丹皮酚對大鼠肝纖維化治療作用的實驗研究

丹皮酚對大鼠肝纖維化治療作用的實驗研究

覃星柳楊萍1

(廣西壯族自治區(qū)貴港市人民醫(yī)院藥劑科，廣西貴港537100)

【摘要】目的探討丹皮酚對大鼠肝纖維化的治療作用及其機制。方法將33只大鼠隨機分為正常組、模型對照組、丹皮酚干預(yù)組，每組11只，模型對照組及丹皮酚干預(yù)組采用四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)建立肝纖維化模型。建模結(jié)束后，丹皮酚干預(yù)組予4 000 mg/kg丹皮酚灌胃，正常組及模型對照組予相同容積0.9%氯化鈉注射液灌胃。連續(xù)灌胃2周后，觀察比較3組大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量及肝指數(shù)，測定血清肝纖維化生化指標血清Ⅲ型前膠原肽(PⅢP)、層黏連蛋白(LN)、Ⅳ型膠原蛋白(collagens Ⅳ)及透明質(zhì)酸(HA)水平，肝組織氧化應(yīng)激指標超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)、谷胱甘肽(GSH)及丙二醛含量(MDA)，肝組織病理切片行馬松(Masson)三色染色檢測肝纖維化情況，逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測collagens Ⅰ mRNA的表達。結(jié)果造模后，模型對照組及丹皮酚干預(yù)組大鼠體質(zhì)量均低于正常組，肝質(zhì)量及肝指數(shù)均高于正常組(P<0.05)，但丹皮酚干預(yù)組肝指數(shù)增加幅度低于模型對照組(P<0.05)；模型對照組及丹皮酚干預(yù)組肝組織Masson染色膠原纖維較正常組均明顯增加(P<0.05)，但丹皮酚干預(yù)組增加情況低于模型對照組(P<0.05)；模型對照組及丹皮酚干預(yù)組大鼠血清肝纖維化生化指標PⅢP、LN、collagens Ⅳ及HA水平較正常組均明顯增高(P<0.05)，但丹皮酚干預(yù)組增加幅度均低于模型對照組(P<0.05)；模型對照組及丹皮酚干預(yù)組collagens Ⅰ mRNA表達較正常組均顯著升高(P<0.05)，但丹皮酚干預(yù)組collagens Ⅰ mRNA表達增加幅度低于模型對照組(P<0.05)；模型對照組及丹皮酚干預(yù)組大鼠肝組織MDA、GST水平較正常組均顯著升高(P<0.05)，GSH、SOD水平均顯著降低(P<0.05)，但丹皮酚干預(yù)組MDA、GST升高幅度及GSH、SOD降低幅度均低于模型對照組(P<0.05)。結(jié)論丹皮酚可以緩解CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化過程，其作用機制可通過降低氧化應(yīng)激水平，增強抗氧化作用來改善肝纖維化進程。

【關(guān)鍵詞】牡丹皮；肝硬化；大鼠；疾病模型，動物

doi：10.3969/j.issn.1002-2619.2015.04.025

【中圖分類號】R285.5

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002-2619(2015)04-0546-04

作者簡介：覃星柳(1972—)，女，副主任藥師，學士。從事藥劑科工作。

Abstract【】Objective To study the therapeutic effects and mechanism of paeonol on hepatic fibrosis rats.Methods 33 rats were randomly divided into normal group, model group and paeonol intervention group, 11 rats in each group.Liver Fibrosis model in model group and paeonol intervention group were induced by carbon tetrachloride (CCl4).After modeling, rats in paeonol intervention group received paeonol (4 000 mg/kg) via gastrogavage, rats in other two groups received 0.9% sodium chloride injection via gastrogavage at the same dose.After 8 weeks of gastric perfusion, the level of body mass, liver mass and liver index in rats were observed in three groups.The level of the serum liver fibrosis biochemical index like serum procollagen type Ⅲ peptide (PⅢP), laminin lens (LN), collagens Ⅳ and hyaluronic acid (HA),and the degree of the liver tissue oxidative stress index like superoxide dismutase (SOD), glutathione-transferase (GST), glutathione (GSH) and malondialdehyde content (MDA) were detected in three groups, the liver fibrosis degree of liver tissue pathological section was detected by masson's trichrome staining, and the expression of collagensⅠmRNA was detected by inverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR).Results After modeling, the level of rats body mass in model group and paeonol intervention group was lower than that in normal group (P<0.05), the level of liver mass and liver index were increased (P<0.05), but the increase of liver index in paeonol intervention group was lower than that in model group (P<0.05).Masson's staining collagen fiber of liver tissue in model group and paeonol intervention group was significantly increased as compared with that in normal group (P<0.05), but the increase in paeonol intervention group was lower than that in model group (P<0.05).The degree of PⅢP, LN, collagens Ⅳ and HA in model group and paeonol intervention group were significantly increased as compared with those in normal group (P<0.05), but the increase in paeonol intervention group was lower than that in model group (P<0.05).The expression of collagensⅠmRNA in model group and paeonol intervention group was significantly increased as compared with that in normal group(P<0.05), the increase in paeonol intervention group was lower than that in model group (P<0.05).The level of MDA, GST of rats liver tissue in model group and paeonol intervention group were significantly increased as compared with those in normal group (P<0.05), the level of GSH, SOD were decreased (P<0.05), but the change range in paeonol intervention group was smaller than that in model group (P<0.05).Conclusion Paeonol can relief carbon tetrachloride-induced liver fibrosis degree in rats through the action mechanism of decreasing oxidative stress level and enhance antioxidation effect.

收稿日期：(2013-12-26)

1廣西壯族自治區(qū)貴港市中西醫(yī)結(jié)合骨科醫(yī)院藥劑科，廣西貴

港537100

Experimental study of the therapeutic effects of paeonol on hepatic fibrosis ratsQINXingliu*,YANGPing.*DepartmentofPharmacy,People'sHospitalofGuigangCity,Guangxi,Guigang537100

【Key words】 Cortex moutan；Liver cirrhosis；Rat；Disease model；Animal

丹皮酚是中藥毛莨科植物牡丹的根皮和蘿摩科植物徐長卿干燥根及根莖中的主要有效成分，是一種小分子酚類化合物，化學名稱為2-羥基-4-甲氧基苯乙酮，分子量166，分子式C9H10O3?，F(xiàn)代醫(yī)學表明，丹皮酚具有鎮(zhèn)靜催眠、解熱鎮(zhèn)痛、抗菌消炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化及保護心腦血管等藥理活性[1-3]，對多種慢性肝病和病毒性肝炎也具有良好的治療和預(yù)防作用[4-6]。本研究采用四氯化碳(CCl4)大鼠肝纖維化模型，探討丹皮酚對肝纖維化的治療作用以及可能的機制，為丹皮酚的抗肝纖維化作用提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗動物清潔級成年健康雄性SD大鼠33只，體質(zhì)量170～210 g，上海斯萊克實驗動物有限公司提供，動物合格證號：SCXK桂2013-0172。

1.2主要藥物與試劑CCl4，天津化學試劑研究所；Ⅰ型膠原蛋白(collagens Ⅰ)兔多克隆抗體，武漢博士德生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；馬松(Masson)染色試劑盒，上海博谷生物科技有限公司；血清Ⅲ型前膠原肽(PⅢP)、層黏連蛋白(LN)、collagens Ⅳ及透明質(zhì)酸(HA)檢測試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司；天然丹皮酚，安徽宣城百草植物工貿(mào)有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)、谷胱甘肽(GSH)及丙二醛(MDA)檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.3模型制備及分組全部33只大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機均分成3組，正常組、模型對照組、丹皮酚干預(yù)組。模型對照組及丹皮酚干預(yù)組予大鼠后肢內(nèi)側(cè)皮下注射50% CCl4的花生油溶液，0.2 mg/100 g，每周2次，左右腿交叉進行，6周時間建立大鼠肝纖維化模型。正常組予相同容積0.9%氯化鈉注射液對照。建模結(jié)束后，丹皮酚干預(yù)組予4 000 mg/kg丹皮酚灌胃，正常組及模型對照組予相同容積0.9%氯化鈉注射液灌胃，連續(xù)灌胃2周。

1.4觀測指標及方法灌胃治療結(jié)束后處死全部大鼠，稱體質(zhì)量和肝質(zhì)量，計算肝指數(shù)，肝指數(shù)=(肝質(zhì)量/體質(zhì)量)×100%。通過酶聯(lián)免疫法測定血清肝纖維化生化指標PⅢP、LN、collagens Ⅳ及HA水平，肝組織氧化應(yīng)激指標SOD、GST、GSH及MDA水平，肝組織病理切片行Masson三色染色檢測肝纖維化情況，逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測collagens Ⅰ mRNA的表達。Masson染色隨機選取10個高倍視野，采用Image Pro Plus 6.0軟件計算陽性染色面積占整個視野面積的百分比，即膠原指數(shù)。RT-PCR檢測肝組織collagens Ⅰ mRNA的表達，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參抗體；取100 mg大鼠肝臟組織，采用Trizol法抽提RNA，總反應(yīng)體系20 μL，42 ℃水浴1 h，合成第1鏈互補DNA(cDNA)。取上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL作為反應(yīng)模板，反應(yīng)體系為25 μL，上游引物為5＇-TACAGCACGCTTGTGGGATG-3＇，下游引物為5＇-TTGAGTTTGGGTTGTTGGTC-3＇，進行擴增。同法擴增β-肌動蛋白(β-actin)作為內(nèi)參照。以5 μL反應(yīng)產(chǎn)物在凝膠上電泳，攝像，存入計算機，并做圖像分析。

2結(jié)果

2.13組大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量及肝指數(shù)比較見表1。

表1　3組大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量及

與正常組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，△P<0.05

由表1可見，與正常組比較，模型對照組及丹皮酚干預(yù)組大鼠體質(zhì)量均低于正常組(P<0.05)，肝質(zhì)量及肝指數(shù)均高于正常組(P<0.05)，但丹皮酚干預(yù)組肝指數(shù)增加幅度低于模型對照組(P<0.05)，體質(zhì)量及肝質(zhì)量雖較模型對照組有所增加，但2組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.23組大鼠肝組織Masson染色情況比較Masson染色膠原纖維染色顯示：正常大鼠僅在匯管區(qū)和中央靜脈見少量膠原纖維(見封3，圖1)。模型大鼠肝內(nèi)形成彌散的致密，肝內(nèi)小葉結(jié)構(gòu)紊亂，重新形成大小不一的亞假小葉結(jié)構(gòu)，與正常組比較膠原指數(shù)明顯增加(P<0.05)(見封3，圖2)。與模型對照組比較，丹皮酚干預(yù)組肝內(nèi)膠原沉積明顯減少，且小葉結(jié)果紊亂減輕，膠原指數(shù)明顯減少(P<0.01) (見封3，圖3)。

2.33組大鼠血清肝纖維化生化指標水平比較見表2。

表2　3組大鼠血清肝纖維化生化指標水平比較　 ± s

與正常組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，△P<0.05

由表2可見，與正常組比較，模型對照組及丹皮酚干預(yù)組大鼠血清肝纖維化生化指標PⅢP、LN、collagens Ⅳ及HA水平均明顯增高(P<0.05)，但丹皮酚干預(yù)組增加幅度均低于模型對照組(P<0.05)。

2.43組大鼠肝組織collagens Ⅰ mRNA表達比較RT-PCR結(jié)果分析顯示，與正常組比較，模型對照組及丹皮酚干預(yù)組collagens Ⅰ mRNA表達均顯著升高(P<0.05)，但丹皮酚干預(yù)組collagens Ⅰ mRNA表達增加幅度低于模型對照組(P<0.05)，見圖4。

圖4　3組大鼠肝組織collagens-ⅠmRNA表達比較

2.53組大鼠肝組織氧化應(yīng)激指標水平比較見表3。

表3　3組大鼠肝組織氧化應(yīng)激指標水平比較　 ± s

與正常組比較，*P<0.05；與模型對照組比較 △P<0.05

由表3可見，與正常組比較，模型對照組及丹皮酚干預(yù)組大鼠肝組織MDA、GST水平均顯著升高(P<0.05)，GSH、SOD水平均顯著降低(P<0.05)，但丹皮酚干預(yù)組MDA、GST升高幅度及GSH、SOD降低幅度均低于模型對照組(P<0.05)。

3討論

肝纖維化是機體在應(yīng)對各種致病因子刺激過程中所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，最終導(dǎo)致肝內(nèi)彌漫性細胞外基質(zhì)過度沉淀的病理過程。在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中存在諸多的病理生理方面的改變，其中氧化應(yīng)激在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展進程中起著不容忽視的作用，生理情況下機體氧化應(yīng)激和抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)處于穩(wěn)態(tài)平衡狀態(tài)[6]。選擇合適的動物模型對研究肝纖維化至關(guān)重要，本實驗采用CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠模型，該模型具有重復(fù)性好和成功率高等優(yōu)點。不同方法建立動物肝纖維化模型其作用機制不同，CCl4誘導(dǎo)肝纖維化其主要機制是通過細胞色素氧化酶代謝為活性氧三氯甲基，過多活性氧超出了體內(nèi)抗氧化物的清除能力，使氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)之間的動態(tài)平衡失衡，最終導(dǎo)致肝臟損傷[7-8]。本實驗在造模過程通過對其氧化應(yīng)激相關(guān)指標進行檢測發(fā)現(xiàn)大鼠肝組織GST、MDA水平均顯著升高，而總SOD、GSH水平顯著降低，這一結(jié)果恰恰說明證實氧化應(yīng)激在肝纖維化發(fā)揮著重要角色。丹皮酚是從中藥牡丹皮中提取的一種活性物質(zhì)，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、解熱和抑制變態(tài)反應(yīng)的作用，其抗氧化性在心腦血管病研究中已經(jīng)得到廣泛驗證，其作用機制可能是通過穩(wěn)定細胞膜、抑制缺血心肌的膜損傷、清除自由基、降低脂質(zhì)過氧化有關(guān)[9-10]。本實驗結(jié)果亦表明，丹皮酚能明顯降低機體內(nèi)氧化應(yīng)激指標GST、MDA水平，增加SOD、GSH水平，降低collagensⅠmRNA表達，改善肝纖維化。氧化應(yīng)激是肝纖維化時肝細胞損傷的一個重要發(fā)病機制，丹皮酚可通過降低氧化應(yīng)激水平，增強抗氧化作用來改善肝纖維化進程。

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(本文編輯：石康)

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