凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）消化性蛋白酶的分布及種類

■ 曹啟猛 于躍芹 王 雷 王寶杰

（1.青島科技大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，山東青島 266042；2.中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266071；3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266071）

（參考文獻(xiàn)21篇，刊略，需者可函索）

凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）又稱南美白對(duì)蝦，以其肉質(zhì)鮮嫩、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的特點(diǎn)深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)，是我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖的主要品種之一。近幾年，隨著對(duì)蝦養(yǎng)殖規(guī)模的迅速增長(zhǎng)，養(yǎng)殖環(huán)境的不斷惡化，對(duì)蝦養(yǎng)殖中逐漸出現(xiàn)餌料利用率低、增長(zhǎng)速度慢、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)等問(wèn)題，增加了養(yǎng)殖成本，降低了對(duì)蝦的品質(zhì)。全面了解凡納濱對(duì)蝦消化酶（尤其是蛋白酶）的特點(diǎn)及組成，為凡納濱對(duì)蝦合理養(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)是解決該問(wèn)題的方法之一。

酶譜法（Zymography）是一種常用的酶檢測(cè)技術(shù)，利用染色方法來(lái)標(biāo)記酶的位置或通過(guò)恢復(fù)酶的活性使之與特異性底物反應(yīng)來(lái)對(duì)其染色，即可在凝膠看到酶遷移到達(dá)的位置出現(xiàn)特異的色帶。通過(guò)觀察色帶的位置和數(shù)量，即可推斷樣品中的酶的種類。酶譜分析法能夠在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)分離復(fù)雜的蛋白酶樣品，并得到近似分子量，因此在科學(xué)研究領(lǐng)域和實(shí)踐中均有廣泛的應(yīng)用。Hosseininaveh等對(duì)谷斑皮蠹（一種小麥害蟲）消化蛋白酶研究發(fā)現(xiàn)，凝膠電泳圖顯示在谷斑皮蠹幼蟲的中腸位置至少有六條蛋白酶條帶，以絲氨酸蛋白酶為主，并未發(fā)現(xiàn)半胱氨酸蛋白酶；Liu等對(duì)海洋細(xì)菌蛋白酶特點(diǎn)分析得到，弧菌的細(xì)胞外蛋白酶的分子量約為35 kDa；Al-Sweed等利用酶譜分析法對(duì)眼鏡蛇毒素中金屬蛋白酶活力的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在55 kDa處有蛋白條帶，推斷該毒素中金屬蛋白酶的分子量為55 kDa或分子量為110 kDa的二聚體。

為了解凡納濱對(duì)蝦消化性蛋白酶的種類和分布，并對(duì)凡納濱對(duì)蝦消化生理學(xué)的研究和科學(xué)合理養(yǎng)殖提供一定的理論基礎(chǔ)，本文采用偶氮酪蛋白（Azocasein）水解法對(duì)凡納濱對(duì)蝦中肝胰腺、胃和腸道中總蛋白酶活力和蛋白酶分布進(jìn)行探究，并利用酶抑制劑實(shí)驗(yàn)和含底物的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（substrate-SDS-PAGE）法對(duì)消化蛋白酶的種類進(jìn)行對(duì)比分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)蝦于2015年9月由中國(guó)科學(xué)院海洋所膠南養(yǎng)殖基地提供，隨機(jī)選取10尾進(jìn)行體長(zhǎng)和體重的測(cè)量，取平均值，平均體長(zhǎng)（8.12±0.79）cm，平均體重為（7.15±0.84）g。該養(yǎng)殖基地采用大棚養(yǎng)殖模式，海水經(jīng)過(guò)蓄水沉淀池的消毒、沉淀和凈化處理后引入對(duì)蝦養(yǎng)殖池使用。全程使用優(yōu)質(zhì)人工餌料，水溫控制在27.5～30.0 ℃。

1.2 粗酶液的制備

凡納濱對(duì)蝦饑餓24 h，在冰板上解剖，取出肝胰腺、胃和腸并稱重，按1∶4（w/v）的比例加入4℃預(yù)冷的50 mmol/l Tris-HCl（pH值7.4）緩沖液，將取出的消化腺分別剪碎后在玻璃勻漿器中勻漿，勻漿液4℃下靜置過(guò)夜，在4℃、10 000×g條件下離心30 min。收集上清液作為消化酶粗提液，置于-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 蛋白酶活力的檢測(cè)

1.3.1 pH值對(duì)總蛋白酶活力的影響

參照Bezerra等的方法，采用Azocasein（偶氮酪蛋白）水解法檢測(cè)不同pH值下總蛋白酶活力，略有修改。具體操作為：50 μl 1%（w/v）Azocasein（不同pH值的緩沖液）溶液中，加入30μl的粗酶液，混合均勻后，25℃下恒溫孵育60 min，加入240μl 20%的三氯乙酸（TCA）溶液終止反應(yīng)，15 min后，8 000×g離心5 min，取70μl的上清液與130μl 1 M NaOH 于96孔板中混合均勻（注意不要產(chǎn)生氣泡），用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)吸光度。蛋白酶活力單位：相應(yīng)pH值下，溫度25℃時(shí)，對(duì)蝦蛋白酶每分鐘水解1%Azocation吸光度變化0.001的量，單位為U。比活力定義為每毫克蛋白中所含有的酶活力單位數(shù)，單位為U/mg。消化蛋白酶中蛋白含量的檢測(cè)采用Bradford法，實(shí)驗(yàn)步驟參考蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)（Tiangen公司）。

不同pH值緩沖液的配制：不同的pH值緩沖液的配制參考Riseh等方法，略有改動(dòng)。pH值3～12采用40 mM glycine-phosphate-acetic-citric緩沖體系。pH值1～2采用不同濃度的鹽酸溶液配制。

1.3.2 溫度對(duì)總蛋白酶的影響

將 50 μl 1%（w/v）Azocasein（pH 值 7.0，40 mM glycine-phosphate-acetic-citric）和30 μl的粗酶液混合均勻后，分別置于 10、20、30、40、50、60、70、80、90℃下反應(yīng)60 min，其余操作與1.3.1相同。蛋白酶活力單位：相應(yīng)溫度下，pH值7.0時(shí)，對(duì)蝦蛋白酶每分鐘水解1%Azocation吸光度變化0.001的量，單位為U。比活力定義為每毫克蛋白中所含有的酶活力單位數(shù)，單位為U/mg。

1.3.3 蛋白酶水解活力的分布

在最適pH值（pH值8.5）和30℃下，采用Azocasein水解法，對(duì)三種消化酶粗提液進(jìn)行蛋白酶活力的檢測(cè)。蛋白酶活力單位：pH值8.5，溫度30℃下，對(duì)蝦蛋白酶每分鐘水解1%Azocation吸光度變化0.001的量，單位為U。比活力定義為每毫克蛋白中所含有的酶活力單位數(shù)，單位為U/mg。

1.4 蛋白酶抑制劑對(duì)消化性蛋白酶的影響

選取碘乙酰胺（IAM）、胃蛋白酶抑制劑（Pepstatin A）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、甲苯磺酰-苯丙氨酸氯甲基酮（TPCK）、乙二胺四乙酸（EDTA）、大豆胰蛋白酶抑制劑（SBTI）等六種不同類型特異性蛋白酶分別處理蛋白酶樣品，不同蛋白酶抑制劑的相應(yīng)的溶劑、濃度和對(duì)應(yīng)的靶蛋白酶見(jiàn)表1。樣品處理參照Darvishzadeh等操作如下：蛋白酶和不同蛋白酶抑制按1∶1的（v/v）混合并在25℃恒溫箱內(nèi)恒溫孵育60 h后，取30μl的混合液并50μl 1%Azocasein溶液混合均勻，30℃恒溫箱中反應(yīng)60 h，參照Azocasein水解法檢測(cè)不同蛋白酶抑制劑作用下的蛋白酶酶活。根據(jù)不同抑制劑作用下的蛋白酶剩余活力初步判斷蛋白酶的種類（見(jiàn)表1）。

表1 不同蛋白酶抑制劑對(duì)應(yīng)的溶劑和靶蛋白酶

1.5 電泳酶譜分析

堿性蛋白酶電泳酶譜分析參照Z(yǔ)ibaee等的方法，采用底物-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（substrate-SDS-PAGE）對(duì)粗酶液中堿性蛋白酶進(jìn)行分離，略有改動(dòng)。具體操作為：10μl的粗酶液與10μl抑制劑溶液混合，在30℃恒溫箱中孵育60 min后，加入5 μl 5×樣品緩沖液(不含DTT)，離心，取15 μl的上清液加入膠孔（分離膠濃度為12%（w/v），濃縮膠濃度為3.9%（w/v）），利用垂直電泳儀對(duì)樣品進(jìn)行電泳，初始電壓為100 V，待樣品遷移至分離膠界面時(shí)，將電壓調(diào)整至150 V，直至電泳結(jié)束（約120 min）；將膠從膠板上小心取下，放入膠盤中，用純凈水沖洗兩次（每次5 min），將膠置于100 ml 3%casein（pH值8.5，50 mM Tris-HCl）中，4 ℃孵育30 min，用純凈水代替casein溶液，并置于37℃孵育30 min，然后依次用考馬斯亮藍(lán)R-250染液染色60 min，脫色液脫色60 min。待條帶清晰時(shí)，凝膠成像儀拍照。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

本實(shí)驗(yàn)采用Excel對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS17.0進(jìn)行單因素方差分析（One way ANOVA），結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）”表示，顯著性水平設(shè)為0.05。采用繪圖軟件Origin8.5進(jìn)行繪圖。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 總蛋白酶活力和堿性蛋白酶活力

采用Azocasein水解法檢測(cè)三種消化腺（肝胰腺、胃和腸道）總蛋白酶粗提液在不同pH值下的蛋白水解活性，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可以看出，肝胰腺和腸道總蛋白酶活力與pH值關(guān)系呈現(xiàn)典型的單峰型曲線，在pH值8.5時(shí)蛋白酶比活力最高，當(dāng)pH值小于8.5時(shí)，蛋白酶比活力隨著pH值的增加而增加，pH值大于8.5時(shí)，蛋白酶比活力隨著pH值的增大而減小。胃蛋白酶粗提液蛋白酶活力呈現(xiàn)雙峰型曲線，在pH值3.0和pH值8.5時(shí)分別有一條比活力不同的蛋白水解峰，pH值3.0時(shí)蛋白水解峰活力較低，其比活力顯著低于pH值為8.5時(shí)蛋白水解峰。另外，三種消化腺中的消化蛋白酶在堿性條件（pH值7～12）下的蛋白酶比活力顯著大于酸性條件（pH值1～7）下蛋白酶比活力。由此可見(jiàn)，凡納濱對(duì)蝦消化蛋白酶以堿性蛋白酶為主，只有在胃中含有少量酸性蛋白酶，且活性較低。溫度對(duì)不同消化腺蛋白酶比活力的影響見(jiàn)圖2。由圖2可以看出，三種消化腺（肝胰腺、胃和腸道）總蛋白酶均只有一個(gè)蛋白水解峰，在50℃時(shí)蛋白酶比活力最高。當(dāng)溫度低于50℃時(shí)，蛋白酶比活力隨著溫度的升高而增加，溫度高于50℃時(shí)，蛋白酶比活力隨著溫度的降低而減小。

圖1 pH值對(duì)凡納濱對(duì)蝦消化性蛋白酶比活力的影響

圖2 溫度對(duì)凡納濱對(duì)蝦消化性蛋白酶比活力的影響

在最適pH值（pH值8.5）、溫度30℃時(shí)不同消化腺消化蛋白酶比活力對(duì)比如圖3所示，其中肝胰腺、胃和腸道堿性蛋白酶比活力分別為（98.74±3.95）、（89.34±2.75）U/mg和（66.00±2.07）U/mg，顯著性分析表明三組有顯著性差異（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，在三種消化腺中均含有消化性蛋白酶，其中肝胰腺中含量最多，其次是胃，腸道中含量最低。

圖3 不同消化腺中堿性蛋白酶的比活力

2.2 蛋白酶種類的探究

2.2.1 酶抑制劑實(shí)驗(yàn)

為探究不同蛋白酶抑制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦消化腺中消化性蛋白酶的抑制效果，本文用不同特異性蛋白酶抑制劑分別處理蛋白酶粗提液并檢測(cè)酶的剩余活力，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，在肝胰腺、胃和腸道的消化腺蛋白酶中，苯甲基磺酰氟（PMSF）對(duì)三種消化蛋白酶的抑制率最高，分別為（79.43±0.58）%、（71.18±0.18）%和（71.72±1.37）%，其次為大豆胰蛋白酶抑制劑（SBTI）和胃蛋白酶抑制劑（PepstainA），抑制率最低的為碘乙酰胺（IAM），基本沒(méi)有抑制效果或抑制效果很微弱。對(duì)比表1中各特異性蛋白酶抑制劑的靶蛋白酶發(fā)現(xiàn)，PMSF、SBTI的靶蛋白酶是絲氨酸蛋白酶，且對(duì)消化酶的抑制率最高，說(shuō)明絲氨酸類蛋白酶是三種消化腺中主要消化蛋白酶，Pepstatin A的抑制率僅次于PMSF、SBTI，其靶蛋白酶為天門冬氨酸蛋白酶，故消化酶中同樣含有天門冬氨酸類蛋白酶，IAM對(duì)蛋白酶基本無(wú)抑制作用，故消化酶中基本不含有半胱氨酸類蛋白酶。另外，甲苯磺酰-苯丙氨酸氯甲基酮（TPCK）和金屬蛋白酶抑制劑（EDTA）同樣表現(xiàn)出了不同程度的抑制效果，因此消化蛋白酶中可能含有胰凝乳蛋白類酶和金屬蛋白類酶。

2.2.2 酶譜分析（zymogram analysis）

為進(jìn)一步了解凡納濱對(duì)蝦消化腺消化性蛋白酶的種類和特性，分別對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺、胃和腸道的粗酶液進(jìn)行了底物-SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖4（A、B、C）所示。從酶譜圖中清晰顯示出肝胰腺、胃和腸道中至少有8條（泳道1）蛋白水解帶，且不同消化腺中的8條蛋白水解帶的具有相似的分子量，分別為～48.4、～32.5、～26.9、～25.2、～21.6、～19.8、～15.4、～13.6 kDa。對(duì)比8種堿性蛋白酶水解帶的亮度發(fā)現(xiàn)，8種消化蛋白酶均是分子量最小的兩種蛋白酶（～15.4、～13.6 kDa）蛋白水解帶最亮，說(shuō)明這兩種蛋白酶活性最強(qiáng)，這種現(xiàn)象在胃中表現(xiàn)的最為顯著。

表2 不同蛋白酶抑制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦消化腺中蛋白酶的抑制率（%）

分別用六種不同類型特異性蛋白酶抑制劑（SBTI、PMSF、IAM、TPCK、EDTA和Pepstain A）分別處理蛋白酶粗酶液后，進(jìn)行底物-SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖4(泳道2～7)。蛋白酶水解條帶的亮度與蛋白酶活力在一定程度上呈正相關(guān)，水解條帶越亮說(shuō)明蛋白酶活力越強(qiáng)；若在某種蛋白酶抑制劑的作用下，水解條帶變暗，說(shuō)明蛋白酶被該蛋白酶抑制劑所抑制，是該蛋白酶抑制劑的靶蛋白酶，進(jìn)而可判斷該蛋白酶的種類。通過(guò)與空白樣品(泳道1)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在肝胰腺(圖A)、胃(圖B)和腸道(圖 C)蛋白酶的譜圖中，分子量為～48.4 kDa的蛋白酶，對(duì)六種蛋白酶抑制劑均不敏感（水解帶的亮度沒(méi)有明顯變?nèi)趸蛳В?；分子量最?～15.4 kDa和～13.6 kDa)的兩條水解帶完全消失,說(shuō)明這兩種蛋白酶對(duì)SBTI和PepstainA表現(xiàn)出較強(qiáng)的敏感性，同時(shí)這兩條水解帶在PMSF、EDTA作用下，兩條水解帶均亮度減弱，說(shuō)明對(duì)PMSF、EDTA表現(xiàn)出弱敏感性，這兩種蛋白酶活性可以同時(shí)被這三種蛋白酶抑制劑抑制，說(shuō)明這兩種蛋白酶含有多種蛋白酶抑制劑的活性中心，其蛋白酶種類有待進(jìn)一步研究。胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶均屬于絲氨酸蛋白酶，因TPCK是一種特異性很強(qiáng)的胰凝乳蛋白酶抑制劑，能夠被TPCK抑制的絲氨酸蛋白酶則為胰凝乳蛋白酶，不能被TPCK抑制的絲氨酸蛋白酶則為胰蛋白酶。肝胰腺中四種蛋白酶(～26.9、～25.2、～21.6、～19.8 kDa)對(duì)PMSF和TPCK均敏感，四種酶的水解條帶的亮度均有明顯變?nèi)趸蛳?，但?duì)IMA、EDTA和Pepstain A不敏感，表明這四種蛋白酶是絲氨酸類蛋白酶，因?yàn)門PCK是一種特異性很強(qiáng)的胰凝乳蛋白酶抑制劑，故它們是凝乳蛋白類酶；蛋白酶(～32.5 kDa)對(duì) SBTI和 PMSF 均有較強(qiáng)的敏感性，但對(duì)TPCK未表現(xiàn)出敏感性，可能為胰蛋白類酶。胃中蛋白酶粗提液中水解帶的位置分別為～32.5 kDa和～19.8 kDa的兩種蛋白酶被SBTI或PMSF抑制，但未被TPCK抑制，可能為胰蛋白類酶；分子量為～26.9、～25.2、～21.6 kDa的三種蛋白酶酶活在腸道中被PMSF和TPCK抑制，說(shuō)明這三種蛋白酶為胰凝乳類蛋白酶。在腸道中，分子量為～26.9、～25.2、～21.6、～19.8 kDa四種蛋白酶的活性均被PMSF和TPCK抑制，說(shuō)明這四種蛋白酶均為胰凝乳蛋白酶。

圖4 凡納濱對(duì)蝦不同消化腺消化性蛋白酶的底物-SDS-PAGE

3 討論

消化性蛋白酶是蛋白質(zhì)消化的主要參與者和執(zhí)行者，在動(dòng)物的不同消化腺中廣泛存在。因此，消化性蛋白酶的活力和種類的研究對(duì)凡納濱對(duì)蝦的科學(xué)養(yǎng)殖有著重要意義。凡納濱對(duì)蝦不同消化腺蛋白酶活力的最適pH值有所不同，酸性條件時(shí)，只有胃蛋白酶在pH值3.0時(shí)有一定的蛋白酶水解活性，說(shuō)明酸性蛋白酶只在胃中少量存在；在堿性條件時(shí)，肝胰腺、胃和腸道消化蛋白酶均在pH值8.5時(shí)蛋白水解活力出現(xiàn)最高峰（見(jiàn)圖1），說(shuō)明堿性蛋白酶普遍存在于凡納濱對(duì)蝦的肝胰腺、胃和腸道。沈文英等對(duì)南美白對(duì)蝦消化酶活力的研究發(fā)現(xiàn)堿性條件下蛋白酶的活力明顯大于酸性條件下蛋白酶的活力。Maugle等發(fā)現(xiàn)中國(guó)對(duì)蝦在偏堿性環(huán)境下有比較穩(wěn)定的蛋白酶活力，因此，凡納濱對(duì)蝦消化性蛋白酶以堿性蛋白酶為主，且最適pH值為8.5，該結(jié)論與王興強(qiáng)等凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)環(huán)境的最適pH值為7.5～8.5的觀點(diǎn)相符。另外，肝胰腺、胃和腸道消化蛋白酶在溫度50℃時(shí)表現(xiàn)出最高的蛋白水解活性（見(jiàn)圖2），略低于沈文英等對(duì)肝臟（50～65℃）、腸道（55～65℃）、胃（60℃）蛋白酶的最適溫度的研究結(jié)果。本文對(duì)三種消化腺在pH值8.5、30℃時(shí)蛋白酶活力分布進(jìn)行探究，對(duì)比三種消化腺中蛋白酶活力發(fā)現(xiàn)（見(jiàn)圖3），肝胰腺＞胃＞腸道，且差異性顯著（P＜0.05）。劉玉梅等對(duì)中國(guó)對(duì)蝦不同消化腺在堿性條件下蛋白酶酶活進(jìn)行檢測(cè)，得到類似的結(jié)果。說(shuō)明凡納濱對(duì)蝦三種消化腺中均含有消化性蛋白酶，肝胰腺中含量最多，其次是胃，腸道中含量最少。

肝胰腺、胃和腸道是對(duì)蝦最重要的消化器官，胃主要體現(xiàn)在胃磨和腺濾器中，起機(jī)械研磨的作用，肝胰腺是消化酶分泌的主要場(chǎng)所，腸道主要用于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和殘留物的處理。不同消化器官之間并不是完全隔離，相互封閉的，而是通過(guò)各個(gè)消化器官之間的協(xié)同作用共同完成對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。蛋白酶抑制劑可以與蛋白酶的中心的活性基團(tuán)特異性結(jié)合，降低或抑制某種蛋白酶活性的表達(dá)，降低其活性，通過(guò)檢測(cè)蛋白酶的剩余活力評(píng)價(jià)特異性蛋白酶的抑制效果。不同特異性蛋白酶抑制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺、胃和腸道中消化性蛋白酶表現(xiàn)出相似的抑制規(guī)律（見(jiàn)圖3），絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF抑制效果最強(qiáng)，其次為大豆胰蛋白酶抑制劑（SBTI）、胃蛋白酶抑制劑（PepstainA）和甲苯磺酰-苯丙氨酸氯甲基酮（TPCK）、金屬蛋白酶抑制劑（EDTA），碘乙酰胺（IAM）抑制率最低，另外三種消化腺中均含有八種蛋白酶且有著相似的分子量（見(jiàn)圖4），說(shuō)明三種消化腺中有著相同或相似的蛋白酶。結(jié)合各特異性蛋白酶抑制劑所對(duì)應(yīng)的靶蛋白酶得到，三種消化腺中堿性蛋白酶以絲氨酸蛋白酶含量最多，其次為天門冬氨酸類蛋白酶、凝乳蛋白酶和金屬蛋白酶，不含半胱氨酸類蛋白酶。

酶譜分析是目前常用的一種蛋白酶分析分離方法，通過(guò)蛋白質(zhì)或多肽在電場(chǎng)中的遷移率不同反映酶蛋白的大小構(gòu)形以及肽鏈氨基酸的序列變化。為進(jìn)一步了解凡納濱對(duì)蝦堿性蛋白酶的酶學(xué)特性，本文分別對(duì)三種消化腺的堿性蛋白酶進(jìn)行酶譜分析，肝胰腺、胃和腸道堿性蛋白酶粗提液中均至少有八條蛋白水解帶（見(jiàn)圖4），說(shuō)明三種粗酶液中均至少有八種分子量不同的堿性蛋白酶。分子量最大的蛋白酶（～48.4 kDa）對(duì)六種特異性蛋白酶抑制劑均無(wú)敏感性，說(shuō)明該蛋白酶不是六種蛋白酶抑制劑的靶蛋白酶，或是六種蛋白酶抑制劑對(duì)該蛋白酶的抑制效果不在其最適濃度。Madathiparambil等發(fā)現(xiàn)，蛋白酶抑制劑對(duì)不同蛋白酶的抑制效果與蛋白酶抑制劑的濃度有關(guān)。因此，可以嘗試這六種蛋白酶抑制劑的其他濃度或其它類型的特異性蛋白酶抑制劑對(duì)該蛋白酶作進(jìn)一步分析，以確定其蛋白酶種類。除分子量～48.4 kDa的蛋白酶外，其它七種蛋白酶均對(duì)絲氨酸蛋白酶PMSF表現(xiàn)出不同程度的敏感性，因此凡納濱對(duì)蝦堿性蛋白酶以絲氨酸類蛋白酶為主，該研究結(jié)果與Omondi等對(duì)印度白對(duì)蝦及Muhlia-Almazan等對(duì)南美白對(duì)蝦的檢測(cè)結(jié)果相似。三種不同消化腺的七種消化性蛋白酶中，分子量最小的兩種蛋白酶（～15.4 kDa和～13.6 kDa）對(duì)絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF表現(xiàn)出部分抑制以外，還對(duì)金屬蛋白酶及胃蛋白酶表現(xiàn)出一定的敏感性，因此，這兩種蛋白酶不僅含有絲氨酸蛋白酶的活性中心，還可能含有胃蛋白酶、金屬蛋白酶等多種蛋白酶的活性中心，其蛋白酶種類仍需進(jìn)一步探究；肝胰腺消化性蛋白酶中有4種胰凝乳蛋白類酶（～26.9、～25.2、～21.6、～19.8 kDa），一種可能為胰蛋白類酶（～32.5 kDa）；胃中堿性蛋白酶中有三種胰凝乳蛋白類酶（～25.2、～21.6、～19.8 kDa），二種可能為胰蛋白類酶（～32.5 kDa和～19.8 kDa）；腸道中的五種蛋白酶均為胰凝乳蛋白類酶（～32.5，～26.9、～25.2、～21.6、～19.8 kDa）。Muhlia-Almazan 等對(duì)南美白對(duì)蝦中腸提取液研究發(fā)現(xiàn)，中腸提取液中以絲氨酸蛋白酶為主，與本研究結(jié)果相一致，其中含有分子量約為22.0、20.7 kDa和19.4 kDa的三種胰蛋白酶和分子量為30.0 kDa和24.0 kDa的兩種胰凝乳蛋白酶。對(duì)比肝胰腺、胃和腸道消化性蛋白酶中的幾種胰凝乳蛋白酶中發(fā)現(xiàn)：肝胰腺粗酶液中的四種胰凝乳蛋白酶中均對(duì)SBTI沒(méi)有敏感性，胃粗酶液中的三種胰凝乳蛋白酶中分子量為～32.5 kDa的蛋白酶被SBTI抑制，其余兩種蛋白酶沒(méi)有被抑制，腸道蛋白酶粗酶液中的五種胰凝乳蛋白酶對(duì)SBTI均表現(xiàn)出強(qiáng)烈的敏感性，不同消化腺中的胰凝乳蛋白酶對(duì)SBTI表現(xiàn)出不同的敏感性。因此，雖然在不同消化腺中具有相同或相似的分子量，甚至最適pH值和溫度也相同，但并不能完全作為判斷它們是同一種酶的依據(jù)，其它一些酶學(xué)性質(zhì)（氨基酸序列、等電點(diǎn)特異性底物等）仍需進(jìn)一步探究。另外，通過(guò)對(duì)不同蛋白酶種類的研究發(fā)現(xiàn)，三種消化腺中均含有多種消化蛋白酶，因此，在凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖過(guò)程中除了考慮環(huán)境因素外，還需注意餌料種類的多樣化，避免出現(xiàn)因食物種類的單一化可能導(dǎo)致的消化酶分泌異常和消化能力減弱等問(wèn)題。