現(xiàn)代顯微成像技術(shù)綜述

張祥翔

摘要：概述了光學(xué)寬視場(chǎng)顯微鏡、共聚焦顯微鏡、超分辨率顯微鏡中所應(yīng)用的現(xiàn)代顯微成像技術(shù)，對(duì)各種傳統(tǒng)和先進(jìn)的顯微成像原理進(jìn)行了總結(jié)。光學(xué)寬視場(chǎng)顯微鏡最常用的顯微技術(shù)有明場(chǎng)成像、暗場(chǎng)成像、相襯成像、偏光成像、微分干涉（DIC）成像、調(diào)制對(duì)比成像和熒光成像。相襯成像中根據(jù)不同的成像結(jié)構(gòu)還有切趾相襯成像。微分干涉除了傳統(tǒng)的偏振光照明還有圓偏振光照明（CDIC）和專用于塑料的微分干涉（PlasDIC）。共聚焦顯微鏡隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)和制造技術(shù)的發(fā)展而有了巨大的發(fā)展。除了傳統(tǒng)的共聚焦熒光顯微鏡以外，還有連續(xù)反斯托克斯拉曼散射（CARS）共聚焦、多光子共聚焦和白光共聚焦。超分辨率顯微鏡中主要介紹了受激輻射淬滅（STED）技術(shù)和緊隨基態(tài)淬滅顯微技術(shù)的單分子返回（GSDIM）技術(shù)。

關(guān)鍵詞：寬視場(chǎng)顯微鏡； 共聚焦顯微鏡； 超分辨率； 顯微成像技術(shù)

中圖分類號(hào)： O 435 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A doi： 10.3969/j.issn.10055630.2015.06.017

Abstract：The imaging technology in modern microscope for widefield microscope， confocal microscope and superresolution microscope is outlined here. The most frequentlyused technology in the widefield microscope is brightfield， darkfield， phase contrast， polarization， DIC， modulation contrast and fluorescence. In phase contrast， there is also apodized phase contrast. In addition， DIC， CDIC and PlasDIC are also presented. Confocal microscope is developed greatly with the development of computer and manufacture technology. Besides conventional confocal system， the principle of coherent antiStokes Raman scattering（CARS） confocal，multiphoto confocal， white confocal are also explained in detail. As for superresolution microscope， the principle of stimulated emission depletion（STED） and ground state depletion microscopy followed by individual molecule return（GSDIM） are clarified.

Keywords：widefield； confocal； superresolution； microscope imaging technology

引 言

顯微鏡根據(jù)成像方式可以分為光學(xué)寬視場(chǎng)顯微鏡、共聚焦顯微鏡、體視顯微鏡[1]。光學(xué)寬視場(chǎng)顯微鏡和共聚焦顯微鏡更多地應(yīng)用于生命科學(xué)研究，對(duì)成像的要求更高，而體視顯微鏡更多應(yīng)用于工業(yè)領(lǐng)域，對(duì)數(shù)碼化和人性化的要求更高[2]。本文主要闡述用于生命科學(xué)領(lǐng)域的顯微成像技術(shù)，光學(xué)寬視場(chǎng)顯微鏡常用的顯微技術(shù)有明場(chǎng)成像、暗場(chǎng)成像、相襯成像、偏光成像、微分干涉（DIC）成像、調(diào)制對(duì)比成像和熒光成像，共聚焦顯微鏡常用的顯微技術(shù)有熒光、全反射、超分辨、多光子和白光共聚焦成像。

1 光學(xué)寬視場(chǎng)顯微鏡

在光學(xué)寬視場(chǎng)顯微鏡中的各種成像技術(shù)中，明場(chǎng)、暗場(chǎng)、偏光和熒光成像是為了使需要觀察的標(biāo)本結(jié)構(gòu)可見，而相襯、微分干涉、調(diào)制對(duì)比成像是將標(biāo)本結(jié)構(gòu)中的相位變化顯現(xiàn)出來。很多情況下幾種成像技術(shù)同時(shí)使用。

1.1 明場(chǎng)成像和暗場(chǎng)成像

明場(chǎng)成像是最基本的顯微成像技術(shù)，其他所有的成像技術(shù)都是以明場(chǎng)成像為基礎(chǔ)的。明場(chǎng)成像光路如圖1所示，光源通過集光鏡和聚光鏡聚焦到標(biāo)本上，如果是臨界照明，燈絲的像直接會(huì)聚到標(biāo)本；如果是科勒照明，燈絲像會(huì)聚在聚光鏡前焦面，由聚光鏡再照射到標(biāo)本上。透射過標(biāo)本的光線由物鏡收集在物鏡后焦面上形成光瞳的像，光瞳的像是相對(duì)于空間的成像光線角度的分布，現(xiàn)代顯微鏡中多用這個(gè)位置進(jìn)行各種對(duì)比方式的變化。經(jīng)過后焦面后，光線進(jìn)入鏡筒透鏡，鏡筒透鏡將相對(duì)于空間的角度分布變換為相對(duì)于空間的位置分布，即在鏡筒透鏡的后焦面形成中間像面?，F(xiàn)代顯微鏡中，在鏡筒透鏡形成中間像面之前，會(huì)利用Cmount鏡頭轉(zhuǎn)接中間像面到攝像頭上，從而實(shí)現(xiàn)數(shù)碼成像，便于現(xiàn)代教學(xué)和研究。最后中間像面由目鏡成像到眼睛的視網(wǎng)膜上，從而看到放大的像。

暗場(chǎng)成像和明場(chǎng)成像只有照明光路有所區(qū)別。暗場(chǎng)成像是以超出物鏡數(shù)值孔徑的角度照明，標(biāo)本由于大角度照明產(chǎn)生衍射光或者散射光，包含在物鏡數(shù)值孔徑內(nèi)的衍射光或者散射光由物鏡收集，按照明場(chǎng)光路投射到眼睛或者攝像頭。暗場(chǎng)照明如圖2所示，有兩種方式：一種是透射式暗場(chǎng)照明，直接用中間不透光的圓環(huán)在聚光鏡前焦面攔截光線；另一種是反射式暗場(chǎng)照明，暗場(chǎng)反射鏡面安裝在物鏡外殼靠近標(biāo)本的位置，光線經(jīng)過暗場(chǎng)反射鏡面以超出物鏡數(shù)值孔徑的角度入射在標(biāo)本上，標(biāo)本發(fā)出的衍射或者雜散光由物鏡收集后成像。反射式暗場(chǎng)照明鏡面有的是球面，有的是非球面，有的在照明光路中加上微透鏡或者散射片，都是為了實(shí)現(xiàn)大面積均勻照明。

1.2 相襯成像

相襯成像光路如圖3所示。相襯成像是在物鏡后焦面或者后焦面的共軛位置，也就是光線角度相對(duì)于空間分布的位置（光瞳位置），選取某一環(huán)帶的光線，將通過這一環(huán)帶0級(jí)光線強(qiáng)度降低到和1級(jí)衍射光相同，再將0級(jí)光線的相位改變180°，和1級(jí)衍射光的相位相反。這樣當(dāng)光線在光瞳面進(jìn)行相位和強(qiáng)度變換后，鏡筒透鏡將其按照空間位置合成，在中間像面就會(huì)凸顯出由1級(jí)衍射光所表征的結(jié)構(gòu)特征，同時(shí)由于0級(jí)光變?nèi)酰尘皩⒈容^暗。

不同級(jí)次的衍射光在經(jīng)過標(biāo)本（類似光柵的作用）后分開，0級(jí)衍射光經(jīng)過物鏡中的相襯環(huán)后強(qiáng)度和相位發(fā)生了變化，物鏡相襯環(huán)的寬度小于某種特征結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的衍射角對(duì)應(yīng)的寬度，這樣該0級(jí)光對(duì)應(yīng)的1級(jí)衍射光可以保持強(qiáng)度和相位不變。介于這個(gè)角度之間的特征結(jié)構(gòu)，1級(jí)衍射光會(huì)有部分產(chǎn)生強(qiáng)度和相位的變化，在和0級(jí)衍射光合成的時(shí)候就會(huì)產(chǎn)生光暈，而且角度越小，光暈的影響越大，這是相襯成像的缺點(diǎn)。一般會(huì)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)找到一個(gè)合適的相襯環(huán)寬度，光暈和成像細(xì)節(jié)平衡得比較好。

正是由于相襯成像的這種特點(diǎn)，只有某種結(jié)構(gòu)的相位變化可以通過相襯成像反映出來。一般是通過相襯成像較易反映細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，但不易反映細(xì)胞的邊界。其他結(jié)構(gòu)，特別是以上提到的小角度的結(jié)構(gòu)，都或多或少的有一些光暈產(chǎn)生。

Nikon公司采用了切趾相襯成像的方法，將小角度的光線透過率進(jìn)一步降低，小角度的光線對(duì)應(yīng)于大尺寸的結(jié)構(gòu)，也就是非精細(xì)結(jié)構(gòu)的強(qiáng)度降低，同時(shí)大角度的光線對(duì)應(yīng)于小尺寸即精細(xì)結(jié)構(gòu)更容易顯現(xiàn)出來。

1.3 偏光成像

偏光成像顧名思義就是用偏振光進(jìn)行成像。偏光成像分為正交偏振和錐光偏振兩種，光路如圖4所示。正交偏振是指經(jīng)過起偏器的線偏振光經(jīng)過聚光鏡、標(biāo)本、物鏡后，標(biāo)本的偏振特性會(huì)使原來的線偏振光的振動(dòng)方向發(fā)生變化，只有垂直于原來線偏振光振動(dòng)方向的偏振光可以通過后面的驗(yàn)偏器，從而被目鏡接收。正交偏振是直接用目鏡觀察的偏振成像方式。另外一種錐光偏振是指用勃氏鏡和目鏡直接觀察物鏡后焦面的偏振光成像，其余和正交偏光相同。由于觀察的是物鏡后焦面的成像情況，相當(dāng)于觀察的是標(biāo)本面上光線的角度隨空間變化的情況，所以稱之為錐光偏振。錐光偏振一般配合大數(shù)值孔徑的物鏡使用。

偏光成像在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用較少，主要用于地質(zhì)材料科學(xué)研究中。

1.4 微分干涉成像

微分干涉也是將標(biāo)本的相位差轉(zhuǎn)化為振幅變化后進(jìn)行成像，這一點(diǎn)和相襯成像相同。但是微分干涉只對(duì)0級(jí)光進(jìn)行調(diào)制，而相襯成像對(duì)0級(jí)光和1級(jí)光進(jìn)行調(diào)制。

圖5為微分干涉成像光路圖。在明場(chǎng)成像的基礎(chǔ)上，聚光鏡前焦面上放置起偏器和渥拉斯頓棱鏡。線偏振光被分為尋常光o光和非尋常光e光，它們的振動(dòng)方向成90°。o光和e光在標(biāo)本上通過聚光鏡會(huì)聚，標(biāo)本的雙折射性能或者相位偏差會(huì)對(duì)o光和e光的相對(duì)振動(dòng)方向產(chǎn)生影響，也就是o光和e光不再是相互90°的振動(dòng)方向，或者o光或者e光有了微小的相位差。標(biāo)本的相位信息帶入光路中，再通過第二塊渥拉斯頓棱鏡，使o光和e光具有相同的振動(dòng)方向，這樣帶有相位差的o光或者e光就會(huì)進(jìn)行干涉，相位的變化則轉(zhuǎn)換為振幅的變化。但是有一些光由于振動(dòng)方向的變化在經(jīng)過第二塊渥拉斯頓棱鏡后沒有干涉，變成雜散光，于是就需要驗(yàn)偏器選擇進(jìn)行干涉，而且垂直于入射光偏振方向的光進(jìn)入鏡筒透鏡和目鏡。實(shí)際應(yīng)用中渥拉斯頓棱鏡都換為諾瑪斯基棱鏡，可以保證合適的工作距離。

由于o光和e光是渥拉斯頓棱鏡分出的兩束不同位置的光，也就是o光和e光都會(huì)分別成像，它們由第二塊渥拉斯頓棱鏡合成的時(shí)候，由于棱鏡的位移作用，所成的像會(huì)在X和Y向有所位移，產(chǎn)生浮雕的效果。故如果調(diào)解渥拉斯頓棱鏡的相對(duì)位置，則可調(diào)解浮雕效果。

微分干涉先是微分然后是干涉，先把相位變成了相位的變化（即相位差），再將相位差通過干涉變成振幅變化，而相襯成像中直接把反應(yīng)結(jié)構(gòu)的相位通過降低背景光的方法顯現(xiàn)出來（本質(zhì)上也是干涉）。因此微分干涉容易將細(xì)胞的邊界顯現(xiàn)出來，因?yàn)檫吔缟蠈?duì)o光和e光的相位變化較大，而內(nèi)部的連續(xù)介質(zhì)對(duì)o光和e光的相位變化就較小。但是相襯成像直接將相位顯現(xiàn)出來，所以通常是內(nèi)部的精細(xì)結(jié)構(gòu)具有更大的相位角，更容易通過相襯方法顯現(xiàn)出來。

微分干涉對(duì)相位差的依賴既是其優(yōu)點(diǎn)，也是其缺點(diǎn)。特別是在線偏振光情況下，只有和偏振方向相同的相位差才能顯現(xiàn)。Zeiss采用圓偏振光（CDIC）[3]后，各個(gè)方向的相位差都有所顯現(xiàn)，較好地平衡微分干涉和偏振。

普通微分干涉還需要特殊的物鏡，只能在很小的焦深內(nèi)實(shí)現(xiàn)較好的微分干涉的效果，并且只適用于培養(yǎng)皿為塑料的標(biāo)本。這些都對(duì)微分干涉的應(yīng)用產(chǎn)生了限制。Zeiss在專利DE 10219804和文獻(xiàn)[2]中提供了一種PlasDIC的微分干涉方式[4]，而且已經(jīng)成功商用。只需要一個(gè)偏振片和渥拉斯頓棱鏡就可以實(shí)現(xiàn)DIC效果。而且只需要普通物鏡，培養(yǎng)皿為塑料的標(biāo)本也適用。但是在聚光鏡前必須使用狹縫，物鏡數(shù)值孔徑也不能過大，因此僅小于40X物鏡可用。僅有的一對(duì)渥拉斯頓棱鏡和驗(yàn)偏器放在物鏡和鏡筒透鏡之間，非偏振光只有在經(jīng)過物鏡和該渥拉斯頓棱鏡之后才變成偏振光并分為o光和e光，由于是平行于渥拉斯頓棱鏡的狹縫照明產(chǎn)生的光，所以這里的o光和e光也是相差90的振動(dòng)方向。同時(shí)由于o光和e光已經(jīng)經(jīng)過了標(biāo)本，出現(xiàn)了相位差，所以在驗(yàn)偏器使o光和e光在同一振動(dòng)方向時(shí)，就發(fā)生了干涉，產(chǎn)生了相對(duì)于相位變化的振幅變化。

1.5 調(diào)制對(duì)比成像

調(diào)制對(duì)比光路見圖6，調(diào)制對(duì)比成像也是在物鏡后焦面或者后焦面的共軛面上，對(duì)傾斜入射的狹縫光，使其+1級(jí)衍射光的強(qiáng)度大于背景光，-1級(jí)衍射光的強(qiáng)度小于背景光，這樣就形成浮雕效果。調(diào)制對(duì)比成像也可以配合起偏器和驗(yàn)偏器，通過旋轉(zhuǎn)起偏器來調(diào)解浮雕效果。調(diào)制對(duì)比成像適用于各向同性和各向非同性的標(biāo)本，而微分干涉僅適用于各向同性的標(biāo)本。

調(diào)制對(duì)比和相襯成像類似都是利用的1級(jí)或者-1級(jí)光進(jìn)行調(diào)整，相對(duì)于DIC利用0級(jí)光的能量降低很多，因此調(diào)制對(duì)比成像的效果不如DIC，但是由于其對(duì)物鏡的要求低、不需要復(fù)雜的棱鏡、適用范圍廣，還是受到了廣泛的歡迎。

1.6 熒光成像

熒光成像是在落射光照明下的成像技術(shù)。光源通常為汞燈或者LED。熒光成像很多情況下標(biāo)本必須用多種熒光染色劑進(jìn)行染色（也有自發(fā)熒光物質(zhì)，但是自發(fā)熒光能量較弱），不同的熒光染色劑會(huì)附著在細(xì)胞中需要觀察的不同結(jié)構(gòu)上。不同的熒光染色劑在不同波長(zhǎng)的光的激發(fā)下會(huì)產(chǎn)生不同波長(zhǎng)的熒光，這樣被附著的各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)就會(huì)被觀察到。通常會(huì)用多種波長(zhǎng)的光進(jìn)行激發(fā)，從而得到多種波長(zhǎng)的熒光圖像，然后再進(jìn)行圖像綜合，這樣就可以得到多種顏色的標(biāo)本圖像。熒光成像中最重要的元件就是激發(fā)濾光片和截止濾光片。

圖7（a）為普通熒光成像。熒光光源汞燈或者LED通過落射照明光路由分光棱鏡入射到物鏡中，并激發(fā)標(biāo)本產(chǎn)生熒光，返回到物鏡中，通過鏡筒透鏡成像。入射到物鏡的光會(huì)被激發(fā)濾光片濾出一定波長(zhǎng)的激發(fā)光，被激發(fā)光激發(fā)的熒光染色劑會(huì)產(chǎn)生不同波段的熒光，由截止濾光片將其他波段的光截止，最終激發(fā)出的熒光到達(dá)鏡筒透鏡。由于激發(fā)光和被激發(fā)熒光之間的波長(zhǎng)差，使得截止濾光片可以選出被激發(fā)熒光，同時(shí)截止激發(fā)光。

熒光成像由于被激發(fā)的熒光來自不同的焦面位置，特別是對(duì)厚標(biāo)本，使得真正焦面上圖像的對(duì)比度會(huì)有所下降。全反射熒光技術(shù)利用全反射光透過介質(zhì)的倏逝波照明，倏逝波只滲透進(jìn)標(biāo)本100 nm，可以有效地防止不在焦面的被激發(fā)熒光對(duì)圖像對(duì)比度的影響。全反射熒光如圖7（b）所示，其技術(shù)要求物鏡數(shù)值孔徑在1.45以上，而且只能對(duì)粘附性標(biāo)本成像，否則倏逝波無法照射。

熒光成像在共聚焦顯微鏡和超分辨率顯微鏡中也得到廣泛的應(yīng)用。

2 共聚焦顯微鏡[5]

共聚焦顯微鏡是為了減少在焦點(diǎn)之外的光暈，僅僅對(duì)衍射極限尺寸的點(diǎn)照明進(jìn)而成像。共聚焦顯微原理早在20世紀(jì)50年代早期就發(fā)明出來了，但是由于激光技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、數(shù)碼成像算法的制約，直到1987年才出現(xiàn)了第一臺(tái)商用共聚焦顯微鏡。到20世紀(jì)90年代以后，大容量存儲(chǔ)技術(shù)、顯示增強(qiáng)技術(shù)、計(jì)算機(jī)處理技術(shù)的發(fā)展給共聚焦顯微鏡帶來更廣闊的應(yīng)用。

2.1 熒光共聚焦成像

共聚焦主要應(yīng)用在熒光共聚焦成像上。

所謂共聚焦就是發(fā)射光源點(diǎn)、焦面上物點(diǎn)和探測(cè)器成像像點(diǎn)共同被聚焦。共聚焦顯微鏡光路見圖8。連續(xù)激光光源通過小孔光闌，由分光鏡會(huì)聚樣本上，分光鏡在X和Y向移動(dòng)掃描標(biāo)本上的點(diǎn)，被照射的標(biāo)本激發(fā)出熒光會(huì)聚到探測(cè)器上。在物鏡成像焦面的上下同樣會(huì)有很多激發(fā)熒光產(chǎn)生，這些熒光和探測(cè)器上的成像點(diǎn)不共聚焦，這部分不共聚焦的熒光只有一小部分可以通過探測(cè)器前小孔光闌，所以大部分不共聚焦的熒光沒有被成像。傳統(tǒng)的熒光照明中，整個(gè)標(biāo)本都被照明，這樣焦面上下產(chǎn)生的熒光就會(huì)被探測(cè)到，降低了焦面圖像的對(duì)比度。

共聚焦顯微鏡中的激光光源經(jīng)過擴(kuò)束后，必須準(zhǔn)確地照射到物鏡的后焦面，這是共聚焦顯微鏡最嚴(yán)格的要求之一，目的是為了保證照明的均勻和遠(yuǎn)心。探測(cè)器前的小孔光闌作為空間濾波器，其位置必須和物鏡焦面的位置完美共軛，這樣可以保證焦面的激發(fā)熒光被探測(cè)器準(zhǔn)確接收。小孔光闌有多種尺寸可選，是為了適應(yīng)不同數(shù)值孔徑的物鏡衍射極限的要求。

共聚焦顯微鏡的分光鏡掃描系統(tǒng)是其關(guān)鍵而復(fù)雜的組件之一。其掃描速度和精度直接影響共聚焦成像的效率和像質(zhì)。分光鏡掃描系統(tǒng)不僅起到轉(zhuǎn)折光線的作用，而且需要使聚焦點(diǎn)在X和Y向進(jìn)行掃描，并且在掃描過程中物鏡的光瞳必須準(zhǔn)確被照明。掃描標(biāo)本的原理是在標(biāo)本的后焦面或者后焦面的共軛面上轉(zhuǎn)動(dòng)反光鏡的角度實(shí)現(xiàn)成像點(diǎn)在標(biāo)本上的二維平移。后焦面上角度的變化對(duì)應(yīng)于成像面上位移的變化?，F(xiàn)在商用的共聚焦顯微鏡中至少有三種掃描裝置如圖9所示。Olympus采用的是中繼透鏡加兩個(gè)掃描鏡的方式，Zeiss采用的是兩個(gè)緊挨的掃描鏡旋轉(zhuǎn)的方式，Leica采用的是一個(gè)掃描鏡二維旋轉(zhuǎn)的方式。以上為串行掃描，速度較慢，有一種采用Nipkow盤配合微透鏡的并行掃描方式，在圓盤上刻有很多小孔，可以同時(shí)掃描多個(gè)成像點(diǎn)，速度大幅提高，但是能量損失較大，商用受限。

共聚焦顯微鏡是不能像普通光學(xué)寬視場(chǎng)顯微鏡一樣從目鏡觀察標(biāo)本。其通過對(duì)多點(diǎn)掃描所得到的圖像進(jìn)行重構(gòu)，然后利用計(jì)算機(jī)完成圖像顯現(xiàn)。所以要求很大的圖像存儲(chǔ)空間和復(fù)雜的計(jì)算機(jī)圖像處理技術(shù)。

2.2 白光共聚焦成像

普通的熒光共聚焦成像需要用到3～5種熒光染色劑來同時(shí)探測(cè)。不同的熒光染色劑對(duì)激發(fā)光和發(fā)射光都有不同的要求，也就是要有不同光譜的光源。普通顯微鏡中采用變換濾光片的方法得到不同波段的光源，但是濾光片的機(jī)械式轉(zhuǎn)換速度較慢，還可能帶來像面偏移，而且濾光片受到潮濕、高溫、高能量照射的環(huán)境下，還可能改變?yōu)V出的波長(zhǎng)。白光共聚焦技術(shù)就是是利用聲光器件的可調(diào)光譜技術(shù)，波長(zhǎng)和強(qiáng)度都可調(diào)，幾乎可以克服普通濾光片的所有缺點(diǎn)。

白光共聚焦技術(shù)中的關(guān)鍵器件之一是切換不同光譜的聲光器件，聲光器件是一種特殊的雙折射晶體，通過對(duì)加載在晶體上的聲音頻率的控制，可以改變晶體的衍射性能，從而實(shí)現(xiàn)快速的變換波長(zhǎng)。

顯微鏡中用到的聲光器件是在二氧化碲或者石英晶體上粘接一塊壓電傳感器。當(dāng)無線電頻率施加在壓電傳感器上時(shí)，壓電傳感器產(chǎn)生高頻聲波，該高頻聲波在二氧化碲或石英晶體中會(huì)引起材料折射率的周期分布。改變壓電傳感器加在晶體上的頻率可以改變折射率變化的周期分布。根據(jù)聲光晶體的相位匹配條件，出射光的波長(zhǎng)由下式?jīng)Q定

現(xiàn)代顯微鏡中的聲光器件是非共線系統(tǒng)，并且是各項(xiàng)異性的晶體，具體如圖10所示。非共線系統(tǒng)相對(duì)于共線系統(tǒng)可以使非極化光情況下入射光和出射的1級(jí)衍射光分開一定的角度，這樣就不需要起偏器。而各項(xiàng)異性晶體相對(duì)于各向同性晶體，在入射光孔徑較大時(shí)仍可以保持較窄的光譜帶寬。一定帶寬的照明是熒光激發(fā)的必要條件之一，所以用各向同性晶體就需要準(zhǔn)直光，而用各向異性晶體則不需要。

聲光器件在白光共聚焦系統(tǒng)中的應(yīng)用如圖11所示。三種激光光源通過分色片耦合進(jìn)入聲光濾光器。氦鎘激光器，氬離子激光器和氬氪激光器通過分色片將422 nm、458 nm、476 nm、488 nm、514 nm、568 nm和648 nm共同入射進(jìn)聲光器件，聲光器件通過調(diào)節(jié)無線電頻率調(diào)節(jié)輸出光的波長(zhǎng)。聲光器件輸出的0級(jí)光被光陷阱吸收，而1級(jí)衍射光由光纖導(dǎo)出照亮樣本。

2.3 多光子共聚焦成像[6]

普通共聚焦顯微鏡中，由于標(biāo)本受到連續(xù)激光直接照射，細(xì)胞結(jié)構(gòu)可能受損，特別是很多需要紫外光激發(fā)的熒光，對(duì)標(biāo)本的損傷更大。多光子共聚焦技術(shù)通過用長(zhǎng)波長(zhǎng)光子激發(fā)標(biāo)本，而長(zhǎng)波長(zhǎng)光子的能量比短波長(zhǎng)光子低，這樣可以減少對(duì)標(biāo)本的損傷。

將共聚焦顯微鏡中的普通連續(xù)激光光源換成長(zhǎng)波長(zhǎng)的脈沖光源，比如用700 nm的脈沖光源替代350 nm連續(xù)激光光源，這樣標(biāo)本需要吸收兩個(gè)光子才能達(dá)到同等350 nm光源所產(chǎn)生的能量，也就是在標(biāo)本中700 nm光子的能量密度大。而在連續(xù)光源系統(tǒng)中，激光激發(fā)的幾率和光子密度成線性關(guān)系；在兩個(gè)光子的系統(tǒng)中，熒光激發(fā)的幾率和光子密度成平方關(guān)系，也就是說在標(biāo)本的焦面以外，兩個(gè)光子的系統(tǒng)比連續(xù)光源的系統(tǒng)，光子密度下降的更快。這樣兩個(gè)光子的系統(tǒng)對(duì)焦面以外的熒光激發(fā)所帶來的雜光有更好的抑制作用，得到圖像的對(duì)比度更好。

多光子共聚焦顯微鏡還要配備一個(gè)色散補(bǔ)償器，如圖12所示，這是因?yàn)楣鈱W(xué)系統(tǒng)中的光學(xué)元件（如衰減片、棱鏡、透鏡等）對(duì)光波有色散作用。一定頻率的脈沖光源進(jìn)入光學(xué)系統(tǒng)后會(huì)被展寬，能量降低，熒光激發(fā)效果變差，這個(gè)色散補(bǔ)償器通過對(duì)光學(xué)元件色散的補(bǔ)償使得最終入射到標(biāo)本上的激光脈沖和光源處的盡量一致。

色散補(bǔ)償器[7]可以用鍍膜反射鏡套件來實(shí)現(xiàn)。當(dāng)激光脈沖由不同波長(zhǎng)組成時(shí)，在其通過光學(xué)系統(tǒng)的玻璃器件時(shí)，這些介質(zhì)的折射率的非線性波長(zhǎng)相關(guān)性，引起了脈沖展寬，對(duì)于典型的光學(xué)玻璃，波長(zhǎng)越短，折射率越高，導(dǎo)致短波比長(zhǎng)波的傳播速度慢。通過優(yōu)化反射鏡套件的鍍膜，可以使長(zhǎng)波比短波的群速度延遲的更多，從而使長(zhǎng)波和短波具有相同的速度。光波在經(jīng)過光學(xué)膜系反射后的群延遲色散為

式中：φr為反射相位；ω為光波頻率。反射相位和膜層厚度、折射率和光束入射角相關(guān)，因此通過優(yōu)化膜系，選擇合適的膜層厚度、折射率和光束入射角，就可以得到需要的補(bǔ)償色散。

當(dāng)然色散補(bǔ)償器還可以用光柵或者棱鏡實(shí)現(xiàn)，但是棱鏡補(bǔ)償色散會(huì)引入高階色散，光柵補(bǔ)償色散會(huì)引起較大損耗，結(jié)構(gòu)不能做的很緊湊。

2.4 CARS共聚焦成像[8]

不管是熒光共聚焦還是多光子共聚焦都需要對(duì)標(biāo)本進(jìn)行熒光染色或者標(biāo)記，這都會(huì)對(duì)標(biāo)本產(chǎn)生影響。而連續(xù)反斯托克斯拉曼散射（CARS）共聚焦成像技術(shù)，通過放大標(biāo)本的拉曼散射光譜并使其成像，不需要進(jìn)行熒光染色或者標(biāo)記，對(duì)標(biāo)本有較好的保護(hù)。

CARS共聚焦成像和普通共聚焦成像的區(qū)別主要是激光光源。CARS共聚焦成像原理見圖13，使用一束近紅外連續(xù)激光和一束斯托克斯激光同時(shí)照射標(biāo)本，受到近紅外激光激發(fā)的分子躍遷到第一虛擬激發(fā)態(tài)上，然后立即返回到斯托克斯激光所代表的低能量振動(dòng)能級(jí)上。調(diào)節(jié)近紅外連續(xù)激光的波長(zhǎng)，可以得到不同的低能量振動(dòng)能級(jí)，但是都比斯托克斯振動(dòng)能級(jí)能量高。這些低能量的振動(dòng)能級(jí)帶有標(biāo)本化學(xué)信息，為了能對(duì)這些不同的低能量振動(dòng)能級(jí)分子成像，將標(biāo)本用取樣光束照明（取樣光束可以和用于激發(fā)的近紅外連續(xù)激光相同），那些在低能量振動(dòng)能級(jí)上的分子又會(huì)躍遷到新的虛擬激發(fā)態(tài)上，由于連續(xù)照射低能量振動(dòng)態(tài)能級(jí)已滿，新躍遷的分子直接返回基態(tài)，釋放能量發(fā)射光子，由于該光子的能量較激發(fā)用的近紅外連續(xù)激光高，所以發(fā)出的光譜會(huì)往短波移動(dòng)，這就是反斯托克斯光譜。由于連續(xù)激發(fā)，CARS信號(hào)比傳統(tǒng)拉曼散射信號(hào)強(qiáng)10萬倍，足以成像。

3 超分辨顯微成像

以上所有的顯微成像方法都受到衍射極限的限制。但是超分辨顯微成像從分子級(jí)別上改變成像原理，突破了衍射極限。下面介紹兩種超分辨顯微成像，即受激輻射淬滅（STED）和緊隨基態(tài)淬滅顯微技術(shù)的單分子返回（GSDIM）。

3.1 STED[9]

STED成像原理見圖14。標(biāo)本受到第一束激光激發(fā)產(chǎn)生熒光，形成具有衍射極限的圓斑，這個(gè)位置同時(shí)被第二束發(fā)散角為圓環(huán)的激光激發(fā)，第二束激光正好可以激發(fā)同一照射位置所形成光斑的非中心區(qū)域，產(chǎn)生不能夠被探測(cè)器收集的光波，而光斑的中心區(qū)域由于非中心區(qū)域的侵占，直徑可以變得無限小，這樣就突破了瑞利衍射極限。

3.2 GSDIM[10]

瑞利衍射極限的物理解釋為：電子從激發(fā)態(tài)到基態(tài)的躍遷大約為納秒的量級(jí)，而探測(cè)器的響應(yīng)時(shí)間一般為毫秒量級(jí)，所以所有不同時(shí)間發(fā)出的熒光都會(huì)被探測(cè)器接收并顯示，而且不同時(shí)間發(fā)出的熒光的位置會(huì)略有不同，這就造成了成像斑點(diǎn)的展寬，也就是衍射極限的由來。也就是說如果探測(cè)器能夠記錄某一時(shí)間發(fā)射的熒光，而不是所有不同時(shí)間的，那么光斑就會(huì)很窄，衍射極限就會(huì)被突破。

GSDIM成像原理見圖15。通常情況下，激光能量越大，發(fā)射的熒光也應(yīng)該越大，但是達(dá)到一定極限后，熒光的能量反而減少。這是因?yàn)闊晒饽芰亢图ぐl(fā)光源的能量成線性變化時(shí)，電子是在第1激發(fā)態(tài)和基態(tài)之間躍遷。但是如果三重態(tài)上反轉(zhuǎn)自旋的電子足夠多，導(dǎo)致第1激發(fā)態(tài)和基態(tài)上幾乎沒有電子，熒光能量就會(huì)隨著激發(fā)能量增大而減少。如果激發(fā)能量進(jìn)一步增大，基態(tài)上僅有的幾個(gè)電子在吸收激發(fā)光后會(huì)在基態(tài)和第1激發(fā)態(tài)上躍遷幾千次，這樣就會(huì)產(chǎn)生很高能量的受激熒光，即光子爆發(fā)。光子爆發(fā)就是某一時(shí)間發(fā)射的熒光的增強(qiáng)，其他不同時(shí)間的應(yīng)該發(fā)出的熒光進(jìn)入了三重態(tài)不在發(fā)光，也就是說由該增強(qiáng)的熒光形成的光斑突破了衍射極限。

為了增大從三重態(tài)上躍遷到基態(tài)的電子數(shù)目，從而加快光子爆發(fā)的時(shí)間，還可以用第二束激光（405 nm）照射標(biāo)本。在GSDIM技術(shù)中，強(qiáng)激發(fā)光源被反復(fù)開關(guān)，這樣產(chǎn)生三重態(tài)發(fā)出增加熒光的位置就是隨機(jī)的，通過記錄這些光點(diǎn)的位置，就可以重構(gòu)標(biāo)本的GSDIM圖像。

如果在GSDIM光路中加入柱面鏡[11]，就可以形成三維圖像。柱面鏡可以根據(jù)三維圖像中的成像位置控制成像光點(diǎn)的PSF，然后通過計(jì)算機(jī)重建出模擬的三維圖像。

GSDIM既可以在共聚焦顯微鏡中使用也可以在寬視場(chǎng)顯微鏡中使用。

4 總 結(jié)

現(xiàn)代顯微鏡中以寬視場(chǎng)光學(xué)顯微鏡明場(chǎng)成像技術(shù)為基礎(chǔ)，衍生出很多對(duì)比度增強(qiáng)基礎(chǔ)（比如相襯、DIC、調(diào)制對(duì)比、暗場(chǎng)、偏光），而共聚焦技術(shù)將焦面上的物點(diǎn)準(zhǔn)確成像，本質(zhì)上也是一種對(duì)比度增加技術(shù)。這些技術(shù)都受到了衍射極限的限制。超分辨率技術(shù)從分子層面突破了衍射極限，通過激發(fā)光來調(diào)整熒光物質(zhì)的發(fā)光特性，從而縮小了發(fā)光點(diǎn)的發(fā)光面積。

參考文獻(xiàn)：

[1]王莉，蔣洪，孫麗麗.顯微鏡的發(fā)展綜述[J].科技信息，2009（11）：117118，133.

[2]袁望.面向體式顯微鏡的立體圖像處理方法[D].寧波：寧波大學(xué)，2012.

[3]DANZ R，GRETSCHER P.CDIC：a new microscopy method for rational study of phase structures in incident light arrangement[J].Thin Solid Films，2004，462/463：257262.

[4]DANZ R，VOGELGSANG A，KTHNER R，et al.PlasDICeine nützliche modifikation des differentiellen interferenzkontrastes nach Smith/Nomarski in DurchlichtAnordnung[J].Photonik，2004（1）：4246.

[5]WEBB R H.Confocal optical microscopy[J].Reports on Progress in Physics，1996，59（3）：427471.

[6]ZIPFEL W R，WILLIAMS R M，WEBB W W.Nonlinear magic：multiphoton microscopy in the biosciences[J].Nature Biotechnology，2003，21（11）：13691377.

[7]羅震岳.光學(xué)色散補(bǔ)償薄膜的研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2010.

[8]DOWNES A，MOURAS R，ELFICK A.A versatile CARS microscope for biological imaging[J].Journal of Raman Spectroscopy，2009，40（7）：757762.

[9]PUNGE A，RIZZOLI S O，JAHN R，et al.3D reconstruction of highresolution STED microscope images[J].Microscopy Research and Technique，2008，71（9）：644650.

[10]DYBA M，SIMONUTTI G A，F(xiàn)LLING J.Recent developments in GSDIM microscopy[J].SPIE，2012，8228：82280R.

[11]ZHANG X W，HUANG B，BAIES W M.Subdfiffraction limit image resolution in three dimensions：US，US 20110002530A1[P].20081209.

（編輯：程愛婕）