超聲輔助提取對(duì)石榴籽提取物抗氧化活性的影響

超聲輔助提取對(duì)石榴籽提取物抗氧化活性的影響

顏紅梅，趙文英，張萍萍

(青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266042)

摘要：研究提取方法對(duì)石榴籽提取物抗氧化活性的影響。以無水乙醇為溶劑，分別采用超聲法、回流法、加壓法、超聲輔助回流法、超聲輔助加壓法以及超臨界法提取石榴籽中抗氧化活性成分，并對(duì)其清除DPPH自由基的能力、清除羥基自由基的能力、還原能力、脂質(zhì)過氧化的抑制能力進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，超聲輔助回流法和超聲輔助加壓法所得石榴籽提取物的抗氧化能力相對(duì)于其它方法均有明顯提高，尤其對(duì)DPPH自由基的清除率分別高達(dá)92.1%和80.2%。超聲輔助能顯著提高石榴籽提取物的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：石榴籽提取物；抗氧化能力；提取方法；超聲輔助

收稿日期：2015-05-14

作者簡(jiǎn)介：顏紅梅(1989-)，女，山東棗莊人，碩士研究生，研究方向：中藥現(xiàn)代化，E-mail:626537341@qq.com；通訊作者：趙文英，副教授，E-mail：wyzhao0059@aliyun.com。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2015.09.011

中圖分類號(hào)：R 284.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

石榴籽是藥食兩用的石榴科植物石榴的種子，可抵抗人體炎癥和氧自由基的破壞，具有延緩衰老、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、減緩癌變進(jìn)程、防治乳腺癌、降低血糖、治療腹瀉等作用。這些生理藥理活性均與其所含抗氧化成分(多酚類、不飽和脂肪酸類)相關(guān)[1-3]。有研究者對(duì)石榴籽提取物、石榴籽中多酚以及石榴籽油進(jìn)行了提取及體外抗氧化作用研究[2，4-5]。

目前，人們對(duì)石榴籽的研究大都采用單一方法提取并考察提取物的抗氧化活性，而采用不同提取方法對(duì)石榴籽提取物抗氧化活性影響的研究報(bào)道較少[6-7]。苗利利等[8]研究了不同提取方法對(duì)石榴籽油中的有效成分(石榴酸)含量的影響，證明提取方法對(duì)石榴酸含量會(huì)產(chǎn)生影響，但不同提取方法對(duì)其抗氧化活性的影響尚未進(jìn)行研究。為系統(tǒng)考察提取方法對(duì)石榴籽提取物抗氧化活性的影響，作者以無水乙醇為溶劑，分別采用超聲法、回流法、加壓法、超聲輔助回流法、超聲輔助加壓法及超臨界法等方法對(duì)石榴籽進(jìn)行提取，并對(duì)提取物的體外抗氧化活性進(jìn)行分析與比較，以期選出最適合提取石榴籽中抗氧化活性成分的有效方法。

1實(shí)驗(yàn)

1.1　材料、試劑與儀器

石榴籽，購于棗莊，干燥粉碎后過40目篩。

DPPH (1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)，美國(guó)Sigma公司；鐵氰化鉀，天津博迪化工股份有限公司；三氯乙酸、磷酸氫二鈉，上海埃彼化學(xué)試劑有限公司；亞油酸，上海伊卡生物技術(shù)有限公司；2-硫代巴比妥酸，阿拉丁試劑有限公司；水楊酸，中國(guó)亨達(dá)精細(xì)化學(xué)品有限公司(上海)；磷酸二氫鈉，天津廣成化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇；超純水。其余試劑均為分析純。

KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；T-6型新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)，普析通用儀器有限責(zé)任公司；DZF-6051型真空干燥箱，上海一恒科技有限公司；高速萬能粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司；加壓提取器，自制；HA221-50-06型超臨界萃取裝置，江蘇南通儀創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2　方法

1.2.1石榴籽提取物的制備

1)超聲法

將石榴籽粉與無水乙醇(料液比1∶30，g∶mL，下同)在100 Hz頻率下超聲30 min，回收溶劑后得超聲法下的石榴籽提取物。

2)回流法

將石榴籽粉與無水乙醇(料液比1∶30)于回流裝置中加熱回流2 h，回收溶劑后得回流法下的石榴籽提取物。

3)加壓法

將石榴籽粉與無水乙醇(料液比1∶30)于自制加壓提取器中在100 ℃、0.25 MPa條件下提取30 min，回收溶劑后得加壓法下的石榴籽提取物。

4)超聲輔助回流法

將石榴籽粉與無水乙醇(料液比1∶30)超聲30 min后，將料液混合物按回流法提取1 h，得超聲輔助回流法下的石榴籽提取物。

5)超聲輔助加壓法

將石榴籽粉與無水乙醇(料液比1∶30)超聲30 min后，將料液混合物按加壓法提取30 min，得超聲輔助加壓法下的石榴籽提取物。

6)超臨界法

將石榴籽粉在CO2超臨界流體萃取裝置中以萃取壓力20 MPa、分離壓力5 MPa、提取釜溫度40 ℃、無水乙醇作夾帶劑的條件下萃取2 h，得超臨界法下的石榴籽提取物。

1.2.2石榴籽提取物抗氧化活性的測(cè)定

1)DPPH自由基清除能力

分別精密稱定10 mg各提取方法下得到的石榴籽提取物于100 mL容量瓶中，加無水乙醇定容，搖勻備用。

將上述各溶液分別配制成不同濃度(0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1)的溶液，按表1加樣，總體積為4 mL，在室溫下避光反應(yīng)30 min后在517 nm處測(cè)定各樣品溶液的吸光度(A)。每組樣品溶液平行測(cè)定3次，取平均值[9]。

表1DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)加樣表

Tab.1Sample table of DPPH radical scavenging test

加樣溶液測(cè)定項(xiàng)目2.5mLDPPH溶液+1.5mL無水乙醇溶液A02.5mLDPPH溶液+1.5mL待測(cè)樣品溶液Ai2.5mL無水乙醇溶液+1.5mL待測(cè)樣品溶液Aj

DPPH自由基清除率(Y)按式(1)計(jì)算：

Y=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

(1)

式中：A0為未加樣品溶液時(shí)所測(cè)溶液吸光度；Ai為加入樣品溶液后所測(cè)溶液吸光度；Aj為未加DPPH溶液的樣品溶液吸光度。

2) 羥基自由基清除能力

采用Fenton分光光度法進(jìn)行測(cè)定[10]。向試管中加入一系列不同提取方法下的不同濃度(0.2 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1)石榴籽提取液1.0 mL、FeSO4溶液 (1.8 mmol·L-1) 2.0 mL、水楊酸的乙醇溶液(1.8 mmol·L-1) 1.5 mL?？瞻滓?.0 mL蒸餾水代替樣品溶液，最后加入H2O2(0.03%)0.1 mL啟動(dòng)反應(yīng)。振蕩混勻，37 ℃水浴中反應(yīng)30 min，在510 nm處測(cè)定吸光度(A)。

羥基自由基清除率(D)按式(2)計(jì)算：

D=[(A0-As)/A0]×100%

(2)

式中：A0為空白溶液的吸光度；As為加入樣品溶液后的吸光度。

3)還原能力

采用K3[Fe(CN)6]還原法進(jìn)行測(cè)定[11]。分別取不同提取方法下的不同濃度(0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1)石榴籽提取液1 mL于試管中，各加入PBS溶液(0.2 mol·L-1，pH值 6.6)2.5 mL和1%的K3[Fe(CN)6]溶液2.5 mL,混合均勻，于50 ℃水浴中反應(yīng)25 min。再分別加入2.5 mL 10%的三氯乙酸，混合均勻。各取上清液2.5 mL，分別加入1.0 mL 0.1%的FeCl3溶液和2.5 mL蒸餾水，混合均勻。以5.0 mL蒸餾水與1.0 mL 0.1%的FeCl3混合溶液作空白。10 min后于700 nm處測(cè)定吸光度(A)。

4)脂質(zhì)過氧化的抑制作用

取2.5%的亞油酸乙醇溶液1 mL于帶塞試管中，分別加入不同提取方法下的不同濃度(0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1)石榴籽提取物0.5 mL，加入25 mmol·L-1的FeSO4溶液1 mL， 以PBS溶液(0.1 mol·L-1，pH值 7.4 )補(bǔ)充至10 mL，于40 ℃恒溫箱中避光培養(yǎng)24 h。取培養(yǎng)后樣品溶液2 mL分別加入0.2 mL 20% 三氯乙酸溶液，靜置10 min后，加入1%的硫代巴比妥酸溶液1 mL，混合均勻。加塞后置于沸水浴中反應(yīng)15 min，于532 nm處測(cè)定吸光度(A)。對(duì)照管除不加樣品溶液外其它均相同，空白管以PBS溶液代替樣品溶液[12]。

脂質(zhì)過氧化抑制率按式(3)計(jì)算：

脂質(zhì)過氧化抑制率=[(A0-A)/A]×100%

(3)

式中：A0為對(duì)照管所測(cè)吸光度；A為加樣品溶液后所測(cè)吸光度。

2結(jié)果與討論

2.1　DPPH自由基清除率

不同提取方法下的石榴籽提取物對(duì)DPPH自由基的清除率如圖 1所示。

圖1　DPPH自由基清除能力的比較 Fig.1　Comparison of DPPH free radical scavenging capacity

由圖1可知，除超臨界法外，其余方法的石榴籽提取物的DPPH自由基清除率在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)均呈增長(zhǎng)的趨勢(shì)。并且超聲輔助回流法與超聲輔助加壓法相對(duì)于單一的回流法與加壓法下的DPPH自由基清除率均有顯著的提高。

DPPH含有三個(gè)苯環(huán),在517 nm處具有最大吸收，當(dāng)有供氫能力的抗氧化劑(如酚類)存在時(shí)，可以通過吸光度的變化來檢測(cè)試樣的抗氧化能力[13]。在超臨界法中，CO2為非極性溶劑，極性相對(duì)較弱的脂質(zhì)類物質(zhì)易被溶解提取，而極性較大的物質(zhì)(如酚類)較難被溶解提取，因而導(dǎo)致提取物對(duì)DPPH自由基的清除率偏低。超聲輔助加壓法與超聲輔助回流法所得到的提取物對(duì)DPPH自由基的清除率均有明顯的提高，主要是超聲波產(chǎn)生的機(jī)械能對(duì)石榴籽細(xì)胞有破壁作用，使其中的有效物質(zhì)在加壓與回流作用下更易分離析出，從而增加有效物質(zhì)的提取率，最終提高了提取物的抗氧化活性[14]。

2.2　羥基自由基清除能力

不同提取方法下的石榴籽提取物對(duì)羥基自由基的清除率見圖 2。

圖2　羥基自由基清除能力的比較 Fig.2　Comparison of hydroxyl free radical scavenging capacity

在Fenton反應(yīng)體系中，羥基自由基主要由H2O2與Fe2+反應(yīng)產(chǎn)生，加入水楊酸捕捉劑后，反應(yīng)產(chǎn)生吸光性的有色產(chǎn)物。若在此體系中加入能清除羥基自由基的抗氧化劑，則能與水楊酸產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)而降低有色產(chǎn)物的生成，以此來判斷其抗氧化能力的大小。由圖2可知，各方法的石榴籽提取物對(duì)羥基自由基均有一定的清除作用，但在所考察濃度范圍內(nèi)均未超過40%，說明石榴籽提取物對(duì)羥基自由基的清除能力較弱。相對(duì)而言，超聲輔助加壓法與超聲輔助回流法所得提取物隨著濃度的升高，羥基自由基的清除能力提升較快，在濃度為1.0 mg·mL-1時(shí)羥基自由基清除率已超過其它提取方法，說明其抗氧化活性具有明顯的濃度依賴性。

2.3　還原能力

不同提取方法下的石榴籽提取物的還原能力見圖 3。

圖3　還原能力的比較 Fig.3　Comparison of reducing power

由圖3可知，各提取方法下的石榴籽提取物均具有還原能力，雖普遍偏低，但其還原能力均隨濃度的增加而呈增強(qiáng)的趨勢(shì)。尤其在實(shí)驗(yàn)最高濃度1.0 mg·mL-1時(shí)，超聲輔助加壓法以及超聲輔助回流法下所得的石榴籽提取物的吸光度較其它方法顯著增大，說明這兩種方法下所得提取物的還原能力更大，即抗氧化活性更強(qiáng)。

物質(zhì)的還原能力主要由供體物質(zhì)提供電子能力的大小決定。各提取方法均采用無水乙醇作溶劑，容易吸收空氣中的氧分子，氧化提取物中的電子供應(yīng)體，因此可能導(dǎo)致還原能力普遍不高。而超臨界法中的CO2為非極性有機(jī)溶劑，可以排除氧的干擾，保護(hù)電子供應(yīng)體不被氧化，因而所得提取物的還原能力比加壓法下提取物的還原能力高[14]。由圖3可知，加壓法提取物在低濃度范圍內(nèi)還原能力普遍偏低，但經(jīng)過超聲輔助加壓提取，提取物的還原能力在較高濃度下顯著提高，說明超聲法與加壓法耦合后對(duì)加壓法提取抗氧化有效成分有明顯促進(jìn)作用。

2.4　脂質(zhì)過氧化的抑制作用

不同提取方法下的石榴籽提取物脂質(zhì)過氧化抑制率見圖 4。

圖4　脂質(zhì)過氧化的抑制作用的比較 Fig.4　Comparison of inhibition ability of lipid peroxidation

由圖4可知，各提取方法下的石榴籽提取物均對(duì)亞油酸的脂質(zhì)過氧化有抑制作用。尤其超聲輔助回流法和超聲輔助加壓法所得提取物較單一的回流法和加壓法的過氧化抑制作用均有顯著的提高。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，石榴籽中多酚成分對(duì)油脂的抗氧化作用影響并不顯著[11]，而其中的油脂類成分(如石榴酸)能有效地抑制油脂的過氧化變質(zhì)過程。苗利利等[8]研究表明，超聲法較其它提取方法所得石榴籽油提取物中的石榴酸含量較高，因此超聲法所得提取物比回流、加壓和超臨界等方法所得提取物具有較高的脂質(zhì)過氧化抑制能力。超聲輔助加壓法與超聲輔助回流法所得提取物具有比超聲法所得提取物具有更高的脂質(zhì)過氧化抑制能力，這可能是在較高溫度下，無水乙醇能溶解更多脂溶性成分，相比于單純使用超聲波破壁，可使以石榴酸為代表的油脂類成分的提取率明顯升高，因而提取物的脂質(zhì)過氧化抑制能力提高。

3結(jié)論

以無水乙醇為溶劑，比較不同提取方法(超聲法、回流法、加壓法、超聲輔助回流法、超聲輔助加壓法、超臨界法)對(duì)石榴籽提取物的抗氧化能力的影響。結(jié)果表明，超聲法作為一種輔助方法與回流法、加壓法耦合后，較單一方法下所得提取物的抗氧化能力均有顯著提高，尤其對(duì)DPPH自由基的清除率分別高達(dá)92.1%和80.2%。超聲輔助加壓法與超聲輔助回流法相比較，超聲輔助加壓法過程耗時(shí)短，引入雜質(zhì)少，提取物抗氧化能力亦與超聲輔助回流法相差不大，可以作為一種有效的提取石榴籽抗氧化活性成分的新型方法。

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Effect of Ultrasonic-Assisted Extraction Method on Antioxidant Capacity

of Pomegranate Seed Extracts

YAN Hong-mei，ZHAO Wen-ying，ZHANG Ping-ping

(CollegeofChemicalEngineering，QingdaoUniversityofScienceandTechnology，Qingdao266042，China)

Abstract：The effect of extraction methods on antioxidant capacity of extracts from pomegranate seed was studied.With anhydrous ethanol as solvent，ultrasonic method，reflux method，pressure method，ultrasonic-assisted reflux method，ultrasonic-assisted pressure method and supercritical method were used to extract antioxidant activity components from pomegranate seeds.The DPPH free radical scavenging activity，hydroxyl free radical scavenging activity，reducing power and lipid peroxidation inhibition ability of extracts were tested.The results showed that,the pomegranate seed extracts extracted by ultrasonic-assisted reflux method and ultrasonic-assisted pressure method had better antioxidant capacity compared to other methods，especially the DPPH free radical scavenging rate of pomegranate seed extracts was 92.1% and 80.2%,respectively.Therefore，the ultrasound-assisted method could significantly improve the antioxidant capacity of pomegranate seed extracts.

Keywords：pomegranate seed extract；antioxidant capacity；extraction method；ultrasonic-assisted