中華根霉12#產(chǎn)復(fù)合酶浸提條件及體外酶解飼料的研究

■ 鄧永平 艾瑞波 郭建華 劉曉蘭 鄭喜群 宮 曉 殷 景

(1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省普通高校齊齊哈爾農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾 161006)

飼用復(fù)合酶是一類新型的活性飼料添加劑，在畜禽日糧中添加一定比例的復(fù)合酶能明顯提高飼料的消化率和轉(zhuǎn)化率，降低料肉比，縮短生長周期；同時還有防病和減少環(huán)境污染的作用，無任何毒、副作用，被譽(yù)為真正的綠色飼料添加劑[1-2]。同時，開發(fā)酶制劑、微生物制劑等新型飼料添加劑也是我國飼料工業(yè)“十三五”期間的主要任務(wù)之一。

微生物發(fā)酵是制備飼用酶的主要途徑，已有報道在 Mucor indicusMTCC 6333、Aspergillus japonicus、Trichoderma reesei、Aspergillus nigerAS3.3928、Aspergillus aculeatus、Rhizopus chinesis的代謝產(chǎn)物中存在不同酶組成的復(fù)合酶[3-8]。為了充分發(fā)揮微生物的產(chǎn)酶優(yōu)勢，以及加強(qiáng)對各種糟渣的利用，學(xué)者們近些年還開展了混菌發(fā)酵生產(chǎn)飼用復(fù)合酶的工作[9-10]。

現(xiàn)有的報道主要集中于飼用復(fù)合酶發(fā)酵條件及應(yīng)用的研究，鮮見對酶的提取的研究，而酶活力的高低不僅與發(fā)酵條件有關(guān)，在提取過程中酶的活力也會有不同程度的損失，因此，探索復(fù)合酶適宜的提取條件是非常必要的。根霉是發(fā)酵工業(yè)中常用的生產(chǎn)菌種，能分泌多種酶系。本文所采用的菌株中華根霉12#來源于南方小酒藥，此菌安全性較高，且經(jīng)過發(fā)酵能產(chǎn)生多種酶系，是一種較理想的生產(chǎn)飼用復(fù)合酶的菌株。本文研究了中華根霉12#產(chǎn)飼用復(fù)合酶的浸提條件和體外對飼料的降解情況，以期為開發(fā)該復(fù)合酶為“綠色飼料添加劑”奠定基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料和儀器

1.1 菌種

中華根酶12#（Rhizopus Chinesis12#）。

1.2 試劑及材料

木聚糖、果膠、D-半乳糖醛酸均購自Sigma公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑；CF15RXII高速冷凍離心機(jī)（Hitachi）、高速萬能粉碎機(jī)FW80（天津市泰斯特儀器有限公司）、分光光度計(jì)TU-1810（北京普析通用儀器有限公司）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法

①斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。將菌種接入PDA培養(yǎng)基后于28～30℃培養(yǎng)4～5 d，轉(zhuǎn)入4℃條件下保存，備用。

②固體發(fā)酵培養(yǎng)基：250 ml三角瓶中裝6 g麩皮和4 g豆渣，培養(yǎng)基料水比為1∶2，pH值自然，接種量為103個孢子/g干基，28～30 ℃條件下培養(yǎng)96 h[8]。

2.2 酶活力的測定

①淀粉酶的活力測定：采用DNS法。底物為1%淀粉溶液。酶活力定義：在40℃、pH值6.0的條件下，1 min水解淀粉生成1 μg葡萄糖所需要的酶量，規(guī)定為一個酶活力單位，以U/g表示。

②果膠酶活力測定：采用DNS法。底物為0.4%果膠溶液。酶活力定義：在45℃、pH值6.0的條件下，1 min分解果膠生成1 μg半乳糖醛酸所需的酶量定義為一個酶活力單位，以U/g表示。

③纖維素酶活力測定：采用DNS法。底物為1%羧甲基纖維素鈉溶液。酶活力定義：在45℃、pH值6.0的條件下，1 min分解羧甲基纖維素鈉生成1 μg同葡萄糖的還原糖所需的酶量定義為一個酶活力單位，以U/g表示。

④ 木聚糖酶活力測定：采用DNS法。底物為0.4%木聚糖溶液。酶活力定義：在45℃、pH值6.0的條件下，1 min分解木聚糖生成1 μg還原糖所需的酶量定義為一個酶活力單位，以U/g表示。

⑤蛋白酶活力測定：底物為1%酪蛋白溶液（pH值6.0）。酶活力定義：在40℃ pH值6.0條件下，1 h水解酪蛋白產(chǎn)生相當(dāng)于1 μg酪氨酸所需的酶量，規(guī)定為1個酶活力單位，以U/g表示。

2.3 浸提溶劑的確定

分別將100 ml的2%CaCl2溶液、自來水、生理鹽水加入固體發(fā)酵產(chǎn)物中，在30℃、120 r/min條件下振蕩浸提酶4 h，10 000 r/min離心10 min，測上清液中酶活力。

2.4 浸提溫度的確定

向培養(yǎng)物中加入100 ml浸提溶劑，分別在25、30、40、50 ℃條件下150 r/min振蕩浸提酶4 h，10 000 r/min離心10 min，取上清液，測定不同浸提溫度下的酶活力。

2.5 浸提時間的確定

向發(fā)酵后的培養(yǎng)物中加入100 ml浸提溶劑，在30 ℃搖床中150 r/min振蕩浸提酶，在1、2、3、4、5、6 h時，10 000 r/min離心10 min，測上清液中酶活力。

2.6 搖床轉(zhuǎn)速的確定

采用上述試驗(yàn)確定的條件分別在90、120、150、180、210 r/min條件下提取酶，10 000 r/min離心10 min，測上清液中酶活力。

2.7 粗酶液對豆粕的降解

稱取10 g豆粕粉(過80目篩)，加入到250 ml三角瓶中，分別加入料酶體積比為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的復(fù)合酶液，并用生理鹽水補(bǔ)至100 ml，反應(yīng)體系最終pH值為6.0，對照組加100 ml生理鹽水；在40℃恒溫水浴鍋中酶解2、4、6、8、10 h，每2 h取樣測還原糖含量。

2.8 粗酶液對玉米粉的降解

稱取10 g玉米粉（過80目篩）于250 ml三角瓶中，分別加入料酶體積比為1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5的復(fù)合酶液，并用生理鹽水補(bǔ)至100 ml，反應(yīng)體系最終pH值為6.0，對照組加100 ml生理鹽水；在40℃恒溫水浴鍋中振蕩（150 r/min）酶解2、4、6、8、10 h，每2 h取樣測還原糖含量。

2.9 還原糖測定

采用DNS法測定復(fù)合酶液降解植物性飼料生成的還原糖量。吸取1 ml樣液，置于25 ml比色管中，再加入DNS試劑1.5 ml，沸水顯色5 min，然后用流水迅速冷卻，用蒸餾水定容至20 ml，用振蕩器搖勻。以蒸餾水空白調(diào)零，在540 nm處比色，參照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線求出還原糖的含量。

還原糖得率(%)=還原糖含量(mg)×稀釋倍數(shù)×100/樣品干重(g)。

3 結(jié)果與討論

3.1 浸提條件對酶活力的影響

3.1.1 浸提溶劑的確定

向發(fā)酵產(chǎn)物中分別加入100 ml自來水、生理鹽水、2%氯化鈣溶液浸提酶，對浸提產(chǎn)物冷凍離心，取上清液測定酶活力，確定不同溶劑的浸提效果，試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 浸提溶劑對酶活力的影響

由圖1可知，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)自來水浸提所得的五種酶活力都較低，氯化鈣居中，生理鹽水浸提后的酶活力較高。同時，考慮到復(fù)合酶浸提時保護(hù)酶的活力及成本，所以選擇生理鹽水作為下一步的浸提溶劑。

3.1.2 浸提溫度的確定

溫度對酶活力有顯著影響，溫度升高分子運(yùn)動速度加快，有利于縮短酶的浸提時間，但是溫度過高，易導(dǎo)致不耐熱酶的活力降低，甚至失活，直接影響酶的進(jìn)一步研究與應(yīng)用。試驗(yàn)采用上一步確定的生理鹽水為浸提溶劑，振蕩浸提4 h，浸提溫度分別為25、30、40、50 ℃，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

由圖2可知，浸提溫度40℃時，除蛋白酶外，其它各種酶活力都相對較高，分別是木聚糖酶活力124 U/g、果膠酶活力46 U/g、纖維素酶活力64 U/g、淀粉酶活力875 U/g，綜合考慮，浸提溫度選擇40℃。

圖2 不同浸提溫度對酶活力的影響

3.1.3 浸提時間的確定

發(fā)酵液的浸提時間如過長，不僅易染菌，導(dǎo)致酶活力的降低，而且使生產(chǎn)周期延長；浸提時間過短，目標(biāo)酶浸提不完全，不能達(dá)到最好的浸提效果。用生理鹽水對中華根霉12#固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行浸提，在其他條件不變的情況下，對浸提時間對粗酶液酶活力的影響進(jìn)行研究。試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同浸提時間對酶活力的影響

從圖3可見，浸提時間4 h時，除果膠酶外，其它各種酶活力都相對較高，分別為木聚糖酶活98 U/g、纖維素酶活71 U/g、淀粉酶活854 U/g、蛋白酶活653 U/g，綜合考慮，浸提時間選擇4 h。

3.1.4 搖床轉(zhuǎn)速的確定

通過往復(fù)式搖床振蕩浸提有利于酶與浸提溶劑的充分接觸，縮短浸提時間，但是需要控制合適的搖床轉(zhuǎn)速，既能將酶最大程度的浸提出來，又不能因?yàn)檗D(zhuǎn)速過快使局部熱量過高導(dǎo)致酶失活。試驗(yàn)選擇了90、120、150、180、210 r/min條件下提取酶，結(jié)果如圖4所示。

圖4 搖床轉(zhuǎn)速對酶活力的影響

由圖4可知，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定為150 r/min時，五種酶的活力均較高，因此，選擇搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min。

3.2 粗酶液對飼料原料中還原糖的降解

體外酶解試驗(yàn)中還原糖含量是可以直觀反映酶制劑分解某種底物能力大小的一個重要指標(biāo)[11]。以產(chǎn)生的同葡萄糖的還原糖為指標(biāo)，研究中華根霉12#固體發(fā)酵生產(chǎn)的復(fù)合酶對豆粕粉和玉米粉兩種飼料原料的降解情況。經(jīng)測定，本次試驗(yàn)復(fù)合酶中各種酶活力分別是：木聚糖酶活力113 U/g、果膠酶活力48 U/g、纖維素酶活力79 U/g、淀粉酶活力812 U/g、蛋白酶活力589 U/g。

復(fù)合酶對豆粕粉的降解情況見圖5。

圖5 不同酶解條件對豆粕中還原糖量的影響

從圖5可以看出，不同酶用量條件下的酶解得到的還原糖產(chǎn)量均明顯高于對照組。隨著酶用量的逐漸增加，還原糖產(chǎn)量逐漸增加，但是隨著酶用量的進(jìn)一步提高，還原糖的產(chǎn)量反而下降，料酶比為1∶4反應(yīng)時間為4 h時還原糖產(chǎn)量達(dá)到最高。

鑒于酶解豆粕試驗(yàn)中高濃度的復(fù)合酶并沒有增加還原糖的得率，所以，該試驗(yàn)提高了料酶比，復(fù)合酶對玉米粉的降解情況見圖6。

圖6 不同酶解條件對玉米粉中還原糖量的影響

從圖6中可以看出，不同酶用量條件下的還原糖得率差異不大，但是均高于對照。綜合考慮到飼料加工、產(chǎn)物濃縮以及能耗等諸多因素(有關(guān)飼用復(fù)合酶酶解條件的研究仍在進(jìn)行中，隨后會有相關(guān)后續(xù)報導(dǎo))，故確定料酶比為1∶1，降解時間為6 h。

與文獻(xiàn)報道相比，本文中復(fù)合酶酶解豆粕粉和玉米粉的還原糖得率高峰期都提前了[12]。這提示不同來源的復(fù)合酶在降解植物性飼料時，有諸多影響因素，如酶的用量、作用時間、飼料底物種類、作用pH值和溫度等都會影響到最終的飼料的消化利用情況，需要具體分析，從而達(dá)到充分發(fā)揮飼用酶制劑的作用，提高飼料利用率，降低養(yǎng)殖成本的目的。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)以中華根霉12#為生產(chǎn)菌種，利用固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)飼用復(fù)合酶，對酶的浸提條件和體外對植物性飼料原料的降解情況進(jìn)行了探討。試驗(yàn)結(jié)果表明:提取溶劑為生理鹽水，浸提時間為4 h，浸提溫度為40℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min。在40℃條件下，豆粕粉與復(fù)合酶液比例為1∶4酶解4 h時生成還原糖量最高；玉米粉與復(fù)合酶液比例為1∶1酶解6 h時生成還原糖量最高。