曬煙種質(zhì)資源形態(tài)學(xué)標(biāo)記及SSR標(biāo)記的多樣性分析

王慧穎+王曼+樸世領(lǐng)+金愛(ài)蘭+陳爽

摘要： 以吉林省常見(jiàn)的23份曬煙和2份烤煙為試材，利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記和SSR分子標(biāo)記兩種方法進(jìn)行遺傳距離的研究，并將所得的遺傳距離進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，曬煙材料的形態(tài)學(xué)歐氏距離在1.11～8.29之間，歐氏距離較小，說(shuō)明各曬煙品種間遺傳基礎(chǔ)狹窄。通過(guò)SSR標(biāo)記法，得到各曬煙材料間的遺傳背景較相似，遺傳相似系數(shù)為0.51～0.98，相似性較大，說(shuō)明親緣關(guān)系較近。兩種方法的聚類分析結(jié)果基本一致。利用SPSS軟件對(duì)形態(tài)學(xué)歐氏距離與SSR遺傳相似系數(shù)進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r=-0.383。由此可見(jiàn)，分子標(biāo)記能反映煙草品種間的遺傳變異，通過(guò)這種簡(jiǎn)便快捷的標(biāo)記方法，能夠提高煙草育種效率。

關(guān)鍵詞：曬煙;形態(tài)學(xué)標(biāo)記;SSR標(biāo)記;親緣關(guān)系;遺傳多樣性;相關(guān)性分析

中圖分類號(hào)：S572 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2015）23-5943-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.23.038

The Genetic Diversity Analyses on Sun-cured Tobacco Germplasm by Morphological Markers and SSR Markers

WANG Hui-ying1， WANG Man1， PIAO Shi-ling1， JIN Ai-lan2， CHEN Shuang1

（1.Agricultural College，Yanbian University，Yanji 133002，Jilin，China;2.Yanbian Academy of Agricultural Sciences，Longjing 133400，Jilin，China）

Abstract： Taking 23 common sun-cured tobaccos and 2 flue-cured tobaccosof Jilin province as test materials， combining with morphological markers and SSR markers， the correlation of genetic distance was analyzed. Results showed that， morphology euclidean distance of sun-cured material was 1.11～8.29， which showed genetic base among sun-cured tobacco varieties was relatively narrow. Genetic backgrounds between each sun-cured materials were similar through SSR markers， the genetic similarity coefficient was 0.51～0.98. Cluster analysis results of the two methods were basically the same. The correlation analysis between morphology euclidean distance and SSR genetic similarity coefficient was conducted by SPSS software， a significant negative correlation was obtained with correlation coefficient ?r=-0.383. It was concluded ?that molecular markers could reflect the genetic variation among breeds， andimprove the breeding efficiency.

Key words：sun-cured tobacco;morphological markers;SSR markers;genetic relationship; genetic diversity;correlation analysis

吉林省曬煙作為中國(guó)名曬煙之一，以色澤鮮明、吃味純凈、油分充足、香氣優(yōu)雅濃郁、焦油釋放量低等特點(diǎn)在中國(guó)享有很高的聲譽(yù)[1]。但后來(lái)盲目追求產(chǎn)量、忽視質(zhì)量、科研投入少，沒(méi)有開(kāi)展深層次的科學(xué)研究，致使種質(zhì)間遺傳基礎(chǔ)狹窄，煙葉內(nèi)在質(zhì)量差，生產(chǎn)規(guī)模萎縮[2]，阻礙了煙草產(chǎn)量和質(zhì)量的進(jìn)一步提高[3]。加之長(zhǎng)久以來(lái)，種煙戶自由種植，導(dǎo)致優(yōu)質(zhì)品種逐漸退化，出現(xiàn)品種混雜現(xiàn)象，嚴(yán)重影響了吉林省曬煙聲譽(yù)，挫傷了煙農(nóng)種煙積極性。為此，探索種質(zhì)資源之間的遺傳多樣性和建立核心種質(zhì)資源庫(kù)非常必要。

形態(tài)標(biāo)記為一種操作簡(jiǎn)單、直觀、便于觀察的遺傳標(biāo)記，是人們最早利用的遺傳標(biāo)記[4]。牛佩蘭等[5]、肖炳光等[6]先后利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記對(duì)遺傳距離進(jìn)行測(cè)定和聚類分析，證明了形態(tài)學(xué)標(biāo)記遺傳多樣性的可行性。SSR（Simple Sequence Repeat，簡(jiǎn)單序列重復(fù)）標(biāo)記是建立在 PCR 技術(shù)上的 DNA標(biāo)記，其操作相對(duì)簡(jiǎn)單、獲得結(jié)果快速且不受試驗(yàn)環(huán)境條件的影響。陳杰[4]再次證明了SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)遺傳多樣性研究的結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確度，能很好地揭示其親緣關(guān)系。目前，SSR分子標(biāo)記技術(shù)已被廣泛用于烤煙種質(zhì)資源遺傳多樣性檢測(cè)、品種鑒定和親緣關(guān)系的研究[7]，但針對(duì)吉林省特定生態(tài)區(qū)域曬煙的研究甚少。為此，本研究利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記和SSR分子標(biāo)記對(duì)曬煙種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析，以期為吉林省曬煙種質(zhì)資源的合理利用和優(yōu)良新品種的選育提供一定的依據(jù)。endprint

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

以吉林省常見(jiàn)的23份曬煙（1～23號(hào)）和2份烤煙（24～25號(hào)）品種為試驗(yàn)材料。品種及編號(hào)：①五十葉、②紅花鐵矮子、③光興煙、④牡丹池?zé)?、⑤吉林琥珀香、⑥元峰煙、⑦小馬稀、⑧大馬稀、⑨風(fēng)林一號(hào)、⑩紅花矮子、■孟山草、■大護(hù)耳柳葉尖、■仲成五十葉、■杰滿煙、■延曬一號(hào)、■延曬二號(hào)、■“8107”、 18延吉自來(lái)紅、 19延吉千層塔、 ?20太興煙、

21延邊紅、 22牡丹一號(hào)、 ?23松川（關(guān)東201）、 ?24云煙87、25吉煙九號(hào)。供試材料種子取自吉林省延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所。所有煙草材料種植于延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院煙草試驗(yàn)基地，每個(gè)品種種植60株。

1.2 ?試劑和儀器

植物基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自南京奧多福尼生物科技有限公司;10×buffer、Marker、25 mmol/L Mg2+、Taq酶、dNTP和瓊脂糖凝膠均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;試驗(yàn)采用Bindler等[8]發(fā)表的引物序列，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物用滅菌雙蒸水稀釋成10 pmol/μL備用。

DYY-12型電泳儀、電泳槽（北京六一儀器廠）;PCR梯度擴(kuò)增儀、全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）;LX—100手掌型離心機(jī)（海門市麒麟醫(yī)用儀器廠）;水浴鍋;臺(tái)式離心機(jī)（合肥名威科技發(fā)展有限公司）;Sanyo MDF-U73V型超低溫冰箱（上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司）等。

1.3 ?試驗(yàn)方法

1.3.1 ?各品種煙葉的形態(tài)學(xué)性狀指標(biāo)分析

1）煙葉農(nóng)藝性狀的測(cè)定。分別測(cè)定各品種的株高、莖圍、葉數(shù)、節(jié)距、葉長(zhǎng)、葉寬（每品種定10株記載植物學(xué)性狀，求平均值），并觀察不同品種的株型、葉形、葉色和花色。具體參照中華人民共和國(guó)煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（YC/T 142-2010）進(jìn)行。

2）煙葉主要化學(xué)成分的測(cè)定。打頂后10 d，選取有代表性的煙株3株，分別取上部、中部、下部新鮮葉片若干作為測(cè)定材料，取樣后用液氮保存并迅速送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行殺青30 min，然后烘干、研碎過(guò)篩，裝入塑料袋中做好標(biāo)簽密封，保存?zhèn)溆?。分別測(cè)定總糖、還原糖[9]、煙堿[10]、總氮[11]和蛋白質(zhì)含量[10]，形態(tài)學(xué)性狀的統(tǒng)計(jì)每份材料的每個(gè)性狀重復(fù)測(cè)定3次。

1.3.2 ?SSR-PCR反應(yīng)體系及檢測(cè)方法

采用植物基因組DNA試劑盒提取法提取DNA。曬煙的SSR-PCR反應(yīng)體系為：20 μL體系中含10×PCR buffer 2 μL，模板DNA 20 ng，引物0.25 μmol/L，Mg2+ 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq酶1.5 U，ddH2O 10.1 μL。PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性：95℃ 5min;95 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s（視引物而變），72 ℃ 50 s，40個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min，4 ℃保存?zhèn)溆肹12]。

取不同品種的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物15 μL分別與3 μL溴酚藍(lán)混勻，依次點(diǎn)入2%瓊脂糖凝膠膠口中，電泳后用EB染色，然后在美國(guó)BIO-RAD全自動(dòng)凝膠成像儀上照相觀察。

1.3.3 ?數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS軟件對(duì)25份供試材料的6個(gè)農(nóng)藝性狀和5種化學(xué)成分指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，然后按歐氏距離、離差平方和法進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析[13]，并繪制樹(shù)狀圖。對(duì)于SSR帶型，在相同遷移率的位置上，對(duì)每個(gè)位點(diǎn)上的條帶進(jìn)行計(jì)數(shù)，有帶記為“1”，無(wú)帶記為“0”。數(shù)據(jù)分析采用NTSYS2.10軟件，聚類分析用類平均法UPGMA（Un weighted pair-Group Method with Arithmetic mean）程序進(jìn)行，首先計(jì)算出任意兩個(gè)材料間的遺傳相似系數(shù)，然后獲得相應(yīng)的遺傳樹(shù)狀圖[14]。將表型性狀獲得的遺傳距離矩陣與SSR分析獲得的遺傳相似系數(shù)矩陣數(shù)據(jù)輸入SPSS軟件，對(duì)二者進(jìn)行形態(tài)學(xué)歐氏距離與SSR遺傳相似系數(shù)的相關(guān)性分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?形態(tài)學(xué)標(biāo)記結(jié)果與聚類分析

25份品種間的歐氏距離列于表1，歐式距離越大，遺傳差異性越大。試驗(yàn)結(jié)果表明，兩份烤煙材料與曬煙各品種間的歐氏距離均較大，介于7.44～10.58之間，說(shuō)明不同煙草類型間的遺傳差異性較大，其中烤煙云煙87與曬煙吉林琥珀香的遺傳差異性最大，歐式距離為10.58;兩份烤煙之間的歐氏距離僅為0.87，說(shuō)明二者在25份供試材料中的親緣關(guān)系最近;23份曬煙之間的歐氏距離以延吉自來(lái)紅和延吉千層塔最小，為1.11，說(shuō)明二者在23份供試曬煙中的親緣關(guān)系最密切，而親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的兩份曬煙是牡丹池?zé)熀汀?107”，歐氏距離為8.29。

由形態(tài)學(xué)指標(biāo)樹(shù)狀圖（圖1）可知，烤煙與曬煙間的遺傳相似性較低，當(dāng)歐氏距離取值為11時(shí)，可以明顯地將它們區(qū)分成兩大類，即Ⅰ1和Ⅰ2，當(dāng)歐氏距離取值為8時(shí)，可將所有的曬煙系列（Ⅰ2）進(jìn)一步分成兩個(gè)亞類（Ⅱ1、Ⅱ2）。第一亞類（Ⅱ1）包括延吉自來(lái)紅、延吉千層塔、仲城五十葉、吉林琥珀香、紅花矮子以及孟山草，第二亞類（Ⅱ2）包括其他的17份曬煙品種，總體來(lái)看，供試曬煙品種間的遺傳基礎(chǔ)較為狹窄。

2.2 ?SSR的遺傳多樣性分析

用已篩選出的10對(duì)SSR引物對(duì)所有供試品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在分子量為200～1 000 bp范圍內(nèi)，10對(duì)引物在25份供試材料中共擴(kuò)增出52條帶，其中有44條帶是多態(tài)性條帶，占總帶數(shù)85%，表明不同供試種質(zhì)之間遺傳多態(tài)性豐富，另外8條是所有品種共有的條帶，這在一定程度上揭示了各煙草種質(zhì)間的同源性，同時(shí)也證實(shí)了SSR分子標(biāo)記法用于煙草品種親緣關(guān)系分析的可靠性。圖2為引物PT20306對(duì)所有供試品種的擴(kuò)增結(jié)果。endprint

2.3 ?25份供試品種間的遺傳相似系數(shù)及聚類分析

利用NYSTS軟件對(duì)所有供試品種之間的遺傳相似系數(shù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)（表2）。結(jié)果表明，相似性系數(shù)越大，親緣關(guān)系越近。23份供試曬煙的遺傳相似系數(shù)介于0.531～0.980之間，平均相似系數(shù)為0.744，說(shuō)明供試曬煙間的遺傳相似性較大，親緣關(guān)系較近，其中吉林琥珀香、元峰煙和小馬稀三者之間表現(xiàn)最明顯，而松川（關(guān)東201）雖為日本引進(jìn)種質(zhì)資源，但它與其他地方性曬煙種質(zhì)的遺傳相似性較高，在雜交方面并不具備優(yōu)勢(shì)，23份曬煙種質(zhì)與供試烤煙間的遺傳相似性系數(shù)平均值為0.627，親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，其中表現(xiàn)最明顯的是紅花鐵矮子、延曬二號(hào)與云煙87之間，可能是不同煙屬和不同地區(qū)栽培環(huán)境造成的，而云煙87與吉煙九號(hào)同屬于烤煙，因此遺傳關(guān)系相對(duì)較近，相似系數(shù)為0.857。

為了更直觀地看出25個(gè)供試品種在基因組上的遺傳關(guān)系，利用UPGMA法對(duì)所有供試品種的遺傳相似系數(shù)矩陣進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建了不同煙草品種間的樹(shù)狀圖（圖3）。試驗(yàn)表明，兩份烤煙與其他曬煙在第一等級(jí)劃分時(shí)就被明顯的劃分成兩大類群（Ⅰ1、Ⅰ2），它們間的遺傳相似性最小，僅為0.628，第二等級(jí)劃分（L2=0.690）可以將Ⅰ2進(jìn)一步劃分為兩大亞類。

第一亞類（Ⅱ1）包括9個(gè)品種，分別為紅花矮子、仲成五十葉、太興煙、孟山草、牡丹一號(hào)、松川（關(guān)東201）、延曬一號(hào)、8107、延邊紅，組內(nèi)遺傳相似系數(shù)介于0.698～0.898之間。

第二亞類（Ⅱ2）包括14個(gè)曬煙品種，即五十葉、紅花鐵矮子、杰滿煙、吉林琥珀香、元峰煙、小馬稀、風(fēng)林一號(hào)、大護(hù)耳柳葉尖、延曬二號(hào)、延吉千層塔、大馬稀、光興煙、延吉自來(lái)紅、牡丹池?zé)煟M內(nèi)遺傳相似系數(shù)為0.726～0.980之間。

第三等級(jí)劃分（L3=0.7），可在第二等級(jí)劃分結(jié)果不變的情況下再將第一亞類（Ⅱ1）劃分成兩個(gè)小亞類，即Ⅲ1、Ⅲ2，其中Ⅲ1包括紅花矮子、仲成五十葉、太興煙、孟山草、牡丹一號(hào)和松川（關(guān)東201），Ⅲ2包括其他3份曬煙延曬一號(hào)、“8107”和延邊紅。

由此可見(jiàn)，兩份烤煙與其他曬煙品種之間有較好的分辨能力，較早地就形成了兩個(gè)不同的分支，而曬煙種內(nèi)遺傳基礎(chǔ)相對(duì)狹窄，尤其是吉林琥珀香與元峰煙之間的遺傳相似性最大。

2.4 ?形態(tài)學(xué)歐氏距離與SSR遺傳相似系數(shù)的相關(guān)性分析

為了檢測(cè)同組供試材料基于形態(tài)學(xué)標(biāo)記和SSR分子標(biāo)記分析結(jié)果的相關(guān)程度，本研究利用SPSS軟件對(duì)形態(tài)學(xué)歐氏距離與SSR遺傳相似系數(shù)進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r=-0.383，為進(jìn)一步探討形態(tài)學(xué)歐氏距離與SSR遺傳相似系數(shù)確定不同品種遺傳差異的一致性程度，又將化學(xué)成分組合和農(nóng)藝性狀組合所得到的歐氏距離分別與SSR分析得到的遺傳相似系數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果均表現(xiàn)為極顯著負(fù)相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為r=-0.366和r=-0.265。

3 ?小結(jié)與討論

從形態(tài)學(xué)標(biāo)記和SSR分子標(biāo)記分析比較來(lái)看，兩者結(jié)果總體上一致，但存在一定的差異。兩種方法均說(shuō)明了供試曬煙品種間遺傳相似性較大、遺傳基礎(chǔ)狹窄，經(jīng)相關(guān)性檢測(cè)，形態(tài)學(xué)歐氏距離與SSR遺傳相似系數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為 ? ? r=-0.383。這不僅說(shuō)明SSR分子標(biāo)記應(yīng)用于煙草遺傳關(guān)系分析的可靠性，也反映了本研究所選用的形態(tài)學(xué)標(biāo)記法在品種資源鑒定中的合理性。這一點(diǎn)在朱慧麗[15]的研究中也有所體現(xiàn)，但相關(guān)性結(jié)果與本試驗(yàn)稍有不同，可能是由于供試煙草類型不同、分子標(biāo)記方法亦不同引起的。與SSR聚類結(jié)果相比，形態(tài)學(xué)標(biāo)記稍有不同，如延曬一號(hào)和延曬二號(hào)是兩個(gè)遺傳背景不同的品種，在SSR標(biāo)記中得到了證實(shí)，但形態(tài)學(xué)標(biāo)記并未將它們區(qū)分開(kāi)，又如吉林琥珀香和元峰煙在形態(tài)學(xué)標(biāo)記中是被分到兩個(gè)不同的曬煙大亞類中，但在SSR標(biāo)記中，它們卻是最先被聚成一類的，親緣關(guān)系最近。造成這種差異的原因可能是形態(tài)學(xué)標(biāo)記受環(huán)境和人們主觀因素影響較大。實(shí)際上，形態(tài)學(xué)差異和分子水平的差異所經(jīng)受的進(jìn)化壓力不同，遵循的規(guī)律也不同，彼此是相互獨(dú)立的[16]，形態(tài)學(xué)上的差異并不一定是DNA水平變異的真實(shí)反映[17]，換句話說(shuō)，肉眼可觀察到的形態(tài)學(xué)性狀的差異在SSR標(biāo)記檢測(cè)的多態(tài)性位點(diǎn)上并不一定都能表現(xiàn)出來(lái)。為此，可以有針對(duì)性地設(shè)計(jì)引物，使之覆蓋面廣，將形態(tài)學(xué)性狀上表現(xiàn)差異的位點(diǎn)都以SSR等位位點(diǎn)的形式檢測(cè)出來(lái)，最終達(dá)到兩種標(biāo)記的協(xié)同統(tǒng)一。

綜上所述，SSR標(biāo)記法更利于育種工作者進(jìn)行早期鑒定，明確各品種遺傳關(guān)系，從而縮短育種年限，加快育種步伐，提高育種效果，且該標(biāo)記方法更符合植物學(xué)分類的結(jié)果?？偠灾琒SR分子標(biāo)記法是比形態(tài)學(xué)標(biāo)記更優(yōu)的遺傳多樣性分析方法。

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