孕早期應(yīng)用地塞米松對羊胎盤糖皮質(zhì)激素受體的作用

商宏愷 仝進毅

[摘要] 目的 通過觀察羊胎盤糖皮質(zhì)激素受體的變化，研究孕早期應(yīng)用地塞米松對羊胎的影響。 方法 2005～2009年將108只羊隨機分為對照組（生理鹽水2 mL）和地塞米松組（地塞米松0.14 mg/kg肌注），應(yīng)用免疫組化和western blot方法分析GR的表達。于孕50、100、125、140 d收集胎盤。 結(jié)果 在孕50 d和125 d的雌性羊胎，地塞米松增加了總GR蛋白表達量，但在孕125 d的雄性羊胎，地塞米松降低了總GR蛋白表達量。DEX沒有改變GRα蛋白表達量。根據(jù)GRα的表達發(fā)現(xiàn)三種雙核細胞亞型（++，+-，- -）。 結(jié)論 DEX對胎盤的作用是性別依賴的。DEX改變了胎盤對內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素的反應(yīng)。BNC的總體活力可能取決于三種亞型的分布比例。

[關(guān)鍵詞] 地塞米松；胎盤；糖皮質(zhì)激素受體；雙核細胞；性別依賴

[中圖分類號] R715.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）33-0028-04

對有早產(chǎn)跡象的孕婦應(yīng)用合成糖皮質(zhì)激素能顯著降低新生兒死亡率和呼吸窘迫綜合征發(fā)生的可能性[1，2]。在孕早期，糖皮質(zhì)激素還可以應(yīng)用于先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥的治療[3]。雖然現(xiàn)在已經(jīng)有很多關(guān)于孕晚期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素的研究，但仍缺乏關(guān)于孕早期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素的治療相關(guān)研究。雙核細胞（BNC）是羊胎盤滋養(yǎng)細胞中具有分泌功能的細胞，能夠分泌胎盤生乳素，從而對胎兒的生長發(fā)育起到重要作用[4]。糖皮質(zhì)激素的作用需要通過糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）的介導[5]。GR有2個亞型，分別為GRα和GRβ。GRα是配體依賴性亞型，被認為是功能型受體，而GRβ為非配體依賴性，可能對GRα起到調(diào)節(jié)作用[6]。本研究觀察羊孕早期應(yīng)用地塞米松對GR的分布和GR蛋白表達量的影響。我們假設(shè)糖皮質(zhì)激素的作用是性別特異性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

所有實驗都經(jīng)過倫理委員會的批準。在2005年1月～2009年12月期間懷有單胎的108只羊被分為對照組（n=59）和地塞米松組（DEX組，n=49）。對照組于孕50 d、100 d、125 d和140 d予2 mL的生理鹽水，DEX組則予0.14 mg/kg 的地塞米松（H02AB02，Mayne Pharma，Australia）肌注，每12小時一次，共4次。此后取出羊胎盤，并放入液氮中速凍保存，或放入福爾馬林溶液用于制作病理切片。

1.2 GRt、GRα和GRβ的定位

使用免疫組織化學染色GRt、GRα和GRβ。用兔抗人GRt抗體（MA1-510，Thermo Scientific，USA），濃度為1∶50或兔抗人GRα抗體（P-20：sc1002，Santa Cruz，USA），濃度為1∶100或兔抗人GRβ抗體（PA3-514，Thermo Scientific，USA），濃度為1∶100孵育24 h后，再用抗兔二抗（PK-4001 Vectastain ABC kit，Vector Laboratories，USA），濃度為1∶200孵育1 h。共設(shè)置3組陰性對照組：①僅使用一抗孵育；②僅使用二抗孵育；③僅用稀釋液孵育。

1.3 GRt、GRα和GRβ的蛋白定量

取80 mg胎盤組織放入裂解液中，在冰上用電動勻漿器充分勻漿，12000×g，4℃低溫離心15 min，收取蛋白。取80 μg蛋白加上5×上樣緩沖液煮沸10 min。在6%SDS-Page凝膠上進行電泳后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，再用5%牛奶封閉1 h。將一抗稀釋（GRt 1∶1000，GRα 1∶200，GRβ 1∶200）過夜孵化；PBS-T漂洗后按1∶1000比例稀釋二抗，室溫孵育1 h。應(yīng)用ECL發(fā)光液（32209，Thermo Scientific，USA）顯影后用凝膠成像儀成像。顯影完畢后，徹底沖洗，按之前步驟孵育多克隆β-actin一抗（107K4800，Sigma，USA）抗體濃度1∶20000，二抗使用HRP標記的山羊抗兔IgG（1∶20000，31458，Thermo Scientific，USA），再次顯影、成像。使用Quantity One軟件分析灰度比值，從而得出GRt、GRα和GRβ的蛋白相對表達量。將GRt的電泳條帶切下后送專業(yè)公司進行蛋白結(jié)構(gòu)分析。GRα和GRβ的蛋白特異性用公司配套的特異性阻斷劑檢驗（GRα阻斷劑：sc-1002 P，Thermo Scientific，USA；GRβ阻斷劑：PEP-222，Thermo Scientific，USA）。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件，正態(tài)分布變量以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

與之前研究結(jié)果相同，GRt和GRα分布于羊胎盤滋養(yǎng)細胞的細胞核與細胞質(zhì)[7]。GR的分布不依賴于孕周、羊胎的性別以及是否給予地塞米松治療。未發(fā)現(xiàn)有GRβ分布于羊胎盤中。此外，GRα的免疫組化染色發(fā)現(xiàn)了三種新的雙核細胞亞型：兩個細胞核均表達GRα（++），兩個細胞核均不表達GRα（- -），一個細胞核表達GRα，另一個細胞核不表達GRα（+-）（封三圖4A、4B）。

使用Western Blot測定GRt的蛋白，可在97-kDa處探測到單一的條帶，將該條帶取出后進行蛋白測序證實為GRt（Genbank：EU371026.1）。在對照組中，羊胎為雄性的胎盤GRt蛋白表達量在孕125 d為最高，然后開始持續(xù)降低（圖1A）。而在羊胎為雌性的胎盤中GRt蛋白表達量在整個孕周無明顯變化。在孕50 d和孕125 d且羊胎為雌性的胎盤中，DEX組GRt蛋白表達量明顯高于對照組[孕50 d：（0.417±0.041） vs （0.887±0.235），P<0.05；孕125 d，（0.638±0.093） vs （1.070±0.152），P<0.05]。在孕125 d且羊胎為雄性的胎盤中，DEX組GRt蛋白表達量明顯低于對照組[（0.671±0.130） vs （1.127±0.118），P<0.05]。

使用Western Blot測定GRα的蛋白，可在95-kDa處探測到單一的條帶，該條帶能夠被GRα阻斷劑所抑制。在對照組的孕140 d，GRα的蛋白表達量最低（圖1B）。DEX沒有改變GRα的蛋白表達量，與先前的研究類似，使用Western Blot測定GRβ的蛋白，可在97-kDa處探測到單一的條帶，然而該條帶并不能被GRβ阻斷劑抑制。

3討論

孕早期應(yīng)用DEX能夠?qū)μケP的發(fā)育和功能以及胎兒的生長產(chǎn)生一過性的影響，該影響因胎兒的性別而有所不同。在雌性胎兒的胎盤中，DEX能顯著增加孕中期（孕50和125 d）GRt蛋白表達量，但在雄性胎兒的胎盤中，DEX能顯著降低孕中期（孕125 d）GRt的表達量。GRα的蛋白表達量沒有受到DEX治療的影響。

糖皮質(zhì)激素對GR的作用因不同的實驗方案和不同的實驗對象而有所不同[8-10]。在Hella S3系細胞中，給予DEX 24 h、48 h和2周后，均能顯著降低GR的mRNA表達量，而當清除DEX后，這種效果就不復存在[11]。若給予長達2年的慢性DEX刺激，GR的mRNA和蛋白表達量均無明顯變化[11]，提示治療時間的長短對于GR有不同的作用。在羊胎盤上的研究表明，將地塞米松直接注入到胎兒體內(nèi)，會增高GRα的蛋白表達量，但卻不會改變GRt蛋白表達量[12]。此外，在人胎盤中，產(chǎn)前應(yīng)用倍他米松沒有改變GRt和GRα的表達[13]。

在本研究中，按照孕周和胎兒性別分組，我們成功地檢測了各小組的GRt和GRα蛋白表達。在雌性胎兒的胎盤中，GRt蛋白量在整個孕周都無明顯變化，但在雄性胎兒的胎盤中，GRt蛋白表達在孕125 d最高，此后顯著下降。所有羊胎盤中，GRα蛋白表達量在孕140 d是最低的，其原因可能是接近分娩時的內(nèi)源性皮質(zhì)激素高峰對胎盤功能的抑制有關(guān)。在雌性胎兒中，早期應(yīng)用DEX顯著增加了孕中期（孕50 d和孕125 d）GRt蛋白表達量，但在雄性胎兒中，DEX顯著降低孕中期（孕125 d）GRt蛋白表達量。這可能提示雌性胎兒更傾向于保持GC的敏感性，或許是為了保持生殖能力和種族延續(xù)，而雄性胎兒在遇到升高的GC時，選擇降低GC的敏感性。在既往的動物和人體研究中均曾發(fā)現(xiàn)這種性別依賴性改變，如早期給予DEX治療，會導致雌性胎兒的頂臀長和體重暫時的下降，增加胎盤中的細胞凋亡[14，15]；Saif等[16]發(fā)現(xiàn)在糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)路徑中，存在性別差異，同時臍血的糖皮質(zhì)激素水平也有性別差異，提示雄性可能容易對糖皮質(zhì)激素產(chǎn)生抵抗，而雌性則對糖皮質(zhì)激素更敏感。

采用Gupta等[12]研究中所用的GRβ抗體，我們沒能檢測到胎盤中GRβ的表達，與Root等[17]的結(jié)果相同。在我們的研究中，97-kDa處的條帶顯示非常弱，并且不能被GRβ阻斷劑所抑制，因而我們認為在羊胎盤中，GRβ的表達量可能非常低，或者先前文章中提到的GRβ條帶其實是非特異性的。在最近的一項研究中，Saif等[16]在人胎盤中發(fā)現(xiàn)了12個GR亞型，這些亞型分布因不同的細胞、不同胎兒性別而有所不同，其中一些亞型不在每個人中都有分布。因此，我們的研究結(jié)果可能提示其他GR亞型也在羊胎盤中存在，這也能解釋為什么GRt蛋白發(fā)生了變化而GRα蛋白量卻未受到影響。

既往研究表明BNC的分布會影響OPL等蛋白的表達[18]。我們的研究根據(jù)是否表達GRα，可將BNC分為三種新的亞型。然而這三種亞型有什么不同的功能，目前還知之甚少。至今為止，人們普遍認為BNC可能是來自于一個單核細胞的特殊分裂形式（僅細胞核分裂而細胞質(zhì)不分裂）[19，20]。但最近有研究報道，在人腦中BNC的形成來自于兩個單核細胞相互融合[21]。因此這三種不同形式的BNC可能代表了一個BNC的不同發(fā)育階段。我們假設(shè)（++）是一種“功能型”或“成熟的”BNC，（- -）是“無功能型”或是“未成熟型”BNC，而（+-）則是“中間型”BNC。而BNC的總體活性可能取決于這三種細胞的分布比例。

綜上所述，發(fā)現(xiàn)三種不同BNC亞型，三種亞型的分配比例可能決定了BNC的整體活性。我們的研究揭示了內(nèi)源性GC和（或）外源性GC能通過GR對胎兒和胎盤發(fā)育造成影響。通過觀察糖皮質(zhì)激素的治療對胎盤細胞功能的影響，我們的研究還為人們對胎盤應(yīng)對外界變化中所處的角色研究提供了新的認識。

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（收稿日期：2015-10-09）