淺論用閃式提取工藝提取顯齒蛇葡萄中黃酮的效果

吳詩(shī)藝 高 陸? 蘇 婷

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 吉林 長(zhǎng)春 130117；2.吉林修正藥業(yè)新藥開(kāi)發(fā)有限公司 吉林 長(zhǎng)春 130012）

顯齒蛇葡萄（Ampelopsis GrossedentaHand-Mazz. W.T.Wa）又叫藤茶、山甜茶、白茶，其全株均可入藥，具有清熱解毒、抗菌消炎、祛風(fēng)濕、降血壓、保肝、止咳、祛痰和鎮(zhèn)痛等功效[1—4]。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，顯齒蛇葡萄中的有效藥物成分主要為黃酮。顯齒蛇葡萄中的黃酮是一種化合物，其主要成分包括二氫楊梅素、槲皮素、花旗松素、山奈酚、顯齒蛇葡萄素、楊梅苷、橙皮素和洋芹素等。在藥學(xué)領(lǐng)域，如何簡(jiǎn)單、有效地從顯齒蛇葡萄中提取出黃酮一直是一個(gè)難題。近年來(lái)，使用閃式提取工藝提取顯齒蛇葡萄中黃酮的效果獲得了藥學(xué)界的認(rèn)可。用閃式提取工藝提取顯齒蛇葡萄中黃酮的原理是：使用機(jī)械對(duì)顯齒蛇葡萄的根、莖、葉進(jìn)行破壞，并使用溶劑將顯齒蛇葡萄中含有的黃酮進(jìn)行解離、溶解，使其快速進(jìn)入到溶劑中[5]。為了進(jìn)一步研究用閃式提取工藝提取顯齒蛇葡萄中黃酮的效果，筆者進(jìn)行了以下研究?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下：

1 儀器與試藥

1.1 試驗(yàn)用原料

本次試驗(yàn)使用的原料為顯齒蛇葡萄葉，購(gòu)自于福建漳平縣新橋鎮(zhèn)。

1.2 試驗(yàn)用試劑

本次試驗(yàn)使用的試劑包括：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供）、乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉（分析純）和純化水（自制）。

1.3 試驗(yàn)用儀器

本次試驗(yàn)使用的儀器包括：JHBE-50T型閃式提取器（由金鼐科技公司提供）、UV—6100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（由北京普元精電科技有限公司提供）、RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（由上海亞榮生化儀器廠提供）。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 空白溶液的制備

精密量取2mL濃度為80%的乙醇，將其裝入刻度試管中，再向試管中加入0.2mL 濃度為5%的亞硝酸鈉溶液，搖勻后放置6min。向試管中加入0.2mL濃度為10%的硝酸鋁溶液，放置 6 min，再向其中加入4ml濃度為 5% 的氫氧化鈉溶液，搖勻，放置15 min，既得到空白溶液。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取蘆丁對(duì)照品6.47 mg，將其裝入10mL的容量瓶中，再向容量瓶中加入10 mL濃度為80%的乙醇進(jìn)行定容，然后搖勻，即得到濃度為0.647 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.6 mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL和1.4mL，將它們分別放入刻度試管中，然后向每個(gè)試管內(nèi)加入適量的濃度為80%的乙醇，使試管內(nèi)的溶液量達(dá)到2.0mL。分別向每個(gè)試管中加入適量的濃度為5%的亞硝酸鈉溶液，放置6 min，再向試管內(nèi)加入適量的濃度為10%的硝酸鋁溶液，放置6 min，最后向試管內(nèi)加入2.0ml濃度為45%的氫氧化鈉溶液，搖勻后放置 15 min。另取一個(gè)試管，在其中加入空白對(duì)照溶液。在510nm波長(zhǎng)下測(cè)定所有試管中溶液的吸收度[6]，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用A值作為縱坐標(biāo)，用質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得到回歸方程為：Y=13.918X - 0. 0066，r2= 0. 9998。這說(shuō)明，蘆丁在0.060656～0.141531mg/ml的濃度范圍內(nèi)與吸收度A呈良好的線性關(guān)系。

2.4 供試品溶液的制備

提取顯齒蛇葡萄濃縮溶液50mL，用75mL的氯仿對(duì)其進(jìn)行三次萃取脫脂處理。待顯齒蛇葡萄濃縮溶液完全分層后，收集其下層的水溶液并將其定容至 50mL，即得到供試品溶液。

2.5 黃酮含量的測(cè)定

精密吸取供試品溶液0.1mL，將其放入試管中，然后向試管中加入適量的濃度為80%的乙醇，使試管內(nèi)的溶液量達(dá)到2.0mL。按“2.3”中的方法，在510nm波長(zhǎng)下測(cè)定供試品溶液的吸收度Y，并將Y值代入線性回歸方程中計(jì)算顯齒蛇葡萄中黃酮的含量。

2.6 對(duì)閃式提取工藝的優(yōu)化處理

2.6.1 實(shí)驗(yàn)因素與水平的選擇 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的項(xiàng)目，選擇提取次數(shù)、提取時(shí)間和加水倍數(shù)作為考察對(duì)象，用黃酮的含量作為考察的指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（34）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。詳情見(jiàn)表1。

對(duì)表2進(jìn)行直觀的分析可以得出，最優(yōu)組合為A3B3C2，即提取工藝參數(shù)為：加水16倍，提取的時(shí)間為3min/次，提取的次數(shù)2次。由R值可知，在不考慮交互作用的情況下，各因素的主次順序?yàn)椋禾崛〈螖?shù)＞提取時(shí)間＞加水倍數(shù)。通過(guò)對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀的分析可知，提取顯齒蛇葡萄中黃酮的最佳閃式提取工藝為：在提取時(shí)加16倍的水作為溶劑，應(yīng)連續(xù)提取2次，每次提取3min。

由表3可知，提取次數(shù)對(duì)黃酮的提取效果具有顯著的影響，而加水倍數(shù)和提取時(shí)間對(duì)黃酮的提取效果影響不顯著。

2.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

稱取顯齒蛇葡萄葉3份，按正交試驗(yàn)最優(yōu)工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)進(jìn)行2次。結(jié)果見(jiàn)表4。

表1 L9（34）因素水平表

2.6.2 正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果 詳情見(jiàn)表2和表3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

表3 方差分析表

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

對(duì)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與正交實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，兩者在相同水平下測(cè)定的結(jié)果相近，故說(shuō)明進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)所確定的最佳提取工藝是正確的。

3 討論

總之，用閃式提取工藝提取顯齒蛇葡萄中的黃酮具有操作簡(jiǎn)單和提取率高等優(yōu)點(diǎn)。此方法可作為提取顯齒蛇葡萄中黃酮的首選方法。

[1]歐賢紅,葉勇,黃秋潔,劉華鋼,宋云飛. 藤茶抗氧化活性研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2013,02:245-248.

[2]中國(guó)科學(xué)院植物研究所.中國(guó)高等植物圖鑒(二冊(cè))補(bǔ)編[M].北京:科學(xué)出版社,1983.349-356.

[3]〈全國(guó)中草藥匯編〉編寫(xiě)組.全國(guó)中草藥匯編:下冊(cè)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1978:788.

[4]易誠(chéng). 顯齒蛇葡萄研究進(jìn)展[J]. 經(jīng)濟(jì)林研究,2004,03:51-56.

[5]曲帥. 人參有效活性成分的提取分離及含量測(cè)定[D].吉林大學(xué),2013.

[6]鄧素蘭,余繼宏,管 林.杜仲不同部位總黃酮含量的測(cè)定.生物質(zhì)化學(xué)工程,2007,41(3):37-38.