脫氫紫堇堿對高糖培養(yǎng)心肌成纖維細胞Wnt信號通路的影響

脫氫紫堇堿對高糖培養(yǎng)心肌成纖維細胞Wnt信號通路的影響

韓路拓1，2，任鈞國1*，劉建勛1，王偉明2，楊佳妹1，劉馨雨1

(1.中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所中藥藥理北京市重點實驗室，北京 100091;

2.黑龍江省中醫(yī)藥科學院，哈爾濱 150036)

摘要：目的采用體外高糖培養(yǎng)心肌成纖維細胞(CFs )的方法，觀察脫氫紫堇堿(DHC)對高濃度葡萄糖培養(yǎng)的心肌成纖維細胞Wnt信號通路的影響。方法采用體外高糖誘導(dǎo)心肌成纖維細胞增殖模型, western blot法檢測β-catenin,GSK-3β以及P-GSK-3β的蛋白表達水平；ELISA法觀察細胞分泌TGF-β1蛋白的能力。結(jié)果脫氫紫堇堿可以抑制β-catenin的表達(P<0．01),上調(diào)P-GSK-3β的表達(P <0．05)，減少TGF-β1的合成(P <0．01)。結(jié)論脫氫紫堇堿能抑制Wnt信號通路的異常表達，具有潛在的抗心肌纖維化作用。

關(guān)鍵詞：脫氫紫堇堿；高糖；心肌成纖維細胞；Wnt信號通路

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.11.025

中圖分類號：R542.2文獻標志碼： A

基金項目：國家自然科學基金資助項目(H2809)。

作者簡介：韓路拓(1986-)，女，碩士，主要從事細胞藥理學研究。

收稿日期:(責任編輯：張瑞彬2014-12-21)

*通信作者：任鈞國，電子信箱-reek2003@163.com

Dehydrocorydaline on Wnt signal pathway of cardiac fibroblasts cultured by high glucose

HAN Lutuo1,2, REN Junguo1*，LIU Jianxun1，WANG Weiming2, YANG Jiamei1, LIU Xinyu1

(1.Institute of Basic Medical Sciences of Xiyuan Hospital China Academy of Chinese Medical Sciences，

Beijing Key Laboratory of Pharmacology of Chinese Materia, Beijing 100091 , China;

2.Traditional Chinese Medicine Institute of Heilongjiang Chinese Medicine Academy of Sciences,

Harbin 150036, China)

Abstract：ObjectiveTake the method of cultured cardiac fibroblasts (CFs) in vitro, to observe the effect of Dehydrocorydaline on high glucose cultured cardiac fibroblasts of Wnt signal pathway. MethodsBy the cardiac fibroblasts model in vitro induced by high glucose, detection of the expression level of β-catenin, GSK-3β, P-GSK-3β by western blot; to observe the ability of the cell TGF-β1 protein secretion by ELISA method . ResultsDehydrocorydaline can inhibit the expression of β-catenin (P<0.01), upregulate the expression of P-GSK-3β (P <0.05), reduction of the synthesis of TGF- β1 (P <0.01). ConclusionDehydrocorydaline can inhibit of abnormal expression of Wnt signaling pathway , have potential effects of anti myocardial fibrosis.

Keywords：Dehydrocorydaline; high glucose; cardiac fibroblasts; Wnt signal pathway

糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病最常見的心血管并發(fā)癥之一，心肌物質(zhì)和能量代謝改變，是糖尿病心肌病發(fā)生的重要環(huán)節(jié)[1]，心肌纖維化是其病變的關(guān)鍵[2]。研究表明，Wnt信號通路在心臟發(fā)育和血管生成中有重要作用，在心臟發(fā)育早期，Wnt信號通路的激活可以促進心臟祖細胞增殖和遷移，在心臟發(fā)育晚期，抑制其活性則可促進心肌細胞分化[3]。因此，抑制Wnt信號的異常激活，可作為防治糖尿病心肌纖維化的一個手段。 延胡索，又名元胡，是一種臨床常用中藥，其現(xiàn)代藥理作用研究主要集中于心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)。延胡索的主要活性成分為生物堿類，脫氫紫堇堿(DHC)又稱去氫延胡索甲素，是其中的一種季胺類生物堿。筆者前期實驗研究已表明，脫氫紫堇堿干預(yù)高糖培養(yǎng)的心肌成纖維細胞后，對細胞的增殖、細胞S期分裂都有明顯抑制作用，還可以明顯降低I型、Ⅲ型膠原的分泌能力[4]。為進一步研究其作用機制，本實驗采用體外高糖培養(yǎng)的心肌成纖維細胞模型，觀察脫氫紫堇堿對心肌成纖維細胞Wnt信號通路的影響。

1實驗材料

1.1實驗動物SD大鼠乳鼠20只，出生24 h內(nèi)，SPF級,雌雄不限,購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：11400700012085，11400700019526。

1.2主要試劑和儀器胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶均為Sigma公司進口分裝產(chǎn)品。脫氫紫堇堿對照品(北京鑫方程生物公司,批號120930,20 mg)，卡托普利對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號100318-201103，100 mg)。TGF-β1 ELISA試劑盒(美國RD公司)，小鼠抗波形蛋白單克隆抗體和小鼠抗結(jié)蛋白單克隆抗體(Biogenes公司)，PVDF膜(北京智杰方遠科技有限公司)，ECL發(fā)光液(美國賽默飛世爾科技有限公司)。DMEM高糖培養(yǎng)基，DMEM低糖培養(yǎng)基和胎牛血清(FCS)均為GIBCO公司產(chǎn)品。兔抗大鼠-catenin單克隆抗體，兔抗大鼠-GSK-3β單克隆抗體，兔抗大鼠-P-GSK-3β單克隆抗體，兔抗大鼠GAPDH多克隆抗體及羊抗兔多克隆抗體均為美國abcam公司產(chǎn)品。酶聯(lián)免疫分析儀(美國BioTek公司)，Western成像系統(tǒng)(美國伯樂公司)。其他常用生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

2實驗方法

2.1差速貼壁法體外培養(yǎng)心肌成纖維細胞及鑒定參照 SREEJIT P等[5]的方法加以改進,取出生24 h內(nèi)的SD大鼠乳鼠，無菌條件下，開胸后快速摘取心臟，浸泡在預(yù)冷的0．01% 磷酸鹽緩沖液中，以除去血細胞。75% 的酒精浸泡30 s后，將其剪成1 mm3大小的碎塊，棄去緩沖液，加入等體積的0．1%的Ⅱ型膠原酶和0．125%的胰蛋白酶，于37 ℃水浴反復(fù)振蕩消化，直至組織塊消化完全，分別收集每次的消化懸液。用含10%FCS的DMEM低糖培養(yǎng)液來終止消化，將收集的消化懸液離心(2 000 r/min，10 min)，上清棄去，再加入含10% FCS的DMEM低糖培養(yǎng)基，吹打成細胞懸液，接種至培養(yǎng)瓶，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。根據(jù)心肌成纖維細胞(CFs)和心肌細胞貼壁時間的不同，采用差速貼壁分離法，貼壁60 min后棄上清，剩下的則應(yīng)為CFs，加入含10% FCS的DMEM低糖培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。經(jīng)免疫組化鑒別，波形蛋白染色呈陽性和結(jié)蛋白染色為陰性，判斷所得細胞為所需的心肌成纖維細胞，純度達98%，臺盼蘭染色細胞活力大于90%。待80%～90%細胞融合后，用0．25%胰酶消化傳代(1∶2)，實驗采用2～4代細胞。

2.2實驗分組將心肌成纖維細胞分為正常對照組：DMEM低糖培養(yǎng)基(內(nèi)含5．5 mmol/L D-葡萄糖)，模型對照組：DMEM高糖培養(yǎng)基(內(nèi)含25 mmol/L D-葡萄糖)，脫氫紫堇堿組(100、50 mg/L)，卡托普利組(22 mg/L)。

2.3ELISA法檢測TGF-β1蛋白含量取CFs制成細胞懸液，按 1×105個/mL的細胞密度接種于6孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，換無血清DMEM同步化24 h，按實驗分組處理后，培養(yǎng)48 h分別吸取細胞上清液，嚴格按照試劑盒說明檢測TGF-β1的含量，450 nm處檢測吸光度(A)，根據(jù)濃度曲線，計算每孔內(nèi)蛋白濃度。

2.4Western-blot法檢測β-catenin, GSK-3β, P-GSK-3β的蛋白表達細胞總蛋白的提取：取分組處理培養(yǎng)后的心肌成纖維細胞，加入蛋白裂解液，置于冰浴上30 min，細胞刮刀刮取裂解液，離心(2 000 r/min，30 min)后，收集上清液，紫外分光光度儀檢測蛋白含量，根據(jù)標準曲線計算樣本濃度；調(diào)整濃度后，加入上樣緩沖液，蛋白煮沸3 min后，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩DS-聚丙烯酰胺凝膠電泳：經(jīng)電泳分離蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，含5%牛血清白蛋白的TBST室溫封閉30 min后，一抗孵育20 min，4 ℃冰箱過夜。復(fù)溫后，洗膜5×10 min/次，封閉30 min，加二抗封閉90 min后，洗膜5×10 min/次，加入ECL發(fā)光液，于成像系統(tǒng)曝光、采集圖像。

3實驗結(jié)果

3.1乳鼠心肌成纖維細胞的培養(yǎng)與鑒定 乳鼠心肌成纖維細胞增殖明顯，2～3 d即呈融合狀態(tài)。細胞多呈長梭形，多角形，排列緊密，胞體較大，細胞質(zhì)透明，細胞核呈橢圓形，顏色淡，通常含 2～3個核，無自發(fā)性搏動。波形蛋白免疫熒光鑒別顯示，心肌成纖維細胞的波形蛋白呈陽性反應(yīng)，結(jié)蛋白呈陰性反應(yīng)。

3.2脫氫紫堇堿對TGF-β1分泌的影響見表1。結(jié)果顯示，與正常對照組比較，高糖可以明顯誘導(dǎo)心肌成纖維細胞合成分泌TGF-β1(P<0．01)。與模型對照組比較，卡托普利和100、50 mg/L脫氫紫堇堿均可明顯抑制TGF-β1的合成分泌(P<0．01)。

表1　 脫氫紫堇堿對TGF-β1合成的影響

注：與正常對照組比較,##P< 0．01，與模型對照組比較,△△P<0．01

3.3脫氫紫堇堿對β-catenin及P-GSK-3β蛋白表達的影響見表2。結(jié)果顯示,與正常對照組比較，高糖可以誘導(dǎo)心肌成纖維細胞β-catenin 表達升高(P<0．05)，下調(diào)P-GSK-3β蛋白的表達(P<0．05)。與模型對照組比較，100、50 mg/L脫氫紫堇堿可明顯抑制β-catenin的表達(P<0．01)，100 mg/L 脫氫紫堇堿可明顯增加P-GSK-3β的表達上調(diào)(P<0．05)，50 mg/L脫氫紫堇堿對P-GSK-3β的表達無統(tǒng)計學意義(P>0．05)；卡托普利可以抑制β-catenin的表達(P<0．05)，對P-GSK-3β的作用差異無統(tǒng)計學意義 (P>0．05)。

組 別濃度/(mg/L)β-catenin蛋白/(ROD)P-GSK-3β蛋白/(ROD)正常對照組 —0.312±0.063 0.428±0.048 模型對照組 —0.482±0.052# 0.265±0.074#脫氫紫堇堿組1000.140±0.015△△0.467±0.043△ 500.224±0.025△△0.243±0.121 卡托普利組 220.253±0.014△△0.473±0.151

注：與正常對照組比較#P< 0.05，與模型對照組比較△P< 0．05, △△P<0．01

4討論

糖尿病心肌病在持續(xù)高糖的始動因素[6]作用下，導(dǎo)致外周血中血管緊張素Ⅱ增多[7]，心臟間質(zhì)Ⅰ、Ⅲ型膠原的降解異常[8]，降低單核細胞趨化因子的活化及表達[9]，在此過程中出現(xiàn)心肌細胞外基質(zhì)的大量沉積，這些可能與心肌纖維化有著非常密切的關(guān)系。近些年，中醫(yī)和中西醫(yī)結(jié)合治療該病的研究比較深入，取得了很多有價值的成果[10-12]。

延胡索是活血化瘀藥的代表藥，味辛、苦，性溫，歸心、肝、脾經(jīng)，功效為活血、行氣、止痛，臨床多用于氣血瘀滯痛證，跌打損傷；且還有鎮(zhèn)痛，鎮(zhèn)靜，催眠作用。現(xiàn)代藥理研究表明其主要作用于心血管系統(tǒng)，藥效物質(zhì)為生物堿類成分，DHC為主要有效成分。研究[13]表明DHC具有減輕心肌缺血再灌注損傷，擴張冠狀動脈，降低耗氧量，抑制血小板聚集，改善微循環(huán)等藥理作用[14]。在前期實驗的基礎(chǔ)上，本實驗采用體外高糖誘導(dǎo)的心肌成纖維細胞模型，觀察脫氫紫堇堿對于心肌成纖維細胞TGF-β1蛋白表達及Wnt通路的影響，來探討脫氫紫堇堿防治糖尿病心肌纖維化的作用機制。TGF-β1是最重要的促進纖維化生長的因子，具有多功能的細胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，在細胞外基質(zhì)合成、識別、增殖、凋亡及特殊分化中發(fā)揮了重要作用[15]。TGF-β1能夠促進心肌成纖維細胞合成纖維蛋白及Ⅰ、Ⅲ型膠原等，增加了心肌組織細胞外基質(zhì)的合成，抑制了膠原降解，同時也是各種因素致心肌纖維化的共同通路[16]。

Wnt/β-catenin信號通路是調(diào)控細胞生長和增殖的重要途徑，Wnt信號通路的異常激活可以導(dǎo)致纖維增生等疾病的發(fā)生，在Wnt信號經(jīng)典通路Wnt/β-catenin中，β-catenin處于中心位置，是一種多功能的胞漿蛋白，參與細胞的黏附、遷移及上皮間質(zhì)的轉(zhuǎn)化、生長、分化、凋亡等過程，從而在胚胎發(fā)育、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和器官形成等諸多方面起到重要作用[17]。而GSK-3β等是負向調(diào)節(jié)因素，通過GSK-3β的磷酸化及泛素蛋白酶體系統(tǒng)進而降解，使之游離在胞漿保持較低濃度，無法轉(zhuǎn)運到細胞核內(nèi)產(chǎn)生生物學效應(yīng)[18]，GSK-3β通過抑制Wnt通路，調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和凋亡[19]。β-catenin在細胞內(nèi)的數(shù)量和狀態(tài)對該途徑有決定性影響，因此被認為是該信號途徑激活的標志[20]。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，該成分作用于高糖培養(yǎng)的心肌成纖維細胞后，能夠降低TGF-β1的分泌，表明脫氫紫堇堿不僅能夠抑制心肌成纖維細胞的增殖，還可以降低其合成與分泌蛋白的能力，進而能夠抑制糖尿病心肌纖維化。實驗研究也表明，在分子水平上，高糖可以上調(diào)β-catenin的表達，抑制P-GSK-3β的高表達。說明高糖環(huán)境下，兩條通路之間可能存在一定的相互作用。實驗結(jié)果顯示脫氫紫堇堿可以抑制β-catenin的表達，上調(diào)P-GSK-3β的異常表達，說明該成分能夠阻斷Wnt/β-catenin信號通路；同時該成分可以抑制TGF-β1蛋白的表達水平，說明脫氫紫堇堿可能同時能夠抑制TGF-β1通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

綜上所述，脫氫紫堇堿是一種具有潛在治療糖尿病心肌纖維化的有效成分，有關(guān)其深入的作用機制值得進一步研究，為糖尿病心肌纖維化的防治提供指導(dǎo)。

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