喹烯酮及其代謝物的毒性預測及驗證

■蔣 慧 程林麗 扶 曉 張 鑫

（中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100094）

喹烯酮是我國一類飼料添加劑藥物，能提高飼料轉化率，促進蛋白質同化，還具有抗菌和促生長作用，目前廣泛應用于畜牧業(yè)和養(yǎng)禽業(yè)，特別適用于幼畜、幼禽[1]。雖然喹烯酮的毒理學試驗證明其毒性極小，但由于喹乙醇等其它同類藥物被證明具有潛在的致癌性和產生抗藥性的可能，國際上大多數(shù)國家將該類藥物列為限用藥物[2-3]，喹烯酮及其代謝物在可食性動物組織中的殘留也可能對人類健康造成潛在的危害。而且，不合理使用和濫用藥物問題，不可避免地會導致動物性食品中該種藥物及代謝物的殘留。目前，對獸藥的毒性安全評價基本都是傳統(tǒng)實驗評價方法，其內容主要有藥物的急性毒性、亞慢性毒性、致突變性、致畸性、繁殖毒性等[4]。本研究采用QSAR方法預測喹烯酮類獸藥的代謝產物組群的精細毒性指紋，旨在為喹烯酮類藥物的進一步藥理毒理學研究、殘留消除規(guī)律研究以及食品安全性評估提供參考數(shù)據和高效的技術手段。

1 研究方法

1.1 查閱文獻，建立喹烯酮代謝組群

建立良好的化合物化學結構與生物活性關系（包括藥理和毒理）的首要條件是找對合適的化合物，并對它們進行正確的分類。喹烯酮的代謝過程復雜。Huang等（2005）[5]采用簡單的HPLC方法，在代謝研究中發(fā)現(xiàn)脫二氧喹烯酮和MQCA是喹烯酮在動物體內的代謝物。Liu等（2010）[6]對小鼠肝微粒體系統(tǒng)中喹烯酮的代謝研究中共發(fā)現(xiàn)27種代謝物，包括11種支鏈或原子斷裂后產生的代謝物、3種直接羥化產物和13種斷裂與羥化結合的代謝物。Shen等（2010）[7]采用液質聯(lián)用技術分析豬尿中的喹烯酮代謝物，結果表明喹烯酮在豬體內代謝廣泛，在豬尿中共檢測到31種代謝物，包括大量的N-O基團還原產物、雙鍵還原產物、羰基還原產物、側鏈甲基羥化產物和側鏈苯環(huán)羥化產物。Wu等（2011）[8]對豬體內的喹烯酮代謝研究中共發(fā)現(xiàn)了42種代謝物。根據代謝物的種類和分布情況，推測出喹噁啉雜環(huán)上1-位的N-O基團還原反應、側鏈甲基上和苯環(huán)上的羥化反應為喹烯酮在豬體內的主要代謝途徑。喹烯酮的主要代謝物為脫二氧喹烯酮、4-脫氧喹烯酮的雙鍵還原物和脫二氧喹烯酮的雙鍵還原物，主要殘留物有1-脫氧喹烯酮、4-脫氧喹烯酮和3-甲基喹噁啉-2-羧酸等。對喹烯酮類藥物代謝物鑒定研究的發(fā)展為建立各化合物的代謝組群提供了物質基礎。

1.2 喹烯酮及其代謝產物毒性預測

化合物定量構效關系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）研究方法是新藥設計與研究的關鍵技術之一，也是目前探討化合物結構和毒性關系的一種有效手段。它的最大特點便是能利用少數(shù)種類的已知結構的化合物建立起構效關系模型，以此模型對大量類似結構化合物的藥效或毒效進行預測。它在預測化合物的生物活性、結構與選擇性作用、藥物動力學、幫助了解藥物的作用機制及推測受體圖象等方面均取得不少成績[9]。QSAR預測化合物毒性的技術在歐美等國家已步入實用階段，Pfizer公司的Derek、FDA的MutiCase等毒性預測軟件已經日益得到了認可和應用。使用QSAR技術預測化合物毒性可以極大地提高藥物篩選效率和節(jié)約動物實驗資源，降低潛在藥物篩選或藥物性安全評價的成本[10]。但目前在我國相關應用仍不多見。

本研究采用商業(yè)軟件預測出喹烯酮類藥物代謝組學的毒性參數(shù)，并對代謝組群之間的毒性作用進行比較分析。最后用文獻報道的實驗數(shù)據對毒性預測結果進行驗證，探討藥物在動物體內的毒理活性關鍵物質。

研究所用的硬件和軟件為ADMET Predictor 6.5軟件（Simulation Plus公司）和Windows XP操作系統(tǒng)（美國微軟公司）。

2 結果與討論

2.1 喹烯酮類藥物毒性代謝組群的構建

我們選取各個獸藥結構明確的代謝物，建立起喹烯酮類藥物代謝組群，為進一步的毒性研究提供基礎。喹烯酮的代謝組群見表1。在其后的毒性研究中各化合物采用表中所列的編號顯示，且均保持不變。

表1 喹烯酮代謝組群

表1 （續(xù)） 喹烯酮代謝組群

2.2 喹烯酮類藥物代謝組群毒性預測結果

采用ADMET Predictor，建立化合物結構參數(shù)與毒性參數(shù)之間的數(shù)學關系，測得喹烯酮類藥物的毒性值見表2。這些表中的參數(shù)值為我們提供了對喹烯酮類獸藥代謝組群的毒性指紋譜。對該毒性指紋譜進行分析，我們可以找到喹烯酮類獸藥在動物體內和體外系統(tǒng)中的高毒性物質和低毒性物質，為該類藥物的新獸藥研制提供新的化合物。結合對各代謝物在動物體內的殘留量分析，還能夠準確地定量分析原藥和各代謝物對該藥物在動物體內毒性作用的具體貢獻大小，準確地判斷藥物的毒性作用，以盡量減少由于獸藥毒性評價粗放（僅對藥物原體在動物體內的毒性作用評價）而導致獸藥在臨床使用過程中表現(xiàn)出毒性作用以后再禁止使用的事例發(fā)生。對藥物在動物體內的毒性作用研究越精細，便越有利于制定對有毒物質的有效監(jiān)控措施。

表2 喹烯酮代謝組群毒性預測結果

表2 （續(xù)） 喹烯酮代謝組群毒性預測結果

2.3 ADMET Predictor毒性預測的結果分析

ADMET Precidtor中毒性預測模塊的測定內容和主要參數(shù)見表3。我們在獲得喹烯酮及其代謝物的各個毒性參數(shù)的基礎上進行比較分析，確定各獸藥代謝物毒性指紋譜中的高毒和低毒物質，同時對5種獸藥毒性代謝譜進行橫向比較分析，從代謝的角度比較5個化合物在動物體內可能的毒性大小。

2.3.1 喹烯酮類藥物代謝組群的急性毒性比較分析

表3 毒性預測模塊中主要影響化合物的成藥性因素

急性毒性是衡量化合物毒性的重要指標。動物性試驗中化合物的急性毒性數(shù)據一般指大鼠的半數(shù)致死濃度LD50。對急性毒性進行評價，聯(lián)合國世界衛(wèi)生組織推薦了一個五級標準。我國在此分級標準的基礎上，提出了與此基本相同但更具體的6級標準。該標準規(guī)定小鼠一次經口LD50（mg/kg）值：＜1，6級，極毒；1～50，5級，劇毒；51～500，4級，中等毒；501～5 000，3級，低毒；5 001～15 000，2級，實際無毒；＞15 000，1級，無毒。

根據文獻報道，張偉（2007）[11]以Wistar大鼠和昆明小鼠為研究對象，采用一次性灌胃染毒，對喹烯酮進行了急性毒性試驗。結果測得喹烯酮對Wistar大鼠的經口LD50值為8 687.31 mg/kg；對昆明小鼠經口LD50為15 848.93 mg/kg。按照急性毒性分級標準喹烯酮為實際無毒物質。王玉春等（1992）[12]采用Wistar大鼠和昆明小鼠進行了喹烯酮的急性毒性試驗，結果表明，大鼠的 LD50為 8 178.996 mg/kg，小鼠的 LD50為14 397.928 mg/kg，毒性均較低。

本研究使用的預測軟件規(guī)定其預測的化合物TOX_RAT值應大于或等于300 mg/（kg·d）才能判定為無急性毒性。結合表2的數(shù)據可知，按預測軟件的標準，喹烯酮類藥物代謝組群的TOX_RAT預測值≥300 mg/（kg·d），沒有急性毒性。

從單個獸藥代謝組群看來，喹烯酮代謝組群的急性毒性范圍為673.32～1 890.67 mg/（kg·d）之間，其中喹烯酮的毒性為1 824.82 mg/（kg·d），毒性最低的代謝物為1-DQCT，毒性最高的代謝物為QCT-M3。

由此可見，本預測結果中喹烯酮的預測毒性與文獻報道的實驗值基本相符。但是要準確地比較各化合物實際毒性大小，還需要檢測出動物體內各化合物在動物代謝物譜中所占的百分比例，從而計算出動物體內各代謝物的貢獻。

2.3.2 喹噁啉類藥物代謝組群的致癌性比較分析

致癌性的表征目前主要有大鼠致癌性試驗和小鼠致癌試驗。許多化學物質被大鼠和小鼠服用后可以誘導癌癥。一些化學物質，尤其是一些獸用化學品在大鼠模型中呈陰性，而在小鼠中則誘導肝臟腫瘤。不管出現(xiàn)何種反應，只要化學物在任一測試中誘導癌癥，則被認為是致癌物，且不用考慮它的相關性和基礎機理，即可外推得出結論認為該化學物質對人類也有致癌風險。

本研究對兩種試驗結果均進行了預測。致癌性以半數(shù)致癌濃度TD50表示，單位為mg/（kg·d）。在本文使用的預測軟件建立的致癌性預測模型中，TOX_BRM_Rat的預測值應大于或等于4。TOX_BRM_Mouse預測值應大于或等于25。

2.3.2.1 喹烯酮類藥物致癌性大鼠模型建立和預測

本預測結果中，喹烯酮類獸藥代謝物組群的大鼠半數(shù)致癌濃度TD50見表2。由表2可知，喹烯酮類藥物代謝組群的TOX_BRM_Rat的預測值中除QCTM11、QCT-M18、QCT-M20和QCT-M22以外，其它化合物TD50值都在4以上，均不具有大鼠致癌性，說明QCT檢測到大鼠致癌性。關于喹烯酮類藥物代謝組群的大鼠致癌性尚未找到相關文獻報道的實驗數(shù)據。

2.3.2.2 喹烯酮類藥物致癌性小鼠模型建立和預測

根據文獻報道，王玉春等（1995）[13]對喹烯酮進行致癌試驗，分別以0、75、150、300 mg/kg的劑量喂養(yǎng)昆明小鼠20個月，經過臨床檢查、血液學檢查、血液生化檢查和病理組織檢查，并未發(fā)現(xiàn)喹烯酮的致癌作用。

本預測結果中，喹烯酮類獸藥代謝物組群的小鼠半數(shù)致癌濃度TD50TOX_BRM_Mouse見表2。由表2可知，喹烯酮代謝組群的TOX_BRM_Mouse的預測值中僅QCT-M2的半數(shù)致癌濃度為24.17 mg/（kg·d），接近25 mg/（kg·d），小鼠致癌性不明顯。與文獻報道大致相符。

2.3.3 喹烯酮類藥物代謝組群對染色體變異的比較分析

涂宏鋼（2007）[14]研究了喹噁啉類藥物對哺乳動物細胞的遺傳毒性，結果表明，喹烯酮在高劑量時對哺乳動物細胞有一定的遺傳毒性。Ihsan等（2013）[15]研究了喹烯酮、喹賽多、喹乙醇在體內與體外的遺傳毒性，也表明喹烯酮在高劑量時有一定的遺傳毒性。

對喹烯酮類藥物代謝組群的染色體變異預測果見表2。由表2中TOX-CABR的預測值可知：喹烯酮代謝組群的20個化合物中，10個化合物（包括喹烯酮）均預測到無致染色體變異性，另10個化合物預測到致染色體變異性。與文獻報道大致相符。

2.3.4 喹烯酮類藥物代謝組群的生殖毒性比較分析

張偉（2007）[11]對喹烯酮進行了二代繁殖試驗研究。結果表明，F(xiàn)0代和F1代喹烯酮1 800 mg/kg組胎鼠體重和飼料利用率低于空白對照組，窩平均活崽數(shù)和第21 d平均仔重與空白對照組相比差異極顯著（P＜0.01），各組大鼠生殖器官未見異常。喹烯酮對大鼠生殖發(fā)育毒性的NOAEL為30 mg/kg b.w.，按照FDA的ADI和最高殘留限量公式，計算其ADI為0.03 mg/kg b.w.；在肌肉、肝臟、腎臟和脂肪的最高殘留限量分別為6.0、18.0、36.0 mg/kg和36.0 mg/kg。實際給藥時動物組織中原藥及代謝物的殘留量遠遠低于最高殘留限量。所以，喹烯酮的安全性很高。嚴相林等（1997）[16]以1/20、1/10 和l/5 LD50的劑量來觀察喹烯酮對小鼠精子的影響，結果表明喹烯酮未引起小白鼠精子畸變率的明顯增加。

對喹烯酮類藥物代謝組群的生殖毒性預測結果見表2。由表2中TOX_REPR的預測值可知，喹烯酮代謝組群中6種化合物（QCT、4-DQCT、1-DQCT、QCT-M10、QCT-M12、QCT-M15）預測到生殖毒性，另14種化合物未預測到生殖毒性。與文獻報道大致相符。

2.3.5 喹烯酮類藥物代謝組群的致突變性比較分析

研究表明，喹烯酮類藥物在體外微生物測試系統(tǒng)中表現(xiàn)出不同程度的誘變性。嚴相林等（1998）[17]對喹烯酮進行了Ames試驗，用經鑒定符合要求的鼠傷寒沙門氏菌TA98、TAl00為試驗菌株，受試物喹烯酮的劑量分別為1.0、5.0、10.0 μg/ml和50.0 μg/ml。結果表明，喹烯酮對鼠傷寒沙門氏菌TA98及TA100，無論直接作用或代謝活化后作用，均無致突變性。張偉（2007）[11]對喹烯酮臨床前遺傳毒性進行了研究。鼠傷寒沙門氏菌回復突變（Ames）試驗菌株為TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535、TA1537。試驗劑量為1.0～50.0 μg/ml，結果表明，除TA102和TA1535加與不加S9時都為陰性外，喹烯酮對TA97、TA98、TA100，和TA1537在一定劑量加與不加S9均為陽性。張偉（2007）[11]還對喹烯酮（1 700、3 600、7 200 mg/kg b.w.）進行了小鼠骨髓細胞微核試驗。結果表明，喹烯酮對小鼠骨髓未呈明顯的細胞毒性作用，紅細胞的形成未受到抑制，不影響微核計數(shù)。喹烯酮微核試驗結果為陰性。

Ames沙門氏菌致突變試驗是一個短期的細菌回復突變試驗。它能夠檢測多種化學誘導能產生遺傳損傷的化合物。這些化合物可能會使人類致癌。在新藥研發(fā)過程中，預測化合物是否具有誘導突變作用十分重要。預測化合物的致突變性是在藥物發(fā)現(xiàn)和發(fā)展的重要能力。

對喹烯酮類獸藥代謝組群采用10種沙門菌的Ames試驗模型進行致突變性預測，對10株沙門菌預測的綜合打分結果見表2。對于大多數(shù)藥物分子，TOX_MUT_Risk應小于或等于2。由表2可知，喹烯酮代謝組群中 QCT、4-DQCT、1-DQCT、QCT-M3、QCT-M10、QCT-M12、QCT-M16均具有致突變作用。與文獻報道大致相符。

2.3.6 喹烯酮類藥物代謝組群的生物富集指數(shù)比較分析

生物富集作用是衡量化合物對環(huán)境染污的指標。對于獸藥使用安全來說，除了獸藥對環(huán)境的污染問題，我們關注得更多的是獸藥及其代謝物在動物體內的生物富集問題。生物富集指數(shù)越高，獸藥及其代謝物在動物體內的殘留量越大，獸藥安全性便越差。雖然生物富集因子BCF為在穩(wěn)定狀態(tài)下生物有機體（如魚）與水中化合物濃度的比值，但它從一定程度上為動物體內的獸藥殘留富集提供了一定的參考。如果有機化合物的BCF值＜100，則可以認為該化合物對環(huán)境的影響很小，不易在動物體內富集。生物富集指數(shù)越高，則化合物在動物體內的富集作用越強。喹烯酮代謝組群的BCF值范圍為1.389～20.811，其中BCF值最小的為MQCA，BCF值最大的為BDQCT，生物富集指數(shù)較小。

有關喹烯酮的藥物殘留的研究有很多文獻報道，李建勇等（2003）[18]進行的喹烯酮在豬、雞體內的藥代動力學研究表明，喹烯酮經口服后，作用于消化道，吸收進入血液和組織的藥物很少，大部分藥物以原形從胃腸道排出，生物利用度低，在機體內消除快，殘留極少。由此可見，對喹烯酮類藥物代謝組群的生物富集指數(shù)的預測與文獻報道基本相符。

2.3.7 喹烯酮類藥物代謝組群的毒性綜合打分比較分析

根據ADMET Predictor默認提供的打分規(guī)則，對喹烯酮類獸藥代謝組群各化合物的毒性性質進行綜合評價，采用TOX_Risk參數(shù)表示。綜合評價結果見表2。喹烯酮代謝組群的TOX_Risk值均小于等于2，說明該獸藥代謝組群綜合毒性低。這與所查閱的文獻結論相符。

3 結論

本研究建立了喹烯酮獸藥的代謝產物組群，利用ADMET Predictor軟件中的毒性預測功能對喹烯酮代謝組群的急性毒性、致癌性、致染色體變異性、致突變性、遺傳毒性和生物富集指數(shù)等毒性參數(shù)進行了預測及綜合評價，探討藥物在動物體內的毒理活性關鍵物質，并與文獻報道的實驗數(shù)據進行了比較和驗證。

預測結果中，喹烯酮類藥物代謝組群的急性毒性中毒性最高的代謝物為QCT-M3；喹烯酮類藥物代謝組群中預測到大鼠致癌性的化合物有QCT-M11、QCT-M18、QCT-M20和QCT-M22，其中QCT-M11預測得到的大鼠半數(shù)致癌濃度TD50值最小；預測到致染色體變異性的化合物有BDQCT、1-DQCT、MQCA、QCT-M1、QCT-M3、QCT-M8、QCT-M10、QCT-M12、QCT-M15、QCT-M16 10個；預測到生殖毒性的化合物有QCT、4-DQCT、1-DQCT、QCT-M10、QCT-M12、QCT-M15 6個；預測到的具有致突變作用化合物有QCT、4-DQCT、1-DQCT、QCT-M3、QCT-M10、QCTM12、QCT-M16 7個；BCF值最大的為BDQCT。

預測值與文獻報道的實驗數(shù)據進行比較和驗證的結果表明：除喹烯酮類藥物代謝組群的大鼠致癌性尚未找到相關文獻報道的實驗數(shù)據外，其他毒性預測結果均與文獻報道的實驗值基本相符，說明該方法可行性較大，且極大地縮短了藥物性安全評價的時間，并降低了成本，為從代謝組群基礎上精細研究藥物在動物體內的毒性作用提供了高效的手段。