棕櫚酸包被γ-氨基丁酸對延邊黃牛瘤胃微生物體內(nèi)發(fā)酵特性的影響

■同仲彬 徐曉菲 J.S.Shin B.H.Moon 嚴(yán)昌國 李香子

(1.延邊大學(xué)動物科學(xué)系，吉林延吉 133002；2.江原國立大學(xué)動物生命科學(xué)學(xué)院，韓國江源道春川，200-701；3.韓國Celltech生物飼料有限公司，韓國）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA），又名氨酪酸，是哺乳動物的一種中樞抑制性遞質(zhì)。GABA不僅在生物體內(nèi)是一種重要的神經(jīng)抑制因子，而且也參與多種生理活動，因此隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及研究方法的不斷深入，GABA已作為一種新型功能性添加劑逐漸被應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)、食品行業(yè)及畜牧行業(yè)等各個領(lǐng)域。GABA具有調(diào)節(jié)動物食欲、調(diào)節(jié)激素分泌、增強動物免疫能力以及提高動物的抗氧化能力和抗熱應(yīng)激的能力。研究表明，氨基酸進入到瘤胃中會在瘤胃微生物的作用下部分或者完全降解，飼喂過瘤胃氨基酸是調(diào)控反芻動物小腸氨基酸數(shù)量與組成的有效途徑，所以將氨基酸以某種方式有效地修飾或保護起來，這樣能夠減少瘤胃微生物降解氨基酸生成氮又利用氮合成微生物蛋白的這一過程中氮和能量的損失以及發(fā)揮氨基酸的重要功能。某些長鏈脂肪酸在瘤胃中時，不但不影響瘤胃的發(fā)酵且降解率比較低，而且在真胃中容易被消化，所以在棕櫚酸包被GABA能夠進入真胃和小腸進而在胃酸和脂肪酶的作用下放出氨基酸，GABA因此可以被反芻動物所吸收。J.B.Cheng等研究過瘤胃γ-氨基丁酸對熱應(yīng)激奶牛生長性能和養(yǎng)分消化率的影響，結(jié)果表明，添加過瘤胃GABA可以通過降低直腸溫度，增加采食量來緩解熱應(yīng)激，并且可以增加產(chǎn)奶量，提高乳成分。對熱應(yīng)激奶牛GABA的最適添加量為40 mg/kg（干物質(zhì)）。D.M.Wang等研究過瘤胃γ-氨基丁酸對羊羔采食量、生長性能和有關(guān)基因表達(dá)的影響，結(jié)果表明，添加過瘤胃GABA可以提高羔羊的干物質(zhì)采食量，但是不影響其平均日增重，高添加量的GABA（140 mg/d）可以提高十二指腸黏膜GABA-β受體mRNA基因的表達(dá)量，抑制CCK-2受體mRNA基因的表達(dá)量進而引起羔羊采食量的增加。棕櫚酸包被GABA雖然可以增加GABA的過瘤胃率，但是對延邊黃牛瘤胃微生物是否存在負(fù)面影響、在小腸中的釋放率如何，有沒有發(fā)生過度保護？這些研究報道的還較少，所以本文研究棕櫚酸（C16∶0）包被GABA對瘤胃微生物體內(nèi)發(fā)酵特性的影響，為GABA這一物質(zhì)應(yīng)用于延邊黃牛提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

棕櫚酸包被GABA：韓國Celltech生物技術(shù)公司與延邊大學(xué)聯(lián)合研制并提供，其中包被材料百分比含量為75%。

尼龍袋：孔徑40 μm，大小為3 cm×8 cm的尼龍袋若干。

1.2 試驗動物及飼養(yǎng)管理

選擇4頭體況接近并且安裝瘤胃瘺管的延邊黃牛，身體狀況良好，體重接近[（350±15）kg]，平均年齡為18個月。將試驗動物拴系飼養(yǎng)，固定槽位，每日7:00和16:00飼喂2次，精粗料比為3∶7，自由飲水。飼料參考中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)——肉牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T815-2004）配制，干物質(zhì)基礎(chǔ)的日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 試驗設(shè)計及培養(yǎng)方法

體內(nèi)消化率試驗：采取單因素試驗設(shè)計，選取尼龍袋若干并在其中放入5 g棕櫚酸包被GABA，封口后再稱重。將6個尼龍袋用一根長繩固定到一起為一組，選擇3頭牛，于采食前投入每頭牛瘤胃中一組，分別于食后2、4、6、8、12、24 h剪下每組中的3個尼龍袋，記錄編號。將采集的尼龍袋立即放入清水沖洗直至水清為止，烘干稱重。注意不能搓，任其清水自由沖洗，以免增大消化率。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

小腸消化率試驗采用體外法進行。取在瘤胃液中降解16 h后的棕櫚酸包被GABA，先用pH值為2的胃蛋白酶溶液將其處理1 h，在利用pH值為7.8的小腸混合液處理，于2、4、8、16、24 h之后分別取出，采用貝特洛法測定剩余GABA含量，以此來推算出GABA的消化率。

采用4×4拉丁方設(shè)計：設(shè)0（對照組）、2.3、4.6、6.9 g/kg(DM，干物質(zhì)采食基礎(chǔ))這4個添加水平組；試驗分為4期，每期15 d，其中預(yù)試期10 d，正試期5 d，試驗期間隔為10 d。每日飼喂之前由瘤胃瘺管直接向瘤胃內(nèi)投放包被GABA。分別于0（采食前）、1、3、6 h（采食后）采集瘤胃液，經(jīng)4層、12層紗布過濾，-20℃冷凍保存待測。

1.4 指標(biāo)測定及方法

1.4.1 GABA體內(nèi)消化率和小腸消化率測定

利用靛酚比色法對棕櫚酸包被的GABA進行消化率的測定。

1.4.2 瘤胃液pH值、氨態(tài)氮（NH3-N）濃度和微生物蛋白(MCP)濃度的測定

使用賽多利斯酸度計（PB-10）分別即時測定不同時間點（1、3、6、12 h）所采集瘤胃液的pH值；利用靛酚比色法測定0、1、3 h和6 h時瘤胃液中NH3-N的含量；參照王寧娟等的方法，對瘤胃液中的MCP濃度進行測定。

1.4.3 培養(yǎng)液揮發(fā)性脂肪酸（VFA）濃度的測定

取0.8 ml培養(yǎng)液置于1.5 ml離心管中，并加入25%偏磷酸（H3PO4）0.2 ml，漩渦振蕩混勻，離心15 min（12 000 g、4 ℃），取上清液進樣。

參照Li等方法，選用Agilent Technologies GC-7890A氣相色譜儀離子火焰檢測器（FID），色譜柱型號為Agilent 19091F-112（25 m×320 μm×0.5 μm），采用外標(biāo)法定量測定。色譜條件為：柱溫120℃；前進樣口與檢測器溫度分別設(shè)為170℃與200℃；氮氣（載氣）流速為26.43 ml/min；進樣量1 μl。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007初步整理，SPSS 17.0統(tǒng)計分析，先用one-way ANOVA模型進行方差同質(zhì)性檢驗，再運用常規(guī)線性模型（General Linear Model-Univariate），進行方差單變量分析，最后以Duncan's進行多重比較，顯著水平采用P＞0.05，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 棕櫚酸包被GABA在延邊黃牛瘤胃中和小腸中的消化率

圖1 棕櫚酸包被GABA的消化率

由圖1可知，2 h時，包被GABA消化率為4.62%，隨著時間的延長，棕櫚酸包被GABA的消化率隨著時間的增加而逐漸增大，24 h后，棕櫚酸包被GABA的消化率達(dá)到20.97%。利用體外法進行包被GABA在小腸中的消化率測定，結(jié)果顯示棕櫚酸包被GABA在小腸中16 h時的消化率為92.13%。

2.2 棕櫚酸包被GABA對延邊黃牛瘤胃微生物體內(nèi)發(fā)酵特性的影響（見表2）

由表2可見，隨著時間的增加，瘤胃液pH值呈現(xiàn)0（采食前）～3 h下降，3～6 h上升趨勢，3 h時，4.6 g/kg組與6.9 g/kg組顯著低于對照組與2.3 g/kg組（P＜0.05）。

由表2可見，隨著采食后時間的增加，瘤胃液NH3-N呈現(xiàn)0（采食前）～1 h上升，1～3 h下降，3～6 h對照組與2.3 g/kg組上升，4.6 g/kg組與6.9 g/kg組下降的趨勢，3 h時，4.6 g/kg組與6.9 g/kg組顯著高于對照組與2.3 g/kg組（P＜0.05），6 h時，所有試驗組均顯著低于對照組（P＜0.05）。

由表2可見，隨著采食后時間的增加，瘤胃液總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）、乙酸、丙酸、丁酸濃度均呈現(xiàn)0（采食前）～3 h上升，3～6 h下降的趨勢。1 h時，丁酸濃度4.6 g/kg組顯著高于對照組（P＜0.05）；3 h時，TVFA、乙酸、丙酸、丁酸濃度均隨著添加水平的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在4.6 g/kg組出現(xiàn)高峰，其中TVFA與丁酸濃度4.6 g/kg組顯著高于對照組與2.3 g/kg組（P＜0.05），乙酸濃度4.6與6.9 g/kg組顯著高于對照（P＜0.05），丙酸濃度2.3與4.6 g/kg組顯著高于對照（P＜0.05），乙酸/丙酸2.3 g/kg組顯著低于對照組（P＜0.05）；6 h時，丙酸濃度2.3 g/kg組顯著低于對照組與4.6 g/kg組（P＜0.05），丁酸濃度4.6 g/kg組顯著高于對照組與2.3 g/kg組（P＜0.05），乙酸/丙酸2.3與6.9 g/kg顯著高于對照組（P＜0.05）。

2.3 棕櫚酸包被GABA對瘤胃液MCP的影響(見表3)

表3 棕櫚酸包被GABA對瘤胃液MCP的影響(mg/ml)

由表3可見，隨著采食后時間的增加，瘤胃液MCP濃度呈現(xiàn)與NH3-N相反的變化趨勢，即0（采食前）～1 h下降，1～6 h持續(xù)上升的趨勢，但各組間差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

韓占強等的研究表明，分別制備含棕櫚油脂粉為30%、40%、50%和60%的保護性蛋氨酸，24 h時瘤胃降解率分別為39.18%、34.88%、26.04%、23.63%，24 h后瘤胃釋放率分別為83.27%、73.05%、67.92%、56.80%。Berthiaume等運用尼龍袋法研究了過瘤胃蛋氨酸在瘤胃中的消失率為1、2、4、8、10、12 h和16 h的消失率分別為3.62%、9.22%、18.70%、31.90%、32.26%、36.74%和46.12%。Doreau等報道了17種飼糧中12～22碳原子偶數(shù)鏈脂肪酸在小腸內(nèi)的消化率,試驗結(jié)果表明，棕櫚油(十六碳)和硬脂酸(十八碳)的平均消化率分別為77.1%和76.3%。王迪銘等研究表明，當(dāng)使用固體棕櫚油脂進行包被且GABA含量為50%，使用壓力為11 kPa時所制得的包被GABA其在24 h時，GABA的降解率為18.2%，總下滑率為75.8%；本試驗中，使用棕櫚酸包被GABA，其在24 h時，GABA的消失率為20.97%，運用體外法測得其在小腸中的吸收率為92.13%，說明其在瘤胃中的穩(wěn)定性比較高，起到了保護作用且在小腸中沒有被過度保護，使得GABA沒有很快被瘤胃微生物降解且棕櫚酸對GABA的釋放影響不大。

pH值的動態(tài)變化反映了瘤胃內(nèi)有機酸以及唾液緩沖的相互作用，一般認(rèn)為正常變動范圍在6～7之間，當(dāng)pH值小于6時，對瘤胃微生物有不利影響，初步表現(xiàn)為原蟲與纖維分解菌的生長會受到抑制。本試驗中，隨采食初期進入瘤胃內(nèi)的淀粉及可溶性碳水化合物被瘤胃微生物降解產(chǎn)生大量VFA，從而pH值下降，而后pH值上升，是由于瘤胃壁對VFA的吸收以及瘤胃液中弱堿性鹽的緩沖作用，在采食3 h后，pH值明顯降低了，并且不在瘤胃正常pH值范圍內(nèi)，而楊善軍認(rèn)為，添加棕櫚酸能夠提高pH值，Atasoglu等研究表明，一些氨基酸，如Met、Lys可能限制微生物的生長。所以本試驗中pH值的下降不是由包被材料棕櫚酸引起的，可能是由于GABA對瘤胃微生物代謝調(diào)節(jié)，抑制了厭氧微生物，如原蟲或細(xì)菌的生長代謝，所以引起了pH值的下降。

NH3-N濃度反映了飼料粗蛋白在瘤胃內(nèi)降解、微生物對氨的攝取利用以及瘤胃上皮對氨吸收的動態(tài)平衡，適宜的濃度是保證瘤胃微生物蛋白合成的首要條件，通常認(rèn)為，5～28 mg/100 ml為NH3-N濃度適宜范圍。本試驗采食初期，瘤胃微生物種群迅速增殖，食糜中蛋白質(zhì)降解，NH3-N濃度快速上升，1 h后，隨著瘤胃微生物對NH3-N的利用，NH3-N濃度逐漸降低，至3 h時達(dá)到最低，微生物利用NH3-N的同時又加速了蛋白質(zhì)的分解，NH3-N濃度又有回升的趨勢，在3～6 h，NH3-N濃度都比較低，可能由于食糜中蛋白質(zhì)不足，瘤胃微生物生長緩慢，碳水化合物分解利用受阻。GABA添加組與CON組相比提高了采食后3 h時NH3-N濃度，可能由于GABA本身作為氨基酸提供氮源。徐愛秋等研究表明，如果瘤胃中缺少特定的氨基酸底物則對瘤胃蛋白質(zhì)降解菌生長有一定的抑制作用，說明氨基酸對微生物有一定的作用。本文中GABA作為氨基酸可能對瘤胃蛋白質(zhì)降解菌的生長有一定的促進作用，提高了其降解蛋白質(zhì)并利用其生產(chǎn)氨的活性，所以在采食6 h時NH3-N濃度降低，而且對照組同一添加量不同時間點NH3-H濃度的變化與對照組相比較變化較大，可能也是由于GABA對瘤胃蛋白質(zhì)降解菌生長的促進作用。

VFA的主要作用是為反芻動物自身提供能源，其中乙酸、丙酸、丁酸占TVFA的絕大部分。瘤胃壁吸收乙酸后，將其輸送到血液循環(huán)，再進入三羧酸循環(huán)（TAC）氧化供能，反芻動物所需葡萄糖主要來源于糖異生，而丙酸是糖異生的主要前體物質(zhì)，同時心臟也利用部分丙酸。本試驗中，不同水平添加GABA均不同程度地提高了TVFA及乙酸、丙酸的濃度，這與Bum Seung Ku和Dawson等的研究結(jié)果一致，Seung Kud等在體外培養(yǎng)瓶中加入2 000 mg/kg和5 000 mg/kg的GABA，結(jié)果表明，其可以提高TVFA及乙酸、丙酸的濃度，Dawson等認(rèn)為，向瘤胃內(nèi)灌注2 g/kg（DM）濃度GABA會提高丙酸的比例，丙酸的增加是由于GABA在生成琥珀酸的過程中產(chǎn)生二氧化碳，進而生成更多的丙酸。乙酸/丙酸與能量轉(zhuǎn)化效率相關(guān)，本試驗中，動物采食后3～6 h，GABA添加組乙酸/丙酸增加了。

4 結(jié)論

棕櫚酸包被GABA在瘤胃內(nèi)24 h的消化率為20.97%，體外法測得其在小腸中16 h消化率為92.13%。棕櫚酸包被GABA降低延邊黃牛采食3 h后瘤胃液pH值；棕櫚酸包被GABA提高了延邊黃牛采食3 h后瘤胃液NH3-N濃度，降低了采食6 h后瘤胃液NH3-N濃度；棕櫚酸包被GABA增加了TVFA及乙酸、丙酸、丁酸的濃度以及3、6 h乙酸/丙酸。本試驗條件下，4.6 g/kg的棕櫚酸包被GABA更有利于延邊黃牛瘤胃體內(nèi)發(fā)酵。

（參考文獻(xiàn)28篇，刊略，需者可函索）