分別增加了5.94%、8.07%、6.11%；沙棘葉經(jīng)發(fā)酵后粗蛋白含量有上升趨勢(shì)，與對(duì)照組相比提高了5.94%～22.56%，其中經(jīng)黑曲霉、木霉發(fā)酵后分別提高了22.56%，12.98%，差異顯著（P＜0.05）；經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵后的沙棘籽渣和沙棘葉粗蛋白含量都有提高趨勢(shì)，但不明顯。

2.2 不同菌種發(fā)酵對(duì)蛋白酶含量變化的影響(見圖2)

圖1 不同菌種發(fā)酵沙棘果渣、沙棘籽渣、沙棘葉粗蛋白質(zhì)含量變化

圖2 不同菌種發(fā)酵沙棘果渣、沙棘籽渣、沙棘葉蛋白酶含量變化

由圖2可知，經(jīng)不同菌種發(fā)酵后各發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白酶含量與對(duì)照組相比都有不同程度的提高：沙棘果渣提高了68.63%～741.17%；沙棘籽渣提高了16.28%～769.76%；沙棘葉提高了7.55%～35.22%，其中經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后的沙棘果渣和沙棘籽渣蛋白酶含量有明顯的上升，分別較對(duì)照提高了741.17%和769.76%，差異顯著（P＜0.05），沙棘葉提高了35.22%，差異顯著（P＜0.05）；經(jīng)木霉、毛霉發(fā)酵后的沙棘籽渣分別提高了90.70%、93.02%，差異顯著（P＜0.05）；而經(jīng)枯草芽孢桿菌和酒酵母發(fā)酵后的沙棘籽渣和沙棘葉蛋白酶含量有提高趨勢(shì)但不明顯。

2.3 不同菌種發(fā)酵對(duì)纖維素酶含量變化的影響

圖3 不同菌種發(fā)酵沙棘果渣、沙棘籽渣、沙棘葉纖維素酶含量變化

從圖3可以看出，經(jīng)不同菌種發(fā)酵后，不同的發(fā)酵樣品纖維素酶含量變化不一樣。沙棘葉在發(fā)酵后纖維素酶含量與對(duì)照比提高了219.69%～552.33%，差異顯著（P＜0.05），其中經(jīng)木霉發(fā)酵后提高最明顯；沙棘果渣經(jīng)發(fā)酵后纖維素酶含量提高了1.04%～3.04%，經(jīng)木霉發(fā)酵后與對(duì)照組相比提高3.04%，差異顯著（P＜0.05）；而沙棘籽渣在發(fā)酵后纖維素酶含量與對(duì)照組相比有所降低。

2.4 不同菌種發(fā)酵對(duì)氨基酸含量變化的影響(見表1)

從表1我們可以看出，沙棘果渣經(jīng)黑曲霉、木霉發(fā)酵后，氨基酸變化不是特別明顯，其中經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后沙棘果渣纈氨酸、蛋氨酸較對(duì)照提高明顯，分別提高16%、30%；經(jīng)木霉發(fā)酵后的纈氨酸、蛋氨酸較對(duì)照分別提高15%、37%，增加比較明顯；而酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸經(jīng)黑曲霉、木霉發(fā)酵后含量有所降低；經(jīng)毛霉發(fā)酵后的沙棘果渣氨基酸總量較對(duì)照有所提高，其中脯氨酸、丙氨酸、胱氨酸、蛋氨酸較對(duì)照有明顯提高，分別提高19%、16%、30%、134%。

由表2可知，經(jīng)毛霉發(fā)酵后的沙棘籽渣氨基酸總量較對(duì)照提高了34.25%，其中天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸較對(duì)照提高明顯，都在40%以上；而經(jīng)黑曲霉、木霉發(fā)酵后氨基酸總量較對(duì)照有所下降；枯草芽孢桿菌、酒酵母發(fā)酵后的沙棘籽渣氨基酸總量變化不明顯，枯草芽孢桿菌發(fā)酵后苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、丙氨酸有不同程度的提高；酒酵母發(fā)酵后異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、天冬氨酸含量有不同程度的提高。

表1 不同菌種發(fā)酵沙棘果渣氨基酸含量的變化（%）

表2 不同菌種發(fā)酵沙棘籽渣氨基酸含量的變化（%）

表3 不同菌種發(fā)酵沙棘葉氨基酸含量的變化（%）

由表3數(shù)據(jù)分析可知，經(jīng)不同菌種發(fā)酵沙棘葉后，氨基酸總量都有不同程度的提高；木霉、黑曲霉發(fā)酵后氨基酸總量較對(duì)照組提高明顯，其中蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、組氨酸較對(duì)照組提高明顯，都在20%以上；沙棘葉經(jīng)枯草芽孢桿菌、酒酵母發(fā)酵后蛋氨酸含量較對(duì)照組提高明顯，其中酒酵母發(fā)酵后蘇氨酸、谷氨酸、甘氨酸、纈氨酸等提高在10%以上。

3 討論

沙棘果渣、沙棘籽渣、沙棘葉發(fā)酵前粗蛋白含量依次為：沙棘籽渣＞沙棘葉＞沙棘果渣，此結(jié)果與馬養(yǎng)民等[8]、王翔飛[9]、阮成江[2]試驗(yàn)結(jié)果相一致。經(jīng)發(fā)酵后，各樣品粗蛋白含量都有提高，這可能與發(fā)酵用微生物本身含有的菌體蛋白有關(guān)；其中經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后提高差異顯著，筆者認(rèn)為，這可能是由于黑曲霉可以將樣品中的非蛋白氮轉(zhuǎn)化成蛋白氮，從而提高了粗蛋白含量。嚴(yán)鶴松等[10]在利用黑曲霉發(fā)酵豆粕時(shí)，粗蛋白含量較發(fā)酵前提高了38.23%。劉忠元[11]研究黑曲霉發(fā)酵玉米秸稈的優(yōu)化條件，產(chǎn)物分析表明，發(fā)酵3 d和6 d后粗蛋白含量與對(duì)照樣品中粗蛋白含量提高差異顯著。這些結(jié)果雖然在粗蛋白提高量上與本試驗(yàn)不同，但都存在提高的趨勢(shì)，這一點(diǎn)與本試驗(yàn)的結(jié)果基本一致。

黑曲霉是食品工業(yè)上重要的發(fā)酵用菌，可產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、果膠酶等。在本試驗(yàn)中，經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后的樣品蛋白酶含量都有顯著提高，特別是沙棘果渣和沙棘籽渣；蛋白酶能將沙棘中的大分子蛋白質(zhì)分解成低分子的小肽，改善沙棘的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，提高在飼料工業(yè)中的利用率和轉(zhuǎn)化率。王文娟等[12]在黑曲霉發(fā)酵豆粕產(chǎn)蛋白酶活性的研究中發(fā)現(xiàn)經(jīng)發(fā)酵后的蛋白酶較對(duì)照有所提高。吳寶昌等[13]報(bào)道，經(jīng)發(fā)酵后的豆粕蛋白酶含量有不同程度的提高。肖雷等[14]在研究影響黑曲霉產(chǎn)糖化酶和蛋白酶的主要營(yíng)養(yǎng)因素時(shí)，指出以不同培養(yǎng)基發(fā)酵后的樣品蛋白酶含量有不同程度的提高。這些結(jié)果都與本試驗(yàn)的結(jié)果相一致。

沙棘果渣、沙棘籽渣、沙棘葉經(jīng)發(fā)酵后蘇氨酸、谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸有明顯的提高，其中蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸是必需氨基酸，對(duì)促進(jìn)生長(zhǎng)，進(jìn)行正常代謝、維持生命提供物質(zhì)基礎(chǔ)；谷氨酸是生物機(jī)體內(nèi)氮代謝的基本氨基酸之一，在代謝上具有重要意義，同時(shí)是人和動(dòng)物的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。因此沙棘經(jīng)發(fā)酵后可以改善其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，提高利用價(jià)值。

4 結(jié)論

①發(fā)酵后的沙棘果渣、沙棘籽渣和沙棘葉粗蛋白、蛋白酶、纖維素酶含量都有不同程度的增加；氨基酸總量有變化，其中以木霉發(fā)酵后增加量最大；

②沙棘籽渣發(fā)酵后粗蛋白含量最高，其次是沙棘葉，可作為高蛋白飼料原料或添加劑使用；

③沙棘果渣經(jīng)微生物發(fā)酵后，可作為飼料原料開發(fā)利用。