輻照對中華絨螯蟹過敏蛋白生化特性的影響

廖濤+楊鍇+耿勝榮+熊光權(quán)+陳玉霞+李新+鉏曉艷+白嬋+程薇

摘要：為研究輻照脫除中華絨螯蟹過敏性的效果，對中華絨螯蟹的過敏原粗提液輻照0～45 kGy后進(jìn)行SDS-PAGE、熒光光譜、紫外光譜分析和免疫印跡鑒定，研究輻照對過敏蛋白濃度、濁度、疏水性、免疫原性的影響。結(jié)果表明，與未輻照的中華絨螯蟹過敏原相比，輻照后蛋白濃度降低，濁度增高，從3 kGy時濁度的變化與蛋白濃度變化呈正相關(guān)，隨蛋白濃度增高或降低，濁度也逐漸增加或減少。從低劑量到高劑量輻照時，疏水性逐漸增強(qiáng)，到20 kGy時疏水性達(dá)到最大值，然后隨著輻照劑量的增加疏水性降低。低劑量輻照時過敏蛋白的濃度變化不大，到20 kGy時，過敏蛋白含量明顯降低;45 kGy時，過敏蛋白基本被完全降解。免疫印跡試驗結(jié)果表明，過敏蛋白的免疫原性隨著輻照劑量的增加而降低。

關(guān)鍵詞：中華絨螯蟹;過敏原;輻照;生化特性

中圖分類號：S981.22 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2015）23-5973-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.23.046

Effects of Irradiation on Bio-chemistry Properties of Allergen in Chinese Mitten Crab

LIAO Tao，YANG Kai，GENG Sheng-rong，XIONG Guang-quan，CHEN Yu-xia，LI Xin，

ZU Xiao-yan，BAI Chan， CHENG Wei

（ Institute of Agro-Products Processing and Nuclear-Agricultural Technology，Hubei Academy of Agricultural Sciences/Hubei Engineering Research Center for Farm Products Irradiation，Wuhan 430064，China）

Abstract： The effects of irradiation reducing allergenicity of Chinese Mitten Crab （Eriocheir Sinensis） were studied by SDS-PAGE， Fluorescence Spectrum， Ultraviolet Spectrum technology and Western-Blotting were used to analyze the change of allergy protein concentration， turbidity， surface hydrophobicity and immunogenicity after irradiated among 0～45 kGy dosage. The results showed that protein concentrations decreased compared with the unirradiated Chinese mitten crab allergen， turbidity changes were positively related to protein concentrations， and turbidity also gradually increased or decreased when the protein concentrations increased or decreased. From low dose to high dose irradiation， the surface hydrophobicity gradually increased and reached the maximum value at 20 kGy， however surface hydrophobicity reduced from 20～ 45 kGy. The electrophoretogram of SDS-PAGE showed that allergic protein concentration had a slight change at low dose irradiation， siginificantly decreased at 20 kGy， and the allergic protein was completely degraded when the dose reached 45 kGy. The results of Western-Blotting indicated that allergic protein immunogenicity reduced with the increase of irradiation dose.

Key words：Chinese mitten crab; allergen; irradiation; bio-chemistry properties

食物過敏，也稱為食物變態(tài)反應(yīng)、消化系統(tǒng)變態(tài)反應(yīng)、過敏性胃腸炎等，是由于進(jìn)食某種食物后造成的不良反應(yīng)，有嘔吐、腹瀉及皮膚起皰等癥狀，嚴(yán)重的食物過敏能引起窒息、急性哮喘、過敏性休克甚至死亡。在聯(lián)合國糧農(nóng)組織提出的八大類易過敏食物中，蝦蟹等甲殼類水產(chǎn)品是最重要的一類[1-3]。中華絨螯蟹又稱河蟹、毛蟹、清水蟹、大閘蟹或螃蟹，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，是一種經(jīng)濟(jì)蟹類，是中國傳統(tǒng)的名貴水產(chǎn)品之一。隨著消費人群的擴(kuò)大，隨之而來的蟹類過敏報道屢見不鮮[4-7]。

食品輻照是20世紀(jì)發(fā)展起來的一種專門用于食品類的滅菌保鮮技術(shù)，輻照可使蛋白質(zhì)等生物大分子發(fā)生解聚、交聯(lián)、裂解以及空間結(jié)構(gòu)、構(gòu)象的改變。繼而抗原決定簇遭到破壞，過敏蛋白原有免疫原性喪失。機(jī)體的免疫細(xì)胞接收不到足夠的生物信息或無法識別抗原分子不能引發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答，從而免疫發(fā)生過敏反應(yīng)引起疾病[8]。目前，輻照脫敏在蝦[9-11]、花生[12，13]、紅豆[14]等過敏食品上開展了大量研究，認(rèn)為輻照改變了蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)分子展開，疏水基團(tuán)暴露，形成多聚體，從而抗原性下降[15]。但有關(guān)中華絨螯蟹過敏原組成及輻照脫敏效果鮮見報道。因此，研究輻照降低中華絨螯蟹過敏原過敏性對保護(hù)消費者食品安全有著積極的意義。endprint

本試驗對中華絨螯蟹組織蛋白中引起食物過敏癥的主要過敏原進(jìn)行初步提取和免疫學(xué)活性分析，并對其進(jìn)行輻照處理，從而觀察其物理化學(xué)性質(zhì)的變化，為進(jìn)一步研制蟹類食物過敏癥的檢測試劑和脫敏制劑提供依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗材料與試劑

鮮活的中華絨螯蟹在中百倉儲購買，蟹過敏患者特異性血清由同濟(jì)醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科提供。

主要試劑：丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉、甘氨酸、N，N，N′，N′-四甲基二乙胺、酶標(biāo)二抗、牛血清蛋白、8-苯氨基-1-萘磺酸（ANS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）、溴酚蘭、考馬斯亮蘭R-250、考馬斯亮藍(lán)G-250、巰基乙醇、麗春紅等，均為分析純及生物純。

1.2 ?試驗儀器

儀器：鈷-60輻射源（裝源量30萬居里），湖北輻照實驗中心;熒光分光光度計（F93），上海棱光技術(shù)有限公司;熒光檢測器（RF-20A）、紫外分光光度計（TU-1810PC），北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;電泳儀（DYY-6C型、DYCZ-24D型）、轉(zhuǎn)移芯（DYCZ-40D型），均為北京市六一儀器廠產(chǎn)品;高速冷凍離心機(jī)（SPX-Ⅱ），湖南湘儀離心機(jī)儀器公司。

1.3 ?樣品處理

1.3.1 ?蟹肉粗提液的制備 ?根據(jù)參考文獻(xiàn)[16]進(jìn)行蟹肉粗提液制備，略有改進(jìn)。中華絨螯蟹去殼取肌肉，稱取一定量的肌肉，剁碎，置于干凈燒杯中，加入4倍體積的冷丙酮（-20 ℃預(yù)冷過夜），攪拌1 min，置于4 ℃冰箱中靜置30 min，棄去丙酮，再加入4倍體積的冷丙酮，攪拌1 min，置于4 ℃冰箱中靜置30 min，棄去丙酮，再重復(fù)丙酮操作一次，棄去丙酮后，將燒杯置于通風(fēng)處使丙酮揮發(fā)，待丙酮揮發(fā)完后，加入2倍體積的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液，攪拌30 min后，置于4 ℃冰箱中過夜。第二天將其取出，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，上清液即為蛋白粗提液。

1.3.2 ?輻照處理 ?取27個10 mL透明塑料離心管，每管裝6 mL蛋白粗提液，每3個一組，分為9組，進(jìn)行室溫輻照，輻照劑量為0、3、6、9、12、15、20、30、45 kGy，對其進(jìn)行編號，編號與輻照劑量相同。實際吸收劑量以硫酸亞鐵劑量來跟蹤，分別編號。

1.4 ?測定方法

1.4.1 ?輻照后中華絨螯蟹過敏蛋白濃度、濁度變化 ?參照顧可飛等[17]的操作方法略作改進(jìn)。濁度測定：輻照后各管吸取20 μL溶液，加入裝有2 mL考馬斯亮藍(lán) G-250和180 μL去離子水的試管中，混勻后于 595 nm處測定其吸光度。過敏蛋白濃度測定：輻照后的過敏蛋白溶液于 280 nm下測定其吸光度。采用紫外分光光度計測定二者吸光度。

1.4.2 ?疏水性變化 ?參照顧可飛等[17]的操作方法。向2 mL輻照后的過敏蛋白溶液中加入15 μL的8-苯氨基-1-萘磺酸（ANS ）液，混勻，室溫放置2 h，激發(fā)波長為385 nm，進(jìn)行發(fā)射波長在420～550 nm范圍內(nèi)的熒光強(qiáng)度掃描。采用熒光光度計測定過敏蛋白的疏水性。

1.4.3 ?SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 ?將輻照后的過敏蛋白溶液50 μL與等體積的上樣緩沖液進(jìn)行混合后，于沸水浴中煮沸3～5 min，分離膠濃度為15%，電泳電壓為100 V，濃縮膠濃度為4%，電泳電壓為60 V，待指示劑離開凝膠后停止電泳，將膠片取下后，放入考馬斯亮藍(lán)R-250中過夜染色，然后回收染色液，加入脫色液中脫色至背景無色。

1.4.4 ?中華絨螯蟹過敏原鑒定 ?利用15%的分離膠，5%的濃縮膠將過敏原蛋白質(zhì)分離后，取出凝膠，與剪好的Whatman濾紙和硝酸纖維素膜一起放入蛋白轉(zhuǎn)印緩沖液中浸潤30 min，按（+）支持板-無紡纖維墊-兩層濾紙-硝酸纖維素膜-凝膠-兩層濾紙-無紡纖維墊-支持板（-）的順序安裝轉(zhuǎn)印芯，按紅（陽極）、黑（陰極）方向?qū)⑵浞湃朕D(zhuǎn)印槽中，倒入轉(zhuǎn)印緩沖液，在90 V下轉(zhuǎn)印2.5 h，取出硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜放入麗春紅中染色5 min，以確定蛋白質(zhì)是否轉(zhuǎn)上去。確定轉(zhuǎn)上后，將染色的硝酸纖維素膜用去離子水漂洗，直至紅色褪去。洗干凈后的硝酸纖維素膜放入封閉液中4 ℃過夜，棄去封閉液，加入20倍稀釋（V/V）的一抗室溫反應(yīng)2.0 h，TBST洗膜6次，每次5 min（6×5 min），洗完后加入1 000倍稀釋（V/V）的二抗室溫反應(yīng)2.0 h，TBST洗膜6×5 min，洗完后加入新配置的DAB溶液顯色5 min，以水沖洗終止反應(yīng)。

1.5 ?數(shù)據(jù)統(tǒng)計

用ANOVA 和Spjotvoll-Stoline test軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?中華絨螯蟹粗提液濃度

中華絨螯蟹粗提液595 nm處吸光度值以牛血清白蛋白為標(biāo)樣，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.013 9X+1.141 4，R2=0.989 7，其中Y為吸光度，X為牛血清白蛋白含量（μg）。10 μL中華絨螯蟹粗提液樣品在595 nm處吸光度為1.283，根據(jù)公式計算得到中華絨螯蟹粗提液樣品的濃度為1.02 mg/mL。

2.2 ?中華絨螯蟹粗提蛋白組分

中華絨螯蟹組織蛋白經(jīng)脫脂和PBS提取后，采用SDS-PAGE進(jìn)行分離。中華絨螯蟹粗提液有12條可辨蛋白條帶，分子質(zhì)量從18.6～89.1 kDa 不等，其中主要的蛋白條帶為18.6、20.1、23.4、27.1、37.2、41.7、43.1、47.9、53.7、67.6、75.9和 89.1 kDa（圖1）。endprint

2.3 ?中華絨螯蟹蛋白組分過敏原的鑒定

中華絨螯蟹粗提物電轉(zhuǎn)移至NC膜，轉(zhuǎn)印后的凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后蛋白質(zhì)電泳膠片無可見蛋白質(zhì)條帶，證明轉(zhuǎn)印較完全。蟹過敏患者陽性血清池對中華絨螯蟹粗提蛋白的免疫印跡結(jié)果顯示，粗提物中能與中華絨螯蟹過敏患者血清反應(yīng)的組分有7種，分子質(zhì)量在37.2～89.1 kDa之間，主要有 37.2、43.1、47.9、53.7、67.6、75.9和 89.1 kDa（圖2）。

2.4 ?輻照對中華絨螯蟹過敏蛋白溶液濃度和濁度的影響（n =3）

隨著輻照劑量的增加，中華絨螯蟹過敏蛋白濃度呈先增加后降低的趨勢，濁度隨劑量的變化趨勢與濃度大致相似（表1）。其原因可能是輻照導(dǎo)致部分蛋白發(fā)生變性，使疏水基團(tuán)外露，發(fā)色基團(tuán)藍(lán)移動，同時吸光度增加[18]。輻照劑量為15 kGy時濃度和濁度都達(dá)到最大值，輻照劑量達(dá)到20 kGy時，輻照使蛋白變性形成大的顆粒而部分沉淀，過敏原溶液經(jīng)輻照后其水溶性下降，使得蛋白濃度降低，濁度也隨之降低。

2.5 ?輻照對中華絨螯蟹過敏蛋白疏水性的影響

熒光探針8-苯氨基-1-萘磺酸（ANS）在水溶液中的熒光強(qiáng)度很弱，但是當(dāng)ANS與蛋白質(zhì)表面的疏水性基團(tuán)相結(jié)合時，熒光強(qiáng)度就會增強(qiáng)。通過熒光強(qiáng)度的變化可以反映蛋白質(zhì)疏水性的變化。如圖3所示，隨著輻照劑量的增加，中華絨螯蟹過敏蛋白溶液的疏水性呈先增加后下降的趨勢，在輻照劑量20 kGy時達(dá)到最大值。推測疏水性變化的原因可能是蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)隨輻照劑量的增加逐漸外露，當(dāng)劑量繼續(xù)增加時，蛋白分子發(fā)生降解或交聯(lián)，疏水基團(tuán)減少。這與蛋白輻照后濁度的變化有一定的關(guān)系。

2.6 ?輻照對中華絨螯蟹過敏蛋白濃度的影響

十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果（圖4）表明，與未輻照的溶液相比，輻照后過敏蛋白的含量隨輻照劑量的增加而下降，到20 kGy時，過敏蛋白含量下降明顯，30 kGy時僅看見75.9 kDa大小的蛋白條帶;大于30 kGy的處理幾乎看不見任何條帶，大分子蛋白條帶的減少伴隨小分子蛋白混合物的增加;新生成的蛋白條帶分子質(zhì)量在42 kDa左右;當(dāng)輻照劑量達(dá)到20 kGy時，新生成的條帶也開始降解，并無新的蛋白條帶產(chǎn)生，當(dāng)輻照劑量達(dá)到45 kGy時所有的條帶完全消失。

2.7 ?輻照對中華絨螯蟹過敏蛋白抗原性的影響

隨著輻照劑量的增加，過敏蛋白的濃度和免疫原性均逐漸降低（圖5）。未輻照樣品出現(xiàn)3條較為明顯的蛋白條帶（圖5a），過敏患者血清免疫反應(yīng)中出現(xiàn)6條明顯的印跡（圖5b），這說明未輻照樣品有5種不同分子質(zhì)量蛋白組分發(fā)生過敏反應(yīng)，分布在37.2～89.1 kDa之間。當(dāng)輻照劑量為9 kGy時，蛋白含量減少，且在35～55 kDa之間因降解產(chǎn)生新的混合蛋白成分;對于過敏患者血清中，除原蛋白組分的隱約3條印跡外，新組分未發(fā)現(xiàn)有過敏反應(yīng)，并不具有免疫原性，而且隨著輻照劑量的增加，過敏蛋白與血清的反應(yīng)越來越弱，45 kGy輻照后的NC膜上基本看不到痕跡。標(biāo)準(zhǔn)分子量沒有與過敏患者血清發(fā)生反應(yīng)，也可以排除蛋白的非特異性結(jié)合?？梢?，輻照9 kGy可明顯降低過敏蛋白的免疫原性，輻照20 kGy時中華絨螯蟹蛋白溶液失去過敏性。

3 ?討論

蟹在中國廣泛分布，蟹類及其制品含有豐富的蛋白質(zhì)，并且味道鮮美，深受人們的喜愛，但對于這種常見的水產(chǎn)品，嚴(yán)重過敏者甚至?xí)l(fā)生過敏性休克。在對中華絨螯蟹過敏原的研究中，陳偉等[19]的研究顯示中華絨螯蟹中的主要過敏原是分子質(zhì)量為 66 kDa和76 kDa的蛋白，吳興達(dá)[20]的研究則認(rèn)為中華絨螯蟹的主要過敏原為分子質(zhì)量在35、41、48、66 kDa的蛋白。本試驗結(jié)果表明，分子質(zhì)量在 37.2～89.1 kDa之間的7種蛋白為中華絨螯蟹的主要過敏原，與文獻(xiàn)報道的分子量范圍一致，可能由于中華絨螯蟹地域不同，導(dǎo)致了過敏原分子質(zhì)量的差異性。

國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)，已知食物主要過敏原對熱、酸、蛋白酶穩(wěn)定，常規(guī)的加工處理很難達(dá)到清除過敏原的要求[21]。輻照處理對蝦過敏蛋白、雞蛋中的卵粘蛋白（OM）、牛奶中的α-乳球蛋白（BLG）都有破壞作用，均能使它們的過敏性下降，抗原表位破壞[22-24]。輻照處理使蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中的部分氨基酸發(fā)生分解或氧化，部分蛋白質(zhì)大分子還會發(fā)生解聚、交聯(lián)、裂解以及空間結(jié)構(gòu)、構(gòu)象的改變，破壞蛋白質(zhì)在生物體中的結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能結(jié)構(gòu)遭到破壞，喪失生物活性[14，25-27]。本試驗在利用輻照技術(shù)處理中華絨螯過敏蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著輻照劑量的增加，蛋白濃度降低，蛋白組分含量下降，濁度增高，過敏性逐漸下降。SDS-PAGE電泳中，3～15 kGy輻照后，產(chǎn)生分子質(zhì)量約42 kDa的蛋白條帶，20 kGy輻照后過敏蛋白降解的趨勢明顯，45 kGy輻照后，蛋白已經(jīng)降解完全，且免疫印跡結(jié)果顯示抗原決定簇被掩蓋或破壞。

明膠蛋白質(zhì)含水條件下輻照會導(dǎo)致游離氨基酸殘基含量的持續(xù)下降，交聯(lián)度逐漸增加、特性粘度下降和不溶物的出現(xiàn)[28]。本試驗中過敏蛋白溶液輻照后也有類似的發(fā)現(xiàn)。過敏蛋白濁度隨劑量的增加呈先增加后下降的趨勢，這是因為過敏原溶液經(jīng)輻照后發(fā)生交聯(lián)和變性反應(yīng)，導(dǎo)致水溶性下降，濁度增加，隨著交聯(lián)反應(yīng)程度的增加，小分子不溶物聚集、沉淀，濁度又隨之降低。濁度的變化使蛋白質(zhì)濃度測定時受到一定程度的影響。

疏水基的相互作用在維持蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方面起重要作用，蛋白的疏水性和巰基含量的變化反應(yīng)蛋白的變性程度。李迎秋等[29]發(fā)現(xiàn)，高壓脈沖電場處理時間越長，大豆分離蛋白的疏水性和巰基含量越高。本試驗中，輻照后蛋白的疏水性增加的現(xiàn)象與前人研究部分相似，不同之處是，過敏原蛋白受到輻照后，疏水性隨輻照劑量的增加呈先升后降的趨勢，推測疏水性變化的原因是，蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)隨輻照劑量的增加逐漸外露，當(dāng)劑量繼續(xù)增加時，蛋白分子發(fā)生降解或交聯(lián)，疏水基團(tuán)減少，具體結(jié)論有待進(jìn)一步分析。endprint

4 ?小結(jié)

中華絨螯蟹蛋白粗提液蛋白分子質(zhì)量范圍為18.6～89.1 kDa，蛋白條帶分子質(zhì)量分別為18.6、20.1、23.4、27.1、37.2、41.7、43.1、47.9、53.7、67.6、75.9和89.1 kDa;與中華絨螯蟹過敏患者血清反應(yīng)的蛋白組分有7種，分子質(zhì)量在 37.2～89.1 kDa之間，主要有 37.2、43.1、47.9、53.7、67.6、75.9和 89.1 kDa。中華絨螯蟹蛋白粗提液蛋白濃度和免疫原性隨輻照劑量的增加而降低，疏水性和濁度隨輻照劑量的增加呈先上升后下降的趨勢。

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