高劑量大豆黃酮對(duì)產(chǎn)蛋雞卵巢組織的影響

沈一茹沈海玉王志躍施壽榮?（．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，揚(yáng)州55；．揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州5009）

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高劑量大豆黃酮對(duì)產(chǎn)蛋雞卵巢組織的影響

沈一茹1沈海玉1王志躍2施壽榮1?
（1．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，揚(yáng)州225125；2．揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州225009）

摘 要：本試驗(yàn)旨在研究高劑量大豆黃酮對(duì)產(chǎn)蛋雞卵巢組織的影響。選取體重、產(chǎn)蛋率相近的56周齡海蘭褐蛋雞640只，隨機(jī)分為4組，每組8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20只。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組飼喂基礎(chǔ)飼糧中分別添加10（最高推薦有效量）、50（5倍最高推薦有效量）、100 mg／kg（10倍最高推薦有效量）大豆黃酮的試驗(yàn)飼糧。試驗(yàn)期12周。結(jié)果表明：添加大豆黃酮對(duì)產(chǎn)蛋雞血清大豆黃酮、雌馬酚含量，卵巢重量、組織形態(tài)、白介素－1β（IL?1β）陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及IL?1β、腫瘤壞死因子－α mRNA表達(dá)均沒有顯著影響（P＞0．05）。由此可見，在產(chǎn)蛋高峰后期蛋雞飼糧中添加適量大豆黃酮可以改善生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)，但不會(huì)促進(jìn)其卵巢組織增生癌變，是安全的。

關(guān)鍵詞：大豆黃酮；蛋雞；卵巢；組織增生；IL?1β；TNF?α

大豆黃酮（daidzein，DA）屬異黃酮類植物雌激素，廣泛存在于豆類、牧草、谷物等天然植物中。其化學(xué)結(jié)構(gòu)與17?β雌二醇類似，生物測(cè)定它的雌激素活性占17?β雌二醇的10－3～10－2倍［1］。近年來(lái)大豆黃酮在人醫(yī)臨床保健、動(dòng)物飼料添加劑方面越來(lái)越受到重視，研究發(fā)現(xiàn)，它具有抗氧化、抗癌、降低膽固醇、提高機(jī)體免疫力等生物學(xué)功能［2－4］。在家禽上的研究結(jié)果表明，大豆黃酮對(duì)家禽的生產(chǎn)性能有很好的調(diào)節(jié)作用，添加5～10 mg／kg大豆黃酮可以提高蛋雞、蛋鴨、鵪鶉的產(chǎn)蛋率，降低料蛋比，增加平均蛋重等［5－7］。但關(guān)于其長(zhǎng)期高劑量添加是否具有副作用的安全性問題目前尚未見報(bào)道。國(guó)內(nèi)外腫瘤學(xué)研究結(jié)果表明，白介素－1β（IL?1β）和腫瘤壞死因子－α（TNF?α）等多種細(xì)胞因子對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及療效觀察都具有極為重要的意義。因此，本試驗(yàn)旨在通過研究飼糧中添加高劑量大豆黃酮對(duì)產(chǎn)蛋雞卵巢組織形態(tài)、IL?1β陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及IL?1β和TNF?α mRNA表達(dá)的影響，科學(xué)評(píng)價(jià)大豆黃酮對(duì)卵巢增生癌變的安全性，從而為大豆黃酮的科學(xué)使用提供參考。

1　材料與方法

1．1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取體重、產(chǎn)蛋率相近的56周齡海蘭褐蛋雞640只，隨機(jī)分為4組，即Ⅰ組（對(duì)照組）、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組，每組8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20只。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧（基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1），試驗(yàn)組飼喂在基礎(chǔ)飼糧中分別添加10（最高推薦有效量）、50（5倍最高推薦有效量）、100 mg／kg（10倍最高推薦有效量）大豆黃酮的試驗(yàn)飼糧。預(yù)試期3周，飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)期12周，試驗(yàn)期從59～70周齡。

表1　基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 1　Composition and nutrient levels of the basal diet（air?dry basis）　%

1．2 試驗(yàn)材料與動(dòng)物

大豆黃酮（4，7－二羥基異黃酮＞97．5%），白色粉末，四川廣漢生化制品有限公司惠贈(zèng)。試驗(yàn)動(dòng)物為56周齡海蘭褐蛋雞。

1．3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)雞采用3層階梯式籠養(yǎng)，每天定時(shí)飼喂2次（08：00和15：00），自由采食、飲水。各組飼養(yǎng)管理?xiàng)l件保持完全相同，參考美國(guó)海蘭公司推薦飼養(yǎng)方法飼養(yǎng)管理。

1．4 血樣、卵巢樣品的采集與處理

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每個(gè)重復(fù)選取1只雞翅靜脈采血3 mL，3 500 r／min離心10 min，取上清測(cè)大豆黃酮、雌馬酚含量。采完血的雞屠宰，在無(wú)菌環(huán)境下取卵巢部分組織樣放于mRNA固定液中，－70℃保存；取剩余卵巢基部組織樣保存于10%福爾馬林溶液中，用于組織形態(tài)觀察和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)。

1．4．1 血清大豆黃酮和雌馬酚含量測(cè)定

采用Agilent 1200?6460 QQQ液質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定血清中大豆黃酮和雌馬酚含量，方法參照Lin等［8］。

1．4．2 組織形態(tài)

采用石蠟切片法，蘇木精－伊紅（HE）染色。組織樣品經(jīng)：取樣→沖洗→脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→展片→HE染色→封片的石蠟切片制作程序。在光學(xué)顯微鏡20×鏡下觀察組織形態(tài)。1．4．3 IL?1β的免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)

采用兔抗雞IL?1β多克隆抗體（英國(guó)Abcam公司）對(duì)組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組。

載玻片處理：載玻片經(jīng)過充分沖洗、泡酸3 d以上，以去離子水充分沖洗，超凈臺(tái)里通風(fēng)晾干，在多聚賴氨酸溶液里浸泡10 min，取出晾干過夜，用于貼片做免疫組織化學(xué)檢測(cè)；抗原修復(fù)：貼好并烘干24 h以上的切片經(jīng)過脫蠟復(fù)水等步驟，用0．1%胰酶消化5～10 min，磷酸緩沖液（PBS）洗3次，擦干組織周圍；封閉：抗原修復(fù)完成之后，以5%小牛血清封閉37℃、20 min，以此封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)；一抗孵育：封閉之后的切片經(jīng)PBS清洗3次，滴加1∶100稀釋的抗IL?1β多克隆抗體，37℃孵育1 h；生物素標(biāo)記抗體孵育：經(jīng)過3次PBS沖洗，滴加工作濃度的生物素標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（武漢博士德生物工程有限公司），于37℃孵育1 h；顯色：滴加新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液，于37℃避光作用10 min后流水沖洗終止顯色；觀察：蘇木素復(fù)染，酒精脫水，封片，顯微鏡觀察。

計(jì)數(shù)高倍視野下（10×40）陽(yáng)性細(xì)胞顆粒數(shù)，計(jì)數(shù)高倍視野下陽(yáng)性累積分。選擇合適的相關(guān)視野，在高倍鏡下計(jì)數(shù)各級(jí)陽(yáng)性顆粒數(shù)［染色強(qiáng)度依次為（±）、（＋＋）、（＋＋＋），記為1、2、3分］，以各級(jí)賦值與陽(yáng)性細(xì)胞顆粒數(shù)乘積的和作為該視野的陽(yáng)性累積分，每組3張片子，每份標(biāo)本閱讀5個(gè)視野，最后計(jì)算平均值。

卵巢基部組織中IL?1β陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)判定標(biāo)準(zhǔn)見圖1。

圖1　IL?1β陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)判定標(biāo)準(zhǔn)Fig．1　Criteria for positive cell count of IL?1β

1．4．4 IL?1β和TNF?α的mRNA表達(dá)

卵巢總RNA提取按TRNzol?A＋總RNA提取試劑的說明書進(jìn)行。RNA樣品經(jīng)1．4%瓊脂糖－甲醛變性凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，保證RNA樣品質(zhì)量可靠，計(jì)算樣品總RNA濃度。取2 μg總RNA，cDNA第1鏈的合成按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的使用說明書進(jìn)行，用內(nèi)參基因（β?actin）檢測(cè)cDNA合成質(zhì)量以及是否有基因組DNA污染。RT產(chǎn)物保存在－20℃用于PCR檢測(cè)。

表2　引物序列Table 2　Primer sequences

所用熒光定量PCR采用SYBR GreenⅠ法，將每個(gè)待測(cè)樣品RT產(chǎn)物取等體積混合，用混合樣（cDNA mix）進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化，包括目的基因和內(nèi)參基因引物設(shè)計(jì)和合成、最佳退火溫度、引物濃度、模板濃度等，確定好最佳反應(yīng)條件。20 μL反應(yīng)體系中上下游引物濃度0．2 μmol／L，退火溫度60℃、20 s。將上述經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后正確的含胰島素樣生長(zhǎng)因子－Ⅰ（IGF?Ⅰ）基因的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，做10n（n＝5～10）梯度稀釋。將梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品同時(shí)進(jìn)行定量PCR，每次反應(yīng)均設(shè)陰性對(duì)照，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線（標(biāo)準(zhǔn)曲線由系統(tǒng)軟件自動(dòng)分析獲得）計(jì)算出待測(cè)樣品目的基因的拷貝數(shù)，然后進(jìn)行絕對(duì)定量分析。

1．5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2003整理后，用SPSS 16．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，單因素方差分析（one?way ANO?VA）檢驗(yàn)組間差異顯著性，再進(jìn)行LSD多重比較。P＜0．05表示差異顯著。

2　結(jié) 果

2．1 高劑量大豆黃酮對(duì)產(chǎn)蛋雞血清大豆黃酮和雌馬酚含量的影響

由表3可知，大豆黃酮對(duì)產(chǎn)蛋雞血清大豆黃酮和雌馬酚含量均沒有顯著影響（P＞0．05）。

表3　高劑量大豆黃酮對(duì)產(chǎn)蛋雞血清大豆黃酮和雌馬酚含量的影響Table 3　Effects of high?dose daidzein on serum daidzein and equol content of laying hens　mg／L

2．2 高劑量大豆黃酮對(duì)產(chǎn)蛋雞卵巢相對(duì)重量的影響

由表4可知，大豆黃酮對(duì)產(chǎn)蛋雞卵巢相對(duì)重量沒有顯著影響（P＞0．05）。

2．3 高劑量大豆黃酮對(duì)產(chǎn)蛋雞卵巢形態(tài)學(xué)的影響

由圖2可知，各組均表現(xiàn)為卵巢組織層次分明、結(jié)構(gòu)完整，間質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，在間質(zhì)細(xì)胞間有不同發(fā)育階段的生長(zhǎng)卵泡。

表4　高劑量大豆黃酮對(duì)產(chǎn)蛋雞卵巢相對(duì)重量的影響Table 4　Effects of high?dose daidzein on the relative weight of ovary of laying hens　%

圖2　高劑量大豆黃酮對(duì)產(chǎn)蛋雞蛋雞卵巢組織形態(tài)的影響Fig．2　Effects of high?dose daidzein on ovary tissue morphological of laying hens（20×）

2．4 高劑量大豆黃酮對(duì)產(chǎn)蛋雞卵巢IL?1β陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的影響

由表5可知，大豆黃酮對(duì)IL?1β陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著影響（P＞0．05）。

2．5 高劑量大豆黃酮對(duì)產(chǎn)蛋雞卵巢IL?1β和TNF?α mRNA表達(dá)的影響

由表6可知，各組中IL?1β和TNF?α mRNA表達(dá)均差異不顯著（P＞0．05）。

表5　高劑量大豆黃酮對(duì)產(chǎn)蛋雞卵巢IL?1β陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的影響Table 5　Effects of high?dose daidzein on the ovary positive cell count of IL?1βof laying hens

表6　高劑量大豆黃酮對(duì)卵巢IL?1β、TNF?αmRNA表達(dá)的影響Table 6　Effects of high?dose daidzein on mRNA expression of IL?1β and TNF?αin ovary

3　討 論

本研究選取了產(chǎn)蛋后期蛋雞作為研究對(duì)象，主要因?yàn)榇藭r(shí)其本身體內(nèi)激素水平呈下降趨勢(shì)，而大豆黃酮是一種類雌激素類物質(zhì)，恰好可以補(bǔ)充動(dòng)物體內(nèi)激素水平，促使動(dòng)物相關(guān)機(jī)能不降低或不迅速降低，更好的發(fā)揮生產(chǎn)性能。在本試驗(yàn)研究前，本課題組開展了大豆黃酮對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)、體內(nèi)和產(chǎn)品沉積等影響的一系列研究，發(fā)現(xiàn)大豆黃酮顯著影響了蛋雞死亡率、平均產(chǎn)蛋率、產(chǎn)蛋量和料蛋比，其中平均產(chǎn)蛋率、產(chǎn)蛋量和料蛋比均與大豆黃酮添加量呈顯著二次曲線關(guān)系，表明高劑量大豆黃酮會(huì)負(fù)反饋調(diào)節(jié)生產(chǎn)性能；也顯著影響了3個(gè)與鈣代謝相關(guān)的蛋品質(zhì)指標(biāo)（蛋殼厚度、蛋殼比例和蛋殼強(qiáng)度）［10－11］。

在本試驗(yàn)研究中未發(fā)現(xiàn)大豆黃酮對(duì)卵巢重量、組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞增殖和增殖因子表達(dá)等產(chǎn)生顯著影響，這表明飼喂高劑量大豆黃酮對(duì)產(chǎn)蛋雞卵巢組織沒有影響。之前大部分在人和老鼠上的研究也發(fā)現(xiàn)大豆黃酮未對(duì)子宮內(nèi)膜、乳房及卵巢等繁殖組織有影響［12－14］，這與本研究結(jié)果一致。而僅Unfer等［15］在婦女上研究發(fā)現(xiàn)大豆黃酮增加了子宮重，但是在文中未分析血清大豆黃酮含量、體重等一些其他影響因子影響，從而增加了大豆黃酮影響的不確定性。Petrakis等［16］和Hargreaves等［17］報(bào)道了大豆黃酮對(duì)乳房組織有影響，但也缺乏有效定量判斷，比如沒有報(bào)道乳腺增生情況，也沒有說清重復(fù)效應(yīng)或乳房炎情況。

IL?1β是一種主要由血液中單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及其他多種類型細(xì)胞合成分泌的重要細(xì)胞因子，通過與靶細(xì)胞表面的受體結(jié)合調(diào)節(jié)其功能。白介素－1（IL?1）系統(tǒng)包括5個(gè)成員，即2個(gè)配體α、β，2個(gè)受體Ⅰ型受體、Ⅱ型受體以及1個(gè)受體拮抗劑［18］。其中IL?1β與生殖活動(dòng)關(guān)系最為密切。IL?1β對(duì)下丘腦－垂體－卵巢軸有明顯的抑制作用。Karal等［19］報(bào)道，0．1 nmol／L的IL?1β即可顯著抑制離體大鼠下丘腦視前區(qū)內(nèi)側(cè)基底核釋放促黃體生成素釋放激素的能力。Petroff等［20］發(fā)現(xiàn)，卵巢中存在完整的IL?1系統(tǒng)，其在卵泡發(fā)育、排卵和黃體功能調(diào)節(jié)等方面具有重要作用。TNF?α是一種多功能的細(xì)胞因子。在機(jī)體中，不同部位的巨噬細(xì)胞、末梢血單核細(xì)胞經(jīng)刺激后均具有產(chǎn)生TNF?α的能力。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)它與生殖功能密切相關(guān)。研究表明，卵巢能產(chǎn)生有生物活性的TNF?α。在鼠的卵巢中證明有TNF?α mRNA表達(dá)，定位于顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞中［21］。TNF?α可刺激卵泡膜細(xì)胞的有絲分裂活動(dòng)，影響顆粒細(xì)胞和泡膜細(xì)胞類固醇激素的合成，并在卵巢原細(xì)胞、卵母細(xì)胞、卵泡細(xì)胞的閉鎖和黃體退化中發(fā)揮重要作用［22－23］。與Hsieh等［24］、Ju等［25］、Allred等［26］在體外或哺乳動(dòng)物上得到的結(jié)果相比，高劑量大豆黃酮雌激素增生作用不明顯。這個(gè)不同可能與許多因子相關(guān)，比如劑量、服用方式、飼糧原料配方、機(jī)體自身雌激素水平等。

細(xì)胞培養(yǎng)和模式動(dòng)物試驗(yàn)表明采食大豆黃酮可能存在抗雌激素作用，以及對(duì)繁殖組織有潛在促進(jìn)癌變的副作用。然而，雌激素效應(yīng)發(fā)揮的有效劑量在過去的50年的研究中也未有定論［27］。在本試驗(yàn)中，我們以產(chǎn)蛋雞為試驗(yàn)動(dòng)物去評(píng)價(jià)高劑量大豆黃酮對(duì)繁殖組織增生癌變的影響，但未觀察到任何作用。借鑒于人類，意味著人長(zhǎng)期服用高劑量雌激素類物質(zhì)不會(huì)對(duì)其卵巢組織產(chǎn)生明顯影響，不會(huì)增加患卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)。

4　結(jié) 論

在產(chǎn)蛋高峰后期蛋雞飼糧中添加適量大豆黃酮可以改善生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)，但不會(huì)促進(jìn)蛋雞卵巢組織增生癌變，是安全的。

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Effects of High?Dose Daidzein on Ovary Tissue of Laying Hens

SHEN Yiru

1

SHEN Haiyu

1

WANG Zhiyue

2

SHI Shourong

1?

（責(zé)任編輯 武海龍）

（1．Poultry Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Yangzhou 225125，China；2．College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China）

?Corresponding author，assistant professor，E?mail：ssr236＠163．com

Abstract：This trial was conducted to evaluate the effects of high?dose daidzein on ovary tissue of laying hens．Six hundred and forty Hy?Line brown laying hens with average body weight and laying rate were randomly as?signed to 4 groups with 8 replicates per group and 20 birds per replicate．The control group was fed a basal di?et，and the others were fed diets supplemented with 10（the maximum recommended available amount），50 （fives fold of maximum recommended available amount）and 100 mg／kg（ten folds of maximum recommen?ded available amount）of daidzein．The experiment lasted for 12 weeks．The results showed that the contents of serum daidzein and equol，ovary weight，morphology，positive cell number of interleukin?1β（IL?1β），ex?pression quantity of IL?1β and tumor necrosis factor?α mRNA of ovary tissue were not significantly affected by daidzein（P＞0．05）．It is indicated that daidzein can improve the performance and egg quality，but hold no ob?served adverse effect on ovary tissue of laying hens，which can be safe．［Chinese Journal of Animal Nutri?tion，2015，27（8）：2476?2482］

Key words：daidzein；laying hens；ovary；tissue proliferation；IL?1β；TNF?α

通信作者：?施壽榮，助理研究員，E?mail：ssr236＠163．com

作者簡(jiǎn)介：沈一茹（1989—），女，江蘇丹陽(yáng)人，碩士研究生，從事家禽營(yíng)養(yǎng)研究。E?mail：shenyiru929＠126．com

基金項(xiàng)目：“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2012BAD39B04）；農(nóng)業(yè)部飼料質(zhì)量安全監(jiān)管項(xiàng)目（2011）

收稿日期：2015－03－17

doi：10．3969／j．issn．1006?267x．2015．08．020

文章編號(hào)：1006?267X（2015）08?2476?07

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：S823