侵染油茶的兩種病原菌的鑒定及其生物學(xué)特性研究

史紅安+傅本重+張志林+李國(guó)元+王立華

摘要：為了掌握湖北孝感本地油茶（Camellia oleifera）主要病害發(fā)生規(guī)律，采用常規(guī)組織分離法分離病原菌，依據(jù)病原菌的形態(tài)特征，結(jié)合其rDNA-ITS序列分析，對(duì)油茶病原菌進(jìn)行分離和分子鑒定，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，鑒定兩種病原菌分別為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和鏈格孢（Alternaria ?alternata）;炭疽病菌菌株在PDA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最快，最適碳源和氮源分別為淀粉、硫酸銨，pH 6.0為宜，最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃，致死溫度為52 ℃;鏈格孢菌株最適培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，以淀粉為碳源、硝酸銨為氮源為宜，pH 8.0時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快，最適溫度為25 ℃，致死溫度為54 ℃。

關(guān)鍵詞：油茶（Camellia oleifera）;病原菌;膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）;鏈格孢（Alternaria alternata）;生物學(xué)特性

中圖分類號(hào)：S432.4+4 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2015）23-5908-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.23.028

The Study of Two Camellia Pathogens Isolation，

Identification and Biological Characteristics

SHI Hong-an1，2，F(xiàn)U Ben-zhong1，ZHANG Zhi-lin1，LI Guo-yuan1，WANG Li-hua1

（1.Hubei Key Laboratory of Quality Control of Characteristic Fruits and Vegetables，Hubei Engineering University， Xiaogan 432000，

Hubei， China;2. College of life science， Hubei University，Wuhan ?430062，China）

Abstract： The two Camellia pathogens were isolated， identified， and the primary biological characteristics were determined. By using routine isolation method from tissue， following morphological characteristics， combining with the result of the rDNA-ITS sequence analysis， the two pathogens were identified as Colletotrichum gloeosporioides and Alternaria alternata，respectively.The test showed the pathogen C. gloeosporioides grew best in PDA media，starch as carbon source，ammonium sulfate as nitrogen source，pH 6.0， the optimum temperature was 25 ℃ and the lethal temperature was 52 ℃;For A. alternata，which grew best in CMM， starch as the carbon source，ammonium nitrate as nitrogen source，pH 8.0，the optimum temperature was 25 ℃， and the lethal temperature was 54 ℃.

Key words： Camellia oleifera; pathogen; Colletotrichum gloeosporioides; Alternaria ?alternata; characteristics

油茶（Camellia oleifera）屬山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia），是中國(guó)特有的一種高級(jí)油料作物，主要生長(zhǎng)于中國(guó)南方亞熱帶地區(qū)高山及丘陵地帶，是重要的木本油料樹種之一[1]。油茶炭疽?。–olletotrichum gloeosporioides Penz.）是油茶的主要病害之一，該病在中國(guó)各油茶產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，油茶的地上各部位均可受害，主要引起落果、落蕾、枝梢枯死、枝干潰瘍、甚至整株死亡[2]。病落果率通常在20%左右，有時(shí)高達(dá)40%以上。近年來，湖北油茶種植規(guī)模不斷擴(kuò)大，相應(yīng)的病害逐步引起重視。尤其是苗圃的病害發(fā)生嚴(yán)重，苗木調(diào)運(yùn)也能引起病害傳播，因此，對(duì)苗圃的病原菌檢測(cè)顯得尤為重要。目前對(duì)油茶炭疽病的防治只有通過種植抗性品種和化學(xué)防治來控制。本試驗(yàn)對(duì)引起湖北孝感本地油茶炭疽病的病原菌進(jìn)行了鑒定，并對(duì)病原菌的生物學(xué)特性進(jìn)行初步研究，為防治該病害提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?病原菌的分離、純化及存種

于2013年10月從湖北省孝感市油茶苗木基地采集病株標(biāo)本。油茶品種為長(zhǎng)林2號(hào)。

采用常規(guī)組織分離法[3]分離病原菌，從病葉病健交界處切取長(zhǎng)約3 cm的組織，用清水沖洗表面雜物，置于0.1%的酸性升汞水溶液中2 min，取出用去離子水沖洗2次，再用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇處理30 s，去離子水沖洗3次，在無菌條件下接種至PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)出后，移入另一平板培養(yǎng)。經(jīng)過3次以上純化，將所獲菌株編號(hào)接種于試管斜面，待菌落長(zhǎng)出后，于4 ℃保存。endprint

1.2 ?病原菌鑒定

1.2.1 ?病原菌形態(tài)學(xué)特征觀察 ?將純化后的菌種轉(zhuǎn)接到PDA平板上，置于25 ℃條件下培養(yǎng)5 d，觀察記載菌落形態(tài)、顏色、基質(zhì)顏色及分生孢子形態(tài)特征，作為鑒定病原菌的主要形態(tài)學(xué)依據(jù)。參照魏景超[4]、陸家云[5]的方法進(jìn)行病原菌鑒定。

1.2.2 ?病原菌rDNA-ITS的擴(kuò)增與序列分析 ?病原菌DNA提取參考何月秋[6]的方法。選取無污染且生長(zhǎng)良好的5～6 d菌3皿，用滅菌刀片刮取菌絲，稱重后得到DNA，置于-20 ℃保存。

采用真菌的通用引物ITS4和ITS5進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAA-3′[7]。PCR反應(yīng)總體系為50 μL，反應(yīng)液為引物ITS4和ITS5（上海生工生物工程有限公司） 各0.5 μL、10×buffer 5 μL、dNTP 5 μL、Taq酶0.4 μL、MgCl2 5 μL、去離子水32.6 μL。 PCR擴(kuò)增條件： 94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性50 s，50 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)顯示記錄電泳結(jié)果。PCR產(chǎn)物委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行純化和測(cè)序。

1.3 ?病原菌生物學(xué)特性測(cè)定

1.3.1 ?培養(yǎng)基試驗(yàn) ?馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂粉20 g、去離子水1 000 mL。沙堡弱培養(yǎng)基（SDA）：葡萄糖40 g、蛋白胨10 g、瓊脂粉20 g、去離子水1 000 mL。燕麥培養(yǎng)基（OA）：燕麥片30 g、瓊脂粉20 g、去離子水1 000 mL。玉米粉培養(yǎng)基（CMM）：玉米粉40 g、蔗糖10 g、瓊脂粉20 g、去離子水1 000 mL。查氏培養(yǎng)基（CZ）：蔗糖30 g、硝酸鈉2 g、氯化鉀0.50 g、硫酸亞鐵0.010 g、磷酸二氫鉀1 g、瓊脂粉20 g、去離子水1 000 mL。取培養(yǎng)5 d的病原菌，用打孔器取直徑6 mm的菌餅分別接種在5種培養(yǎng)基平板中央，每個(gè)處理重復(fù)3次，于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d后，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.3.2 ?碳源試驗(yàn) ?以查氏培養(yǎng)基[8]為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以葡萄糖、肌醇、D-果糖、乳糖、可溶性淀粉代替蔗糖，取培養(yǎng)5 d直徑6 mm的菌餅分別接種在上述培養(yǎng)基平板中央，每個(gè)處理重復(fù)3次，于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d后，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.3.3 ?氮源試驗(yàn) ?以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以硝酸鉀、硝酸銨、硫酸銨、草酸銨、甘氨酸代替硝酸鈉，取培養(yǎng)5 d的病原菌，用打孔器取直徑6 mm菌餅分別接種在上述培養(yǎng)基平板中央，每個(gè)處理重復(fù)3次，于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d后，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.3.4 ?pH試驗(yàn) ?以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，共8個(gè)梯度，取培養(yǎng)5 d的病原菌，用打孔器取直徑6 mm的菌餅接種在供試8個(gè)梯度平板中央，每個(gè)處理重復(fù)3次，于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d后，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.3.5 ?溫度試驗(yàn) ?以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，取培養(yǎng)5 d的病原菌，用打孔器取直徑6 mm菌餅分別接種在平板中央，分別置于5、10、15、20、25、30、35 ℃中培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次，培養(yǎng)5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.3.6 ?致死溫度試驗(yàn) ?將直徑6 mm的菌餅置于裝有5 mL的去離子水中，將試管分別置于48、49、50、51、52、53、54、55 ℃的恒溫水浴鍋中處理10 min后迅速冷卻，再將菌餅取出置于PDA培養(yǎng)基上，每個(gè)處理重復(fù)3次，于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d后，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?病原菌鑒定

2.1.1 ?病原菌分離與形態(tài)鑒定 ?從油茶病葉上分離得到20株菌株，所對(duì)應(yīng)的編號(hào)為XCGO1-20，根據(jù)形態(tài)特征將菌株分為兩類（XCGO1、2、3、5、13、14、15、16、20為一類，剩余的為一類），以XCGO1、XCGO4（圖1-A、1-B）為代表。XCGO1呈圓形生長(zhǎng)，初為白色，絨毛狀，逐漸呈深褐色，分生孢子為棕紅色，并且色素滲入培養(yǎng)基內(nèi)，菌落終為棕紅色。XCGO4呈同心輪紋生長(zhǎng)，初為深綠色，菌落終為中央黑色，外部青褐色，邊緣色淺。

2.1.2 ?顯微狀態(tài)特征 ?XCGO1顯微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果（圖1-C）表明，分生孢子單胞，無色光滑，棒狀，兩端圓鈍，大小為（13.41～15.96） μm×（5.19～5.63） μm，平均15.32 μm×5.56 μm。XCGO4顯微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果（圖1-D）表明，分生孢子多數(shù)呈倒梨形或近卵狀，偶見狹棒狀或倒棒狀，黃褐色至褐色，具橫膈3～7個(gè)，縱斜膈膜0～4個(gè)，分生孢子大小為（24.4～48.9） μm×（7.3～12.2） μm，平均4.5 μm×9.2 μm。

2.1.3 ?病原菌rDNA-ITS的分析 ?XCGO1、XCGO4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序分析確定片段全長(zhǎng)分別為519 bp和506 bp。兩個(gè)菌株rDNA-ITS基因系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果顯示，菌株XCGO1序列與GenBank 登錄號(hào)JX010152（C. gloeosporioides）的同源性達(dá)到99%，確定為膠孢炭疽病菌（C. gloeosporioides）（圖2）。菌株XCGO4序列與GenBank登錄號(hào)KJ716876（Alternaria alternata）的同源性達(dá)到100%，確定為鏈格孢（A. alternata）（圖3）。endprint

2.2 ?病原菌生物學(xué)特性測(cè)定

2.2.1 ?培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 ?菌株XCGO1、XCGO4在以上5種培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，菌株XCGO1在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率高于其他培養(yǎng)基，CMM培養(yǎng)基次之;菌株XCGO4在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率顯著高于其他培養(yǎng)基，CZ培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率最低（表1）。

2.2.2 ?碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 ?在供試的5種碳源中，菌株XCGO1在以淀粉為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，菌絲生長(zhǎng)速率達(dá)到6.4 cm/d，顯著高于其他供試碳源;菌株XCGO4在以淀粉為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，菌絲生長(zhǎng)速率達(dá)到7.5 cm/d（表2）。

2.2.3 ?氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 ?在供試的5種氮源中，菌株XCGO1在以硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，菌絲生長(zhǎng)速率達(dá)到6.0 cm/d;菌株XCGO4 在以硝酸銨為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，菌絲生長(zhǎng)速率達(dá)到6.7 cm/d（表3）。

2.2.4 ?pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 ?如圖4所示，在pH 4～11范圍內(nèi)，兩種病原菌菌絲均能生長(zhǎng)，菌株XCGO1在pH 6時(shí)最適生長(zhǎng)，菌落直徑達(dá)到6.40 cm，在pH 4時(shí)菌絲生長(zhǎng)最弱，菌落直徑只有5.28 cm。菌株XCGO4在pH 8時(shí)最適生長(zhǎng)，菌落直徑達(dá)到6.45 cm，在pH 4時(shí)菌絲生長(zhǎng)最弱，菌落直徑僅3.40 cm。

2.2.5 ?溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 ?圖5表明，病原菌菌絲在20～30 ℃均能較好生長(zhǎng)，菌落直徑明顯大于其他溫度。其中25 ℃是兩種菌株的最適生長(zhǎng)溫度，菌株XCGO1的菌絲生長(zhǎng)速度較菌株XCGO4快。溫度低于10 ℃或高于30 ℃時(shí)生長(zhǎng)速度顯著下降。

2.2.6 ?致死溫度試驗(yàn) ?致死溫度試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株XCGO1在52、53、54、55 ℃高溫處理10 min后，沒有菌絲生長(zhǎng)，表明菌株XCGO1的致死溫度為52 ℃，致死時(shí)間為10 min。菌株XCGO4在54、55 ℃高溫處理10 min后，沒有菌絲生長(zhǎng)，表明菌株XCGO4的致死溫度為54 ℃，致死時(shí)間為10 min。

3 ?小結(jié)與討論

僅根據(jù)生物學(xué)形態(tài)特征對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定和分類是不夠的，ITS序列在炭疽菌的鑒定中的應(yīng)用為其鑒定提供了有力的依據(jù)。本研究綜合病原菌的形態(tài)學(xué)特征、生物學(xué)特性以及rDNA-ITS序列分析結(jié)果，鑒定出引起油茶病害的病原菌為C. gloeosporioides和A. alternata。本研究中C. gloeosporioides的形態(tài)特征與葉航等[9]報(bào)道的油茶炭疽病病原菌特征相似。A. alternata與周求根等[10]研究的貢梨黑斑病病原菌形態(tài)特征相似。該病原菌自1933年在果樹上報(bào)道以來，再次在油茶上發(fā)現(xiàn)并報(bào)道。通過對(duì)其生物學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，兩種病原菌在供試的培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，不存在差異。炭疽病菌菌株以淀粉為最適碳源、硫酸銨為最適氮源、pH 6.0為宜，最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃，致死溫度為52 ℃;鏈格孢菌株以淀粉為最適碳源、硝酸銨為最適氮源，pH 8.0時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快，最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃，致死溫度為54 ℃。

中國(guó)擁有豐富的油茶種質(zhì)資源，南方大部分地區(qū)都適宜生長(zhǎng)。油茶不僅營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，而且大力發(fā)展油茶是解決中國(guó)食用油安全問題的重要途徑之一，但病害對(duì)油茶產(chǎn)量有很大的影響。葉航等[9]在田間觀察發(fā)現(xiàn)，不同油茶物種、品種炭疽病的發(fā)病率不同，即使是同一品種，不同部位的發(fā)病率也不一樣。分離于油茶葉片的油茶炭疽病原菌有利于病菌種群劃分。本文通過對(duì)油茶病原菌的鑒定，以及病原菌的生物學(xué)特性研究，為油茶病害的綜合治理提供理論基礎(chǔ)。

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