牧草縮合單寧對(duì)大腸桿菌細(xì)胞壁脂肪酸的影響

■劉秀麗 金 龍 李 鋒 裴 樂

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；2.加拿大農(nóng)業(yè)與農(nóng)業(yè)食品部列橋研究中心，加拿大列橋T1J 4B1；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

植物單寧(Tannins)是一類普遍存在的多酚類化合物，根據(jù)來源不同具有不同的抗生活性。如紫色達(dá)利菊牧草縮合單寧含量很高[1]，長(zhǎng)期飼喂可以減少反芻動(dòng)物糞中大腸桿菌O157：H7的排出，降低環(huán)境污染。研究也顯示，從9種牧草中分離的縮合單寧，僅僅是紫色達(dá)利菊單寧表現(xiàn)出了較強(qiáng)抗E.coliO157：H7活性的作用[2-3]。

據(jù)報(bào)道，兒茶酚素-綠茶中單寧單體的抗大腸桿菌活性是由于對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜脂質(zhì)層的破壞和外膜通透性的增加而起作用；從葉白千層（茶樹）中分離的精油、百里香酚等酚提取物都是通過改變細(xì)菌細(xì)胞外膜和脂質(zhì)層構(gòu)成而對(duì)革蘭氏陰性菌產(chǎn)生抑制作用。在香精油中酚類化合物的抗微生物活性似乎是與羥基的存在和微生物酶的失活有關(guān)，但最可能是和細(xì)胞膜相關(guān)的這些基團(tuán)引起了細(xì)胞成分如脂肪酸和磷脂的改變[4]，從而減弱細(xì)胞的能量代謝和影響遺傳物質(zhì)的合成。本試驗(yàn)?zāi)康木褪橇私鈫螌幾饔糜诩?xì)菌細(xì)胞后，細(xì)胞壁脂肪酸組成的變化，為闡明紫色達(dá)利菊所含縮合單寧抑制大腸桿菌的作用機(jī)理提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

1株非致病性大腸桿菌ATCC25922，來自加拿大農(nóng)業(yè)部萊斯布里奇研究中心（Lethbridge research cen-tre culture collection.Canada）的微生物培養(yǎng)室。

1.1.2 紫色達(dá)利菊和紅豆草單寧

紫色達(dá)利菊單寧和紅豆草單寧系加拿大農(nóng)業(yè)部萊斯布里奇研究中心反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室提取，純度均大于98.0%。

1.1.3 所需主要儀器設(shè)備

氣相色譜儀（Hewlett Packard GC System 6890,Mississauga,ON,Canada）；OxiSelect? Hydrogen Peroxide Assay Kit(Colorimetric，STA-343，Cell biolabs，Inc)；凍干機(jī)（Goldfisch Apparatus，Laboratory construction Co.,Kansas City,Mo.USA)；紫外分光光度計(jì)（Metertech INC，SP-8001）；氮?dú)獯祾邇x（OA-SYS heating evaporator 24 needles,N-EVAPTM112.USA）；高速離心機(jī)(Sorvall RC 5B PLUS，SLA-1500)。

1.2 方法

1.2.1 氣相色譜儀儀器條件

離子火焰檢測(cè)器,SP-2560石英毛細(xì)管柱（75 m×0.18 mm×0.14 μm，Supelco Inc.,Oakville,ON,Canada）。通過20∶1（20∶1 split）進(jìn)樣1 μl的己烷提取液。開始溫度55℃維持5 min，之后按15℃/min增加到155℃，并維持56 min；再以10℃/min增加到240℃，最后再維持15 min。氫氣作為載體：排出壓力16.3 psi，流速為0.3 ml/min；氦氣作為尾吹氣，流速：10 ml/min。

1.2.2 樣品準(zhǔn)備

將加單寧（PPC，SF）和未加單寧培養(yǎng)的細(xì)菌，分別在37℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)，每個(gè)濃度（紫色達(dá)利菊單寧濃度分別為0、10、50 μg/ml；紅豆草單寧濃度分別為0、50、200 μg/ml）做了3個(gè)重復(fù)，濃度的選擇是根據(jù)單寧的最小抑菌量（Minimum Inhibitory Concentration，MIC），PPC 為20～40 μg/ml，SF 為 100～150 μg/ml。培養(yǎng)10 h后取出，離心（12 000 r/min，4 ℃）10 min，棄去上清液，用PBS重懸細(xì)菌，再同樣離心，重復(fù)3次洗滌。最后，傾去上清液，凍干成粉末備用。

1.2.3 樣品測(cè)定

參照Evans[5]的脂肪酸提取方法，準(zhǔn)確稱取大腸桿菌凍干粉約50 mg到25 ml試管（事先用甲醇洗3遍）中，每個(gè)樣品稱取一個(gè)。加入CH3Cl3∶HCH3OH=2∶1 4 ml，振搖，靜止過夜?；靹?，離心（12 000 r/min、4℃）10 min，移出上清液到另一干凈試管。沉淀再加4 ml液體(CH3Cl3∶HCH3OH∶H2O=2∶1∶0.8)，靜止2 h，離心（12 000 r/min、4 ℃）10 min。移出并合并兩次上清液，總體積為V。加入V/3.8 ml的氯仿和等體積的水。待分層后，取出下層即為脂層，40℃氮?dú)獯蹈?。氮?dú)獯蹈傻臉悠芳尤?00 μl Nonadecanoic acid(C19∶0)methyl ester作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。加入2 ml甲醇鈉（用甲醇溶解成濃度為0.5 mmol/l），搖勻，充N2，把樣品放到50℃水浴中10 min。等溫度降下來后加入 1 ml BF3(14%Boron triflouride)，充 N2，把樣品放到50℃水浴中10 min；溫度降下來之后加入5 ml水和5 ml己烷，混勻。靜止10 min，待分層，上層即為測(cè)試樣品，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，上氣相色譜儀分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

脂肪酸數(shù)據(jù)是通過Agilent工作站B.01.03離線處理系統(tǒng)獲得數(shù)據(jù)，經(jīng)脂肪酸分析軟件進(jìn)行計(jì)算，脂肪酸結(jié)果分析是通過SAS 9.0中ANOVA進(jìn)行。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

在培養(yǎng)大腸桿菌時(shí)加入不同濃度的單寧，經(jīng)10 h作用后，通過氣相色譜觀察從細(xì)菌細(xì)胞膜提取的脂肪酸的變化。從表1可以看到，ATCC25922細(xì)胞壁脂肪酸由63.49%（＞50%）的飽和脂肪酸（Saturated Fatty Acid，SFA)和36.51%的不飽和脂肪酸（Unsaturated Fatty Acid，USFA）構(gòu)成，其中棕櫚酸(C16∶0)、棕櫚油酸(C16∶1)、C16∶0-2OH 和 C18∶1 c11 是構(gòu)成 E.coil脂質(zhì)部分的主要脂肪酸。在加入紫色達(dá)利菊單寧后，與對(duì)照相比，飽和脂肪酸明顯升高，特別是棕櫚酸(C16∶0)顯著增加，棕櫚油酸(C16∶1)和異油酸(C18∶1)顯著降低；而隨著單寧濃度的增加，僅僅表現(xiàn)了肉豆蔻酸(C14∶0)的顯著降低和異油酸(C18∶1)的顯著升高；與低濃度相比，肉豆蔻酸(C14∶0)的顯著降低，棕櫚酸(C16∶0)顯著降低，棕櫚油酸(C16∶1)和異油酸(C18∶1)顯著升高；而加入紅豆草單寧后，與對(duì)照相比，肉豆蔻酸(C14∶0)和棕櫚酸(C16∶0)顯著降低，異油酸(C18∶1)顯著升高；而隨著單寧濃度的增加，表現(xiàn)了肉豆蔻酸(C14∶0)和棕櫚油酸(C16∶1)的顯著降低，C16∶0-2OH和C18∶1 c11的顯著升高；與低濃度相比，棕櫚油酸(C16∶1)和C18∶1 c11的顯著降低。

成對(duì)脂肪酸比例的變化將影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性。在加入單寧培養(yǎng)細(xì)菌前后，觀察單寧對(duì)成對(duì)脂肪酸的影響，發(fā)現(xiàn)低濃度（低于MIC）PPC單寧，使成對(duì)脂肪酸比例（飽和脂肪酸/不飽和脂肪酸）增加，而高濃度時(shí)沒有明顯變化，原因可能是縮合單寧對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的聚集作用和H2O2對(duì)細(xì)胞毒害作用的雙重結(jié)果。在低濃度時(shí)，紫色達(dá)利菊單寧對(duì)細(xì)胞的聚集、對(duì)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)體的聚集作用程度小，而H2O2發(fā)揮了毒害作用，將不飽和脂肪酸氧化成飽和脂肪酸，成對(duì)脂肪酸比例增加。而對(duì)于低濃度（低于MIC）的紅豆草單寧，H2O2的產(chǎn)生量小，所以未起到氧化作用；而在高濃度時(shí)，主要脂肪酸C16∶0有明顯的增加，紅豆草單寧的聚集作用要比紫色達(dá)利菊單寧弱，因此高濃度時(shí)仍然是H2O2對(duì)細(xì)胞毒害作用占主要地位。從圖1、圖2、圖3、圖4中看到，在加入10 μg/ml紫色達(dá)利菊單寧時(shí)，C16∶0/C16∶1、TT16∶0/TT16∶1、C18∶0/C18∶1、SFA/USFA均顯著升高（P＜0.01）；而加入50 μg/ml紫色達(dá)利菊單寧時(shí)，C16∶0/C16∶1、TT16∶0/TT16∶1、C18∶0/C18∶1、SFA/USFA與對(duì)照相比差異不顯著，與低濃度顯著降低（P＜0.05）。

表1 經(jīng)單寧處理的大腸桿菌細(xì)胞主要脂肪酸比例的變化

圖1 紫色達(dá)利菊單寧和紅豆草單寧對(duì)大腸桿菌細(xì)胞脂肪酸C16∶0/C16∶1比例的變化

圖2 紫色達(dá)利菊單寧和紅豆草單寧對(duì)大腸桿菌細(xì)胞脂肪酸TT16∶0/TT16∶1比例的變化

而在加入50 μg/ml紅豆草單寧時(shí)，C16∶0/C16∶1、TT16∶0/TT16∶1、C18∶0/C18∶1、SFA/USFA的變化與對(duì)照差異不顯著；而加入200 μg/ml紅豆草單寧時(shí)，C16∶0/C16∶1、TT16∶0/TT16∶1變化與對(duì)照相比顯著升高（P＜0.05），C18∶0/C18∶1、SFA/USFA差異不顯著；C16∶0/C16∶1、TT16∶0/TT16∶1、SFA/USFA比低濃度顯著升高（P＜0.05），C18∶0/C18∶1差異不顯著。

圖3 紫色達(dá)利菊單寧和紅豆草單寧對(duì)大腸桿菌細(xì)胞脂肪酸C18∶0/C18∶1比例的變化

圖4 紫色達(dá)利菊單寧和紅豆草單寧對(duì)大腸桿菌細(xì)胞脂肪酸SFA/USFA比例的變化

3 討論

對(duì)于新型抗生物質(zhì)來說，脂質(zhì)合成途徑似乎是一個(gè)重要的過程[6-8]。由于單寧對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜似乎成了作用的主要位置，并影響脂肪酸的構(gòu)成和結(jié)構(gòu)的改變。在對(duì)百里香酚、檸檬烯、香芹酚等多酚化合物進(jìn)行研究時(shí)，低于MIC的量會(huì)使不飽和脂肪酸含量增加[9]，從而增加膜的流動(dòng)性[10]；另一研究表明，用這些化合物處理細(xì)胞2 h后，不飽和脂肪酸減少，而飽和脂肪酸增加[11]。而本試驗(yàn)的結(jié)果是，在加入低于MIC的紫色達(dá)利菊單寧時(shí)，飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比例增加，而對(duì)于紅豆草單寧沒有影響；在高于MIC時(shí)，紅豆草單寧僅表現(xiàn)主要成對(duì)脂肪酸的比例增加?？傊?，說明了多酚類化合物作用于細(xì)菌細(xì)胞膜的機(jī)制可能是干擾膜脂質(zhì)層，并引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的變化。

細(xì)胞通過多組分膜脫氫酶來產(chǎn)生飽和脂肪酸[12-13]。許多研究也表明，酚類和萜烯類化合物都作用于細(xì)胞外膜，增加其通透性[14-16]，可能由于膜物質(zhì)的流失，脫氫酶分散出來對(duì)膜上脂肪酸產(chǎn)生影響。在膜脂質(zhì)層中飽和脂肪酸含量高會(huì)導(dǎo)致膜流動(dòng)性降低，硬度增加[10]，而不飽和脂肪酸太少，隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)和磷脂的合成，不久細(xì)胞就會(huì)代謝失衡、調(diào)亡[17]。如苯、苯胺等可溶于水的親脂物質(zhì)在低濃度時(shí)都能引起飽和脂肪酸和總磷脂濃度的增加，原因可能是需要一個(gè)較高密度的膜，通過飽和脂肪酸體現(xiàn)出來。

4 結(jié)論

單寧能夠引起細(xì)菌細(xì)胞壁脂肪酸結(jié)構(gòu)的變化，我們認(rèn)為這可能是其抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的一個(gè)原因，也為闡明單寧的抑菌機(jī)理提供一個(gè)理論支持。隨著多酚化學(xué)及結(jié)構(gòu)的不斷研究發(fā)展,對(duì)多酚的利用是必然趨勢(shì)。植物多酚作為一類可再生的綠色資源，必將成為人類充分利用的重要資源之一。