• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    地丁豆根白術(shù)湯抗腫瘤作用的實驗研究

    2016-01-08 05:46:01辛明王加眾劉卿譚劉剛趙孝民
    中國現(xiàn)代醫(yī)生 2015年33期
    關(guān)鍵詞:復(fù)方提取物腹腔

    辛明 王加眾 劉卿 譚劉剛 趙孝民

    [摘要] 目的 研究地丁豆根白術(shù)湯的抗腫瘤作用。 方法 用地丁豆根白術(shù)湯復(fù)方中藥水提取物作用腫瘤細(xì)胞(sp2/0)和正常細(xì)胞(CEF)24 h,顯微計數(shù)研究復(fù)方中藥對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用;流式細(xì)胞技術(shù)和AnnexinⅤ-FITC/PI探討復(fù)方中藥對腫瘤細(xì)胞的殺傷機制;腹腔注射sp2/0細(xì)胞建立小鼠同源腹水型腫瘤模型,灌胃給藥,研究復(fù)方中藥對發(fā)病小鼠的治療作用。 結(jié)果 2.4 mg/mL的復(fù)方中藥水提取物作用24 h后,可完全殺滅sp2/0細(xì)胞,而對CEF細(xì)胞無明顯殺傷作用;2.4 mg/mL的復(fù)方中藥可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式殺傷腫瘤細(xì)胞,藥物作用2 h時凋亡比率達(dá)到峰值(58.77%);60 mg/d的藥量能明顯減少小鼠腹腔腫瘤的數(shù)量、大小,明顯延長小鼠壽命。 結(jié)論 該復(fù)方中藥對惡性腫瘤有一定的控制和治療作用,可以作為治療惡性腫瘤的藥物做進一步研究。

    [關(guān)鍵詞] 地丁豆根白術(shù)湯;惡性腫瘤;凋亡;小鼠

    [中圖分類號] R285 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701(2015)33-0025-03

    中藥已經(jīng)被用到多種癌癥的治療過程中,包括中藥單體提取物[1]和復(fù)方中藥[2]。這些中藥在體外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和皮下抑瘤方面有一定的作用[3],但少有實際應(yīng)用上的報道,因而無法判斷其在實際應(yīng)用中的效果。深入考慮,當(dāng)前對于中藥治療腫瘤的研究方法似乎存在一些不合理之處。因為人在自然條件下發(fā)生的類似于小鼠皮下的腫瘤[4]尚未見報道,長達(dá)24 h和48 h的中藥體外作用時間[1]過長。我們知道口服中藥4 h左右就會達(dá)到最高血液濃度并且半衰期出現(xiàn)在其后的1~3 h內(nèi)[5]。因此,我們只有選取能在體外快速起效的藥物,才有可能在治療腫瘤的過程中有一個較好的效果。本研究使用辛同強醫(yī)生組配的地丁豆根白術(shù)湯復(fù)方中藥展開研究。首先選取一個適宜的藥物濃度——在體外條件下,該濃度中藥對腫瘤細(xì)胞(sp2/0)有明顯的殺傷作用,而對正常細(xì)胞(CEF)生長情況影響較小。然后,通過流式細(xì)胞技術(shù)研究該藥殺傷腫瘤細(xì)胞的機制。隨后進行灌胃治療小鼠腹腔腫瘤試驗。

    1 材料與方法

    1.1材料

    雄性BALB/C小鼠購自山東大學(xué),sp2/0細(xì)胞和Hela細(xì)胞保存于本實驗室,CEF細(xì)胞分離自SPF雞胚,DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司,胎牛血清購自Gibco公司,AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡試劑盒購自嘉美生物公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 所有的細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    1.2.2 中藥提取物的制備 所有中藥組分在去離子水中浸泡4 h,用電磁爐中火煎煮2 h。水提取物3000 r/min離心10 min,用0.22 μm直徑的細(xì)菌濾器過濾,水浴蒸干水分,然后將提取物用無菌水溶解,調(diào)整濃度至30 mg/mL,并用0.22 μm直徑的細(xì)菌濾器過濾除菌后保存于-20℃條件下備用。

    1.2.3 細(xì)胞毒試驗 處于對數(shù)生長期的CEF和sp2/0細(xì)胞,分別轉(zhuǎn)移至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng),調(diào)整細(xì)胞濃度,使各孔的細(xì)胞量為5×104。培養(yǎng)6 h后用含有0 mg/mL、0.6 mg/mL、1.2 mg/mL、2.4 mg/mL、4.8 mg/mL復(fù)方中藥的DMEM培養(yǎng)液替換原先的細(xì)胞培養(yǎng)液,每個藥物濃度設(shè)置四個重復(fù)組,其中0 mg/mL為對照。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,1000 r/min離心5 min,收集細(xì)胞,PBS重懸細(xì)胞后,用臺盼藍(lán)染色進行活細(xì)胞計數(shù)。結(jié)果用占對照組活細(xì)胞的百分比表示。

    1.2.4 細(xì)胞凋亡試驗 為進一步確定該復(fù)方中藥殺傷細(xì)胞的機制,使用AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡試劑盒對細(xì)胞的凋亡情況進行檢測。將處于對數(shù)生長期的CEF細(xì)胞,轉(zhuǎn)移至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng),調(diào)整細(xì)胞濃度,使各孔的細(xì)胞量為5×105。培養(yǎng)6 h后用含有0 mg/mL、0.6 mg/mL、1.2 mg/mL、2.4 mg/mL、4.8 mg/mL復(fù)方中藥的DMEM培養(yǎng)液替換原先的細(xì)胞培養(yǎng)液,每個藥物濃度設(shè)置三個重復(fù)組,其中0 mg/mL為對照。繼續(xù)培養(yǎng)2 h后,1000 r/min離心5 min收集細(xì)胞,用1×binding buffer調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL,用FITC標(biāo)記的Annexin Ⅴ避光染色5 min,隨后PI避光染色5 min,立即用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡情況。根據(jù)CEF的細(xì)胞凋亡率選取最適藥物濃度,然后以此濃度的藥物分別作用于sp2/0細(xì)胞1 h、1.5 h、2 h、2.5 h測定腫瘤細(xì)胞凋亡的動態(tài)變化。

    1.2.5 小鼠同源腫瘤模型的建立及治療 12只五周齡的雄性BALB/C小鼠飼養(yǎng)于25℃條件下,采用自由取食取水的方式喂養(yǎng)。飼養(yǎng)1周后,每只小鼠腹腔注射5×106個處于對數(shù)生長期的sp2/0細(xì)胞,混合培養(yǎng)24 h后,將小鼠隨機分成兩組,每組6只,其中一組為對照組,一組為實驗組。60 mg/d的中藥提取物分3次通過灌胃的方式給予實驗組的每只小鼠,時間間隔為6 h,對照組以同樣的方式灌胃等量的生理鹽水。待發(fā)病小鼠全部死亡7 d后,處死實驗組未死亡小鼠。即時對兩組死亡小鼠進行剖解,觀察腹腔內(nèi)腫瘤的大小、數(shù)量以及腫瘤所處的部位,同時記錄死亡小鼠的死亡時間。

    1.2.6 Hela細(xì)胞的細(xì)胞毒試驗 為了進一步確定該復(fù)方中藥對人腫瘤細(xì)胞是否具有殺傷作用,我們選用Hela細(xì)胞進行相關(guān)試驗。采用不同濃度的復(fù)方中藥作用于Hela細(xì)胞24 h后,進行活細(xì)胞計數(shù)。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

    采用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件作分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,兩組各單變量比較采用獨立樣本t檢驗或方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1復(fù)方中藥提取物對CEF和sp2/0細(xì)胞的細(xì)胞毒作用

    兩種細(xì)胞在含有不同濃度中藥提取物的DMEM中培養(yǎng)24 h。其中sp2/0細(xì)胞在2.4 mg/mL和4.8 mg/mL藥物濃度時全部死亡,而CEF的半數(shù)致死濃度為4.2 mg/mL,見圖1。封三圖1A和封三圖1B分別展示的是2.4 mg/mL藥物濃度下sp2/0和CEF的細(xì)胞形態(tài),sp2/0的細(xì)胞形態(tài)明顯變差,而CEF幾乎沒有變化。兩種細(xì)胞平均存活率見表1,對于sp2/0細(xì)胞,各藥物濃度之間均有顯著差異,CEF細(xì)胞除4.8 mg/mL濃度外,其余濃度之間無明顯差異;在同一藥物濃度下CEF和sp2/0細(xì)胞間差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),說明該復(fù)方中藥具有明顯抗癌作用的同時也僅有較小的毒副作用。

    2.2 細(xì)胞凋亡分析

    CEF細(xì)胞在0 mg/mL、1.2 mg/mL、2.4 mg/mL、4.8 mg/mL的凋亡率分別為3.71%、4.09%、4.01%、13.29%(圖2)。根據(jù)CEF的細(xì)胞毒作用和凋亡分析,我們最終選用2.4 mg/mL的藥物濃度分別作用于sp2/0細(xì)胞1 h、1.5 h、2 h、2.5 h研究sp2/0細(xì)胞凋亡率的動態(tài)變化。sp2/0的凋亡率隨著時間的延長有一個先上升后下降的趨勢,峰值出現(xiàn)在2 h位點上,凋亡率為58.77%。該結(jié)果表明,本復(fù)方中藥確可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的方式殺傷腫瘤細(xì)胞(封三圖2)。

    2.3動物試驗

    我們通過腹腔注射sp2/0細(xì)胞的方式,建立小鼠同源腫瘤模型。對照組小鼠中,腫瘤出現(xiàn)于接種sp2/0后的12~14 d,小鼠的死亡時間也集中在19~21 d,腹腔中有溶血性腹水,腫瘤分布在肝臟、胃、腸等器官的表面及內(nèi)臟器官之間。然而,實驗組的6只小鼠中有2只未發(fā)現(xiàn)腫瘤,其余4只發(fā)病小鼠的發(fā)病時間推遲到24~28 d,腫瘤分布于小鼠腹腔內(nèi)皮下,最終死亡時間也推遲到35~38 d。此外,對照組的大型腫瘤數(shù)量平均每只小鼠5.2個,小型腫瘤的數(shù)量難以數(shù)清,而實驗組的發(fā)病小鼠除了平均每只小鼠1.25個的大型腫瘤外,沒有發(fā)現(xiàn)小型腫瘤。圖3中可以看出對照組和實驗組發(fā)病小鼠腹腔內(nèi)腫瘤的數(shù)量及大小。

    2.4 復(fù)方中藥提取物對Hela細(xì)胞的細(xì)胞毒作用

    隨著藥物濃度的提高,Hela細(xì)胞的存活率明顯下降,表明該藥對人體腫瘤細(xì)胞仍然具有較強的殺傷作用(封三圖3)。

    3 討論

    中醫(yī)認(rèn)為,人是一個有機整體,腫瘤是全身疾病的局部表現(xiàn),它的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等都是人體正氣不足所致[6],而腫瘤的病因主要是正氣虛損、氣滯血瘀、熱毒積聚、痰凝濕阻[7]。地丁豆根白術(shù)湯遵循“治病求本”[8]的原則,全方功效:健脾益氣,活血行氣、祛瘀止痛、清熱解毒、燥濕化痰、消腫散結(jié)。方中,白術(shù)等健脾益氣;川芎、丹參活血行氣,祛瘀止痛;蒲公英、山豆根、白花蛇舌草清熱解毒,消腫散結(jié);茯苓、天南星等燥濕化痰,利水滲濕[9]。

    本研究首次選用快速起效的研究思路,通過體外、體內(nèi)及人體試驗對該復(fù)方中藥治療惡性腫瘤的效果進行綜合評價。在體外,我們選用不同濃度的藥物分別作用于正常細(xì)胞CEF和小鼠骨髓瘤細(xì)胞sp2/0,sp2/0細(xì)胞在藥物濃度達(dá)到2.4 mg/mL時即全部死亡,而CEF在這一藥物濃度下無明顯的變化。在機制方面,考慮到口服中藥在體內(nèi)的代謝時間,我們首先用不同濃度的復(fù)方中藥提取物作用CEF細(xì)胞2 h,然后根據(jù)CEF的凋亡率及sp2/0細(xì)胞在前一試驗的存活率,最終選定2.4 mg/mL為研究sp2/0細(xì)胞死亡機制的最適濃度。為了獲得腫瘤細(xì)胞凋亡率的動態(tài)變化,我們選用給藥后不同的時間點對sp2/0細(xì)胞的凋亡率進行測定。凋亡率隨著時間的延長有先上升后下降的趨勢,峰值出現(xiàn)在2 h處,為58.77%。凋亡率下降的原因可能是,晚期凋亡的細(xì)胞形成凋亡小體,因此這部分細(xì)胞在流式細(xì)胞儀上不能夠被檢測出來。這一結(jié)論可以在封三圖2中得到證實,在2.5 h時間點上的被檢測細(xì)胞總數(shù)明顯低于對照組,而這部分細(xì)胞可能是形成凋亡小體的晚期凋亡細(xì)胞。這一結(jié)論也與Nancy1998年在《Science》上發(fā)表的研究成果相一致,即細(xì)胞凋亡從開始到形成凋亡小體被吞噬細(xì)胞吞噬的整個過程是在30~60 min內(nèi)完成[10]。我們也由此得出該復(fù)方中藥可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式殺傷腫瘤細(xì)胞。

    在體內(nèi),出于對癌細(xì)胞是自身細(xì)胞的變異,雖然跟正常細(xì)胞存在差異,但同時也與正常細(xì)胞有很多相似之處,以及原發(fā)性腫瘤大部分位于內(nèi)臟器官表面或內(nèi)部而并非位于皮下等諸多方面的考慮,我們最終選擇腹腔注射sp2/0細(xì)胞的方式建立BALB/C小鼠的同源腫瘤模型。在我們的研究中,相對于對照組小鼠,實驗組小鼠經(jīng)過治療后腫瘤細(xì)胞的數(shù)量明顯降低,其中2只小鼠未發(fā)現(xiàn)腫瘤。結(jié)果提示,該復(fù)方中藥能抑制腫瘤的形成與生長。為了探究復(fù)方中藥對人腫瘤細(xì)胞的作用,我們開展了該藥對Hela細(xì)胞的細(xì)胞毒試驗,同時該復(fù)方中藥對人腫瘤細(xì)胞的殺傷作用亦得已證實。

    [參考文獻]

    [1] Lin MY,Lee YR,Chiang SY,et al. Cortex moutan induces bladder cancer cell death via apoptosis and retards tumor growth in mouse bladders[J]. Evid Based Complement Alternat Med,2013:207279.

    [2] Lian Z,Niwa K,Gao J,et al. Association of cellular apoptosis with anti-tumor effects of the Chinese herbal complex in endocrine-resistant cancer cell line[J]. Cancer Detection and Prevention,2003,27 (2) :147.

    [3] Wang T,Xuan X,Li M,et al. Astragalus saponins affect proliferation,invasion and apoptosis of gastric cancer BGC-823 cells[J]. Diagnostic Pathology,2013,8:179.

    [4] Lin YL,Lai WL,Harn HJ,et al. The methanol extract of angelica sinensis induces cell apoptosis and suppresses tumor growth in human malignant brain tumors[J]. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine,2013:394636.

    [5] Duan K,Yuan Z,Guo W,et al. LC-MS/MS determination and pharmacokinetic study of five flavone components after solvent extraction/acid hydrolysis in rat plasma after oral administration of Verbena officinalis L. extract[J]. J Ethnopharmacol,2011,135(2):201.

    [6] Hu Y,Wang S,Wu X,et al. Chinese herbal medicine-derived compounds for cancer therapy:A focus on hepatocellular carcinoma[J]. Journal of Ethnopharmacology,2013, 149(3):601.

    [7] 趙益,羅蓉,朱衛(wèi)豐,等. 六味地黃丸對腫瘤細(xì)胞抑制作用的研究[J]. 中藥新藥與臨床藥理,2011,22(6):598.

    [8] 徐小涵,田國慶. 中藥有效成分對結(jié)直腸癌的作用機制實驗研究概況[J]. 中醫(yī)雜志,2015,55(4):347-349.

    [9] 饒斌,余功,謝斌,等. 腫瘤的發(fā)病特點及其陰虛病機歸屬初探[J]. 時珍國醫(yī)國藥,2015,26(6):1435-1437.

    [10] Nancy A,Thornberry,Yuri Lazebnik. Caspases:Enemies Within[J]. Science,1998:281(5381):1312.

    (收稿日期:2015-09-07)

    猜你喜歡
    復(fù)方提取物腹腔
    傷寒桿菌致感染性腹主動脈瘤合并腹腔膿腫1例
    傳染病信息(2022年6期)2023-01-12 08:59:04
    蟲草素提取物在抗癌治療中顯示出巨大希望
    中老年保健(2022年2期)2022-08-24 03:20:44
    中藥提取物或可用于治療肥胖
    中老年保健(2021年5期)2021-12-02 15:48:21
    Anti-hypertensive and endothelia protective effects of Fufang Qima capsule (復(fù)方芪麻膠囊) on primary hypertension via adiponectin/adenosine monophosphate activated protein kinase pathway
    Protective effects of Fufang Ejiao Jiang against aplastic anemia assessed by network pharmacology and metabolomics strategy
    胎兒腹腔囊性占位的產(chǎn)前診斷及產(chǎn)后隨訪
    神奇的落葉松提取物
    HPLC-DAD法同時測定復(fù)方羅布麻片Ⅰ中4種成分
    中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:18:50
    紫地榆提取物的止血作用
    中成藥(2017年10期)2017-11-16 00:50:27
    褪黑素通過抑制p38通路減少腹腔巨噬細(xì)胞NO和ROS的產(chǎn)生
    如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲av成人精品一二三区| 男女国产视频网站| 黄色视频在线播放观看不卡| 日韩电影二区| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲一区中文字幕在线| 国产av一区二区精品久久| 成年美女黄网站色视频大全免费| 精品午夜福利在线看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产欧美亚洲国产| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 黑人欧美特级aaaaaa片| 免费看av在线观看网站| 亚洲在久久综合| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产男人的电影天堂91| 亚洲精品日本国产第一区| 亚洲成人免费av在线播放| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 香蕉国产在线看| 久久影院123| 欧美精品亚洲一区二区| 赤兔流量卡办理| av网站免费在线观看视频| 啦啦啦在线观看免费高清www| 精品国产国语对白av| 熟妇人妻不卡中文字幕| 天天添夜夜摸| av片东京热男人的天堂| 免费日韩欧美在线观看| 午夜免费观看性视频| 大话2 男鬼变身卡| 欧美另类一区| 少妇人妻精品综合一区二区| 黄片小视频在线播放| 亚洲av中文av极速乱| 久久久精品94久久精品| 在线观看www视频免费| 国产精品国产av在线观看| 欧美在线一区亚洲| √禁漫天堂资源中文www| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 天天影视国产精品| 1024视频免费在线观看| av一本久久久久| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产成人一区二区在线| 久久久久精品久久久久真实原创| 最近手机中文字幕大全| 日本欧美视频一区| 视频在线观看一区二区三区| 精品第一国产精品| 男人舔女人的私密视频| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 午夜久久久在线观看| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 在线观看人妻少妇| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 丰满乱子伦码专区| 亚洲三区欧美一区| 女性生殖器流出的白浆| 七月丁香在线播放| 精品国产一区二区久久| 一区二区三区乱码不卡18| 伊人久久国产一区二区| 永久免费av网站大全| 亚洲av福利一区| www日本在线高清视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 制服丝袜香蕉在线| av一本久久久久| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 宅男免费午夜| 99香蕉大伊视频| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 精品久久蜜臀av无| 久久久久精品国产欧美久久久 | 麻豆av在线久日| 久久久精品94久久精品| 在线观看www视频免费| 99国产精品免费福利视频| 国产 一区精品| 久久97久久精品| 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲成色77777| 桃花免费在线播放| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 久久青草综合色| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲国产精品999| 国产一区二区三区av在线| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 夫妻性生交免费视频一级片| xxx大片免费视频| 五月天丁香电影| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| a级毛片在线看网站| 青春草亚洲视频在线观看| 久久久精品区二区三区| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产97色在线日韩免费| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 热99久久久久精品小说推荐| 又大又黄又爽视频免费| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 日韩av在线免费看完整版不卡| 精品第一国产精品| 久久人人97超碰香蕉20202| 波野结衣二区三区在线| 桃花免费在线播放| 韩国av在线不卡| 久久精品国产亚洲av涩爱| 免费观看a级毛片全部| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产野战对白在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 毛片一级片免费看久久久久| 美女中出高潮动态图| 午夜日本视频在线| 嫩草影院入口| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 久久久亚洲精品成人影院| 国产精品一区二区在线不卡| 999精品在线视频| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 操美女的视频在线观看| 欧美日韩精品网址| www.av在线官网国产| 亚洲av男天堂| 国产乱来视频区| 国产精品.久久久| 色吧在线观看| 久久久精品区二区三区| 亚洲成色77777| 啦啦啦在线观看免费高清www| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 99re6热这里在线精品视频| 久久久久精品久久久久真实原创| 97人妻天天添夜夜摸| 久久av网站| 又大又黄又爽视频免费| 在线 av 中文字幕| 91精品三级在线观看| 操美女的视频在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 制服诱惑二区| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 精品久久蜜臀av无| 高清视频免费观看一区二区| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲精品一二三| a级毛片在线看网站| 2018国产大陆天天弄谢| av国产久精品久网站免费入址| 久久久久久人人人人人| 久久天堂一区二区三区四区| 国产福利在线免费观看视频| 亚洲国产av新网站| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲成人一二三区av| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产成人精品久久二区二区91 | 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 在线免费观看不下载黄p国产| 日韩一区二区视频免费看| av在线观看视频网站免费| 亚洲 欧美一区二区三区| 日日啪夜夜爽| 大香蕉久久成人网| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 中文字幕精品免费在线观看视频| 捣出白浆h1v1| 亚洲欧洲日产国产| 男人舔女人的私密视频| 国产精品 国内视频| 黄色毛片三级朝国网站| 熟女av电影| 国产成人免费观看mmmm| 国产亚洲av高清不卡| 看十八女毛片水多多多| 搡老乐熟女国产| 久久久久久人妻| 欧美在线一区亚洲| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产日韩欧美在线精品| 国产精品av久久久久免费| 最新在线观看一区二区三区 | 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产成人av激情在线播放| 精品国产亚洲在线| 岛国视频午夜一区免费看| 桃红色精品国产亚洲av| 两个人看的免费小视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲av美国av| 一区二区三区精品91| 伦理电影免费视频| 亚洲三区欧美一区| 国产成年人精品一区二区| 午夜精品久久久久久毛片777| 一级毛片精品| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 久久久久久大精品| 亚洲在线自拍视频| 久热这里只有精品99| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 曰老女人黄片| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲五月婷婷丁香| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 国产精品九九99| www.精华液| 成人国产一区最新在线观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 超碰成人久久| 成人亚洲精品一区在线观看| 久久人妻av系列| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产国语露脸激情在线看| 在线观看66精品国产| 极品教师在线免费播放| 啦啦啦韩国在线观看视频| 久久狼人影院| 桃色一区二区三区在线观看| 18禁观看日本| 日本 欧美在线| 久久精品国产综合久久久| 1024香蕉在线观看| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲精品一区av在线观看| 久久九九热精品免费| 伦理电影免费视频| 国产精品电影一区二区三区| 真人一进一出gif抽搐免费| 精品久久蜜臀av无| 久久国产亚洲av麻豆专区| 久热爱精品视频在线9| 欧美不卡视频在线免费观看 | 搡老妇女老女人老熟妇| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产精品秋霞免费鲁丝片| xxx96com| 纯流量卡能插随身wifi吗| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 亚洲一区二区三区色噜噜| 长腿黑丝高跟| 久久这里只有精品19| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产成+人综合+亚洲专区| av在线播放免费不卡| 一本久久中文字幕| 可以在线观看毛片的网站| 国产亚洲精品第一综合不卡| 69av精品久久久久久| 亚洲一区二区三区色噜噜| 精品久久久久久,| 欧美日韩福利视频一区二区| 欧美激情久久久久久爽电影 | 曰老女人黄片| 俄罗斯特黄特色一大片| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲成人久久性| 国产高清激情床上av| 日韩精品中文字幕看吧| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲中文av在线| 日本vs欧美在线观看视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 午夜免费激情av| 欧美最黄视频在线播放免费| 99国产极品粉嫩在线观看| 制服丝袜大香蕉在线| 日韩欧美在线二视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 嫩草影院精品99| 午夜日韩欧美国产| 免费少妇av软件| 一边摸一边抽搐一进一小说| 99国产精品99久久久久| 美女免费视频网站| 亚洲五月婷婷丁香| 一级毛片精品| 黄色视频不卡| 窝窝影院91人妻| 国产私拍福利视频在线观看| 黄色片一级片一级黄色片| 国产精品野战在线观看| 在线av久久热| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 神马国产精品三级电影在线观看 | 久久人人爽av亚洲精品天堂| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲成人国产一区在线观看| 女警被强在线播放| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 欧美一级a爱片免费观看看 | 精品久久久久久久人妻蜜臀av | 久久久久国内视频| 一级毛片高清免费大全| 美女午夜性视频免费| 视频在线观看一区二区三区| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 999久久久精品免费观看国产| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 成年女人毛片免费观看观看9| 精品不卡国产一区二区三区| 国产亚洲欧美在线一区二区| 精品午夜福利视频在线观看一区| 999精品在线视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 精品第一国产精品| 日本五十路高清| 亚洲国产欧美一区二区综合| 淫妇啪啪啪对白视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 又大又爽又粗| 国产成人免费无遮挡视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 欧美成人性av电影在线观看| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 丁香欧美五月| 国产亚洲av嫩草精品影院| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产欧美日韩一区二区三| 久久这里只有精品19| 国产精品免费视频内射| 国产一区二区激情短视频| 亚洲av电影不卡..在线观看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 18禁美女被吸乳视频| 9色porny在线观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 中国美女看黄片| 韩国av一区二区三区四区| 久热这里只有精品99| 国产麻豆成人av免费视频| 九色亚洲精品在线播放| 久久精品人人爽人人爽视色| 精品久久久久久成人av| 成人av一区二区三区在线看| 国产成人精品久久二区二区91| 日日夜夜操网爽| 精品人妻在线不人妻| 麻豆国产av国片精品| www日本在线高清视频| 黄色视频不卡| 亚洲avbb在线观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 色播亚洲综合网| 黄色毛片三级朝国网站| 一区福利在线观看| 久9热在线精品视频| 欧美国产精品va在线观看不卡| 日韩欧美三级三区| 成人国语在线视频| 黄色 视频免费看| 51午夜福利影视在线观看| 国产精品一区二区免费欧美| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 十分钟在线观看高清视频www| 在线观看舔阴道视频| 国产在线观看jvid| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 欧美精品啪啪一区二区三区| 长腿黑丝高跟| 国产精品久久电影中文字幕| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 日韩欧美免费精品| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产xxxxx性猛交| 国产亚洲av嫩草精品影院| 色老头精品视频在线观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 成人18禁在线播放| 嫩草影视91久久| 十八禁人妻一区二区| 香蕉久久夜色| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 亚洲中文字幕日韩| 久久中文字幕人妻熟女| 高潮久久久久久久久久久不卡| 啦啦啦免费观看视频1| 免费在线观看黄色视频的| 国产亚洲av高清不卡| 99国产综合亚洲精品| 国产99久久九九免费精品| av欧美777| av福利片在线| 少妇 在线观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 我的亚洲天堂| 午夜影院日韩av| 青草久久国产| 日韩国内少妇激情av| 亚洲av成人av| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产成人欧美| av视频在线观看入口| 看黄色毛片网站| 免费av毛片视频| 在线av久久热| 18禁观看日本| 国产亚洲av嫩草精品影院| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 正在播放国产对白刺激| 国产三级在线视频| 69精品国产乱码久久久| 国产精品1区2区在线观看.| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 欧美一级a爱片免费观看看 | 精品卡一卡二卡四卡免费| 男女床上黄色一级片免费看| 久久伊人香网站| 亚洲精品一区av在线观看| 久久久国产成人免费| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲av熟女| 搡老熟女国产l中国老女人| 天堂动漫精品| 色尼玛亚洲综合影院| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 99香蕉大伊视频| 欧美成人午夜精品| 国产高清有码在线观看视频 | 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 美女扒开内裤让男人捅视频| 嫩草影视91久久| 欧美色视频一区免费| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 91字幕亚洲| 久9热在线精品视频| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产成人精品无人区| 色综合婷婷激情| АⅤ资源中文在线天堂| 九色国产91popny在线| 欧美黑人精品巨大| 日韩高清综合在线| 99精品在免费线老司机午夜| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 亚洲专区字幕在线| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 宅男免费午夜| 国产精品永久免费网站| 国产在线观看jvid| 女人精品久久久久毛片| 999久久久国产精品视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 精品不卡国产一区二区三区| 啪啪无遮挡十八禁网站| 在线观看舔阴道视频| 久久久国产精品麻豆| 精品国产乱子伦一区二区三区| 午夜免费观看网址| 大码成人一级视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 一区在线观看完整版| 久久久久久免费高清国产稀缺| a在线观看视频网站| 国产精品免费视频内射| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 又黄又粗又硬又大视频| 国产av精品麻豆| 精品久久久久久久人妻蜜臀av | 99香蕉大伊视频| 精品国产亚洲在线| 嫁个100分男人电影在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看 | 亚洲成人久久性| 亚洲成av人片免费观看| 国产视频一区二区在线看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲七黄色美女视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 成人精品一区二区免费| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 99精品在免费线老司机午夜| 国产精品一区二区三区四区久久 | 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| www.自偷自拍.com| 99久久国产精品久久久| 亚洲精品国产区一区二| 午夜福利视频1000在线观看 | 日韩高清综合在线| 在线观看免费视频日本深夜| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 精品日产1卡2卡| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产区一区二久久| 日本五十路高清| 两人在一起打扑克的视频| 村上凉子中文字幕在线| 老司机午夜福利在线观看视频| 日本欧美视频一区| 午夜福利成人在线免费观看| 在线观看一区二区三区| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久久久国产欧美日韩av| 女人被狂操c到高潮| 神马国产精品三级电影在线观看 | 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产激情久久老熟女| 色在线成人网| e午夜精品久久久久久久| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲免费av在线视频| 亚洲国产精品999在线| 精品欧美一区二区三区在线| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 丁香欧美五月| 色综合欧美亚洲国产小说| 午夜免费成人在线视频| 在线av久久热| 美女免费视频网站| 国产亚洲欧美精品永久| 日本 av在线| 午夜成年电影在线免费观看| 在线观看一区二区三区| 人妻久久中文字幕网| 亚洲国产看品久久| 日本在线视频免费播放| av欧美777| 亚洲天堂国产精品一区在线| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产成人av激情在线播放| 久久精品影院6| 一区二区三区国产精品乱码| 久久久久久国产a免费观看| 色综合婷婷激情| 制服丝袜大香蕉在线| 欧美精品啪啪一区二区三区| 99国产精品一区二区蜜桃av| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 免费搜索国产男女视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 久久性视频一级片| 999久久久精品免费观看国产| 99在线视频只有这里精品首页| 午夜福利高清视频| 免费不卡黄色视频| 丁香欧美五月| 欧美中文综合在线视频| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲中文av在线| 亚洲av片天天在线观看| 日韩欧美免费精品| 又黄又爽又免费观看的视频| av超薄肉色丝袜交足视频| 亚洲电影在线观看av| 欧美色视频一区免费| www.自偷自拍.com| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| av在线播放免费不卡| svipshipincom国产片| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产亚洲欧美精品永久| 欧美黑人精品巨大| 最近最新中文字幕大全电影3 | 纯流量卡能插随身wifi吗| 操美女的视频在线观看| 亚洲第一av免费看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 91麻豆精品激情在线观看国产| 怎么达到女性高潮| 黄色视频,在线免费观看| 欧美激情久久久久久爽电影 | 亚洲欧美激情在线| 日韩有码中文字幕| 亚洲美女黄片视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 深夜精品福利| 成人精品一区二区免费| 18禁美女被吸乳视频| 精品不卡国产一区二区三区| 久99久视频精品免费| 村上凉子中文字幕在线| 国产精品永久免费网站| 久久精品影院6| 国产伦一二天堂av在线观看| a级毛片在线看网站| 老司机靠b影院| 国产麻豆69| 国产精品香港三级国产av潘金莲| av天堂久久9| 久久久国产精品麻豆| 欧美激情久久久久久爽电影 | 日韩中文字幕欧美一区二区| 日本一区二区免费在线视频| 国产成人系列免费观看| 日本三级黄在线观看|