骨支架復(fù)合材料不飽和聚磷酸酯-β-磷酸鈣的體外降解行為研究

袁　泉，徐娟娟，劉　璐，彭　周，夏　風(fēng)，肖建中

(華中科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院 材料成型與模具技術(shù)國家重點實驗室，湖北 武漢 430074)

骨支架復(fù)合材料不飽和聚磷酸酯-β-磷酸鈣的體外降解行為研究

袁泉，徐娟娟，劉璐，彭周，夏風(fēng)，肖建中

(華中科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院 材料成型與模具技術(shù)國家重點實驗室，湖北 武漢 430074)

摘要：采用溶液聚合的方法制備了主鏈含不飽和雙鍵的聚磷酸酯，并以β-磷酸鈣(β-TCP)為無機填料通過交聯(lián)反應(yīng)得到骨支架復(fù)合材料不飽和聚磷酸酯-β-磷酸鈣。研究了β-磷酸鈣含量對復(fù)合材料體外降解行為的影響，采用X-射線衍射研究了降解前后復(fù)合材料中無機相的變化，采用掃描電子顯微鏡觀察了復(fù)合材料降解過程中的表面形貌變化。結(jié)果表明：復(fù)合材料的降解速度先快后慢；β-磷酸鈣的加入可有效減緩復(fù)合材料的降解速度；降解過程中材料表面有羥基磷灰石生成，說明此材料具有良好的生物相容性。

關(guān)鍵詞：不飽和聚磷酸酯；β-磷酸鈣；降解行為；生物相容性

聚磷酸酯在生物學(xué)方面的應(yīng)用始于20世紀(jì)70年代[1]，由于在結(jié)構(gòu)上與生物高分子如核酸及磷壁酸等相似，聚磷酸酯中的磷酸酯鍵在生理條件下可發(fā)生水解反應(yīng)或酶促分解反應(yīng)[2-3]，因而具有良好的生物相容性和可降解性[4-5]，在藥物控釋[6-7]、基因載體[8-9]和組織工程[10]等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。卓仁禧等[11-13]制備得到了多種結(jié)構(gòu)的聚磷酸酯，并研究了其在藥物緩釋方面的性能。Leong等制備了側(cè)鏈含不同基團的聚磷酸酯，并研究了其在基因傳遞、組織工程中的應(yīng)用[4,14]。

β-磷酸鈣(β-TCP)具有良好的生物相容性和生物降解性，其鈣磷質(zhì)量比為1.5，與正常骨組織接近，其在體內(nèi)降解產(chǎn)生的鈣、磷能在一定程度上促進新生骨骼的生成[15-16]，因而作為一種生物材料得到了廣泛的關(guān)注。

雖然國內(nèi)外對聚磷酸酯的研究較多，但主要集中在合成方法上，應(yīng)用上則集中在藥物控釋和基因載體等方面，對其作為骨支架材料的體外降解行為研究鮮有報道。作者制備了主鏈含不飽和雙鍵的聚磷酸酯，以β-磷酸鈣為無機填料制備了可原位固化的聚磷酸酯-β-磷酸鈣骨支架復(fù)合材料，研究了復(fù)合材料的體外降解行為。

1實驗

1.1　試劑及原料

三乙胺、二氯甲烷、過氧化二苯甲酰(BPO)、N,N′-二甲基對甲基苯胺(DMT)、丙酮、無水乙醚，均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；二氯磷酸乙酯(EDP),純度98%，北京百靈威科技有限公司；N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)，純度99%，阿拉丁試劑(上海)有限公司。

β-磷酸鈣(β-TCP)為自制粉末，粒徑范圍150~300 nm。富馬酸二(1,2)-丙二醇酯(BPGF)參照文獻[17]方法合成。

1.2　方法

1.2.1不飽和聚磷酸酯(UPPE)的合成

向干燥的三口燒瓶中加入9.29 g BPGF，在冰浴條件下向燒瓶中通入氬氣以置換出瓶中空氣，用注射器先后注入150 mL干燥二氯甲烷和8.90 g三乙胺。在機械攪拌下，通過分液漏斗向瓶中緩慢滴加溶于20 mL干燥二氯甲烷的EDP 6.52 g。滴加完畢后，升溫回流反應(yīng)18 h。將產(chǎn)物用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮至約20 mL，加入150 mL丙酮將其溶解后置于冰水浴中析出副產(chǎn)物三乙胺鹽酸鹽，過濾，如此反復(fù)多次。后將溶液再次濃縮至約20 mL，用丙酮-無水乙醚沉淀3次后真空干燥至恒質(zhì)量，得到深黃色黏稠物即為目標(biāo)產(chǎn)物UPPE，測定其分子量為3 050 g·mol-1。合成路線如圖1所示。

圖1　不飽和聚磷酸酯的合成路線Fig.1　Synthetic route of unsaturated polyphosphoester

1.2.2復(fù)合材料不飽和聚磷酸酯-β-磷酸鈣的交聯(lián)

交聯(lián)反應(yīng)是通過氧化還原引發(fā)體系BPO/DMT引發(fā)，NVP作為交聯(lián)劑來實現(xiàn)的。取1 g UPPE和DMT溶于2/3所需用量的NVP中，分別加入0 g、0.3 g和0.6 gβ-TCP，混合均勻，構(gòu)成組分A；另取一定量的BPO溶于剩余1/3所需用量的NVP中，構(gòu)成組分B；將兩組分混合均勻后用注射器注入聚四氟乙烯(Φ6 mm×12 mm)模具中，置于37 ℃水浴鍋中恒溫固化24 h，得到交聯(lián)產(chǎn)物。根據(jù)β-TCP加入量的不同(0 g、0.3 g、0.6 g)，將3種配方分別標(biāo)記為T0、T0.3和T0.6。

1.2.3復(fù)合材料的降解實驗

根據(jù)交聯(lián)反應(yīng)的配方，每組取10個尺寸相同的平行試樣，封入透析袋中，然后將其放入裝有50 mL模擬體液(pH=7.4)的錐形瓶中，密封后在振蕩器中37 ℃恒溫振蕩，振蕩速度60 r·min-1，每隔3 d更換模擬體液。模擬體液的配制方法參照文獻[18-19]。降解反應(yīng)如圖2所示。

圖2　交聯(lián)不飽和聚磷酸酯的降解反應(yīng)Fig.2　Degradation reaction of cross-linked unsaturated polyphosphoester

降解一段時間后將樣品取出，經(jīng)蒸餾水洗滌3遍后用濾紙吸干表面殘留的水分，測量試樣長度(Lt)和直徑(Dt)。隨后于37 ℃下真空干燥至恒質(zhì)量，稱量(Wd)。用掃描電子顯微鏡觀察樣品表面形貌。每次更換模擬體液前測量模擬體液的pH值(pHt)。

各計算公式如下：

質(zhì)量保持率=(Wd/W0)×100%

(1)

長度增加率=[(Lt-L0)/L0]×100%

(2)

直徑增加率=[(Dt-D0)/D0]×100%

(3)

pH變化值=7.4-pHt

(4)

式中：L0為試樣降解前的初始長度；D0為試樣降解前的初始直徑；W0為試樣降解前的初始質(zhì)量。

模擬體液中NVP、PVP的紫外吸收在紫外分光光度計上測定。NVP、PVP的檢測波長分別為234 nm、202 nm,標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為：

y=0.02185x+0.1153

(5)

y=0.00718x-0.0347

(6)

式中:x為樣品濃度，mg·L-1；y為吸光度。

1.2.4測試表征

復(fù)合材料紅外光譜采用德國Bruker 公司VERTEX 70型紅外光譜儀測定，溴化鉀壓片涂膜。紫外吸收采用美國Perkin Elmer公司Lambda 35型紫外分光光度計測定。分子量采用美國Agilent公司 Agilent 1100型高效液相色譜儀測定；聚苯乙烯為標(biāo)樣，四氫呋喃為溶劑(流速1 mL·min-1) 。X-射線衍射圖譜采用荷蘭帕納科公司X′Pert PRO型X-射線衍射儀測定；微觀形貌采用荷蘭FEI公司Sirion 200型場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察。

2結(jié)果與討論

2.1　富馬酸二(1,2)-丙二醇酯(BPGF)和不飽和聚磷酸酯(UPPE)的紅外光譜(圖3)

圖3　BPGF和UPPE的紅外光譜Fig.3　FTIR Spectra of BPGF and UPPE

由圖3可知，與BPGF的紅外光譜比較，UPPE的3 432.14 cm-1處羥基的伸縮振動吸收峰減弱，說明羥基參與了聚合反應(yīng)。此外，1 260.11 cm-1處為P=O的伸縮振動吸收峰，1 119.06 cm-1和1 035.90 cm-1處分別為P-O-C中P-O和C-O的伸縮振動吸收峰，這些峰的出現(xiàn)表明了UPPE的產(chǎn)生。

2.2　β-TCP含量對復(fù)合材料降解行為的影響

2.2.1復(fù)合材料體外降解過程中NVP及PVP釋放量的變化(圖4)

圖4　試樣體外降解過程中NVP(a)和PVP(b)的釋放量Fig.4　Released amount of NVP(a) and PVP(b) of samples during degradation in vitro

從圖4可知，試樣降解過程中NVP和PVP釋放量隨降解時間的變化趨勢大致相同。3組樣品均在降解開始的前2 d NVP和PVP釋放最快，第6 d后釋放量很小，并趨于平穩(wěn)，且6 d后3組樣品的NVP和PVP釋放量相差很小。比較3組樣品在降解開始前3 d的NVP和PVP釋放量，可以看出,隨著β-TCP含量的增加，NVP和PVP釋放量逐漸減小。

復(fù)合材料在交聯(lián)的過程中，有部分交聯(lián)劑NVP沒有參與反應(yīng)，仍以單體形式存在；部分NVP沒有與UPPE形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，而是形成了均聚物PVP。NVP和PVP有很強的親水性，故在降解開始的前2 d快速溶出。與未加入β-TCP的試樣比較，加入β-TCP的試樣NVP和PVP的釋放量較低，這是因為加入無機填料后，體系黏度增大，鏈自由基的運動受到限制，雙基終止困難，有更多的NVP參加反應(yīng)進入交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，體系中游離NVP的量減少，因此降解過程中NVP的釋放量減少；此外，參加均聚反應(yīng)形成PVP的NVP也減少，因而PVP的釋放量也相對減少。

2.2.2復(fù)合材料體外降解過程中的質(zhì)量變化(圖5)

圖5　試樣體外降解過程中的質(zhì)量變化Fig.5　Mass changes of samples during degradation in vitro

從圖5可以看出，隨著降解時間的延長，3組樣品的質(zhì)量均呈下降趨勢，且降解前3 d質(zhì)量變化最大；隨著降解時間的延長，變化逐漸減緩。T0質(zhì)量變化最大，降解30 d后質(zhì)量僅為起始質(zhì)量的46.9%，隨著β-TCP含量的增加，質(zhì)量保持率不斷上升，T0.3和T0.6在降解30 d后的質(zhì)量保持率分別為起始質(zhì)量的59.7%和66.8%。

降解前3 d樣品的質(zhì)量損失主要是體系中NVP和PVP的溶出造成的，由于β-TCP加入量越多的樣品NVP和PVP的溶出量越小，因此質(zhì)量損失也越少。降解后期體系中的NVP和PVP基本釋放完畢，此時的質(zhì)量損失則是材料本身降解造成的。

2.2.3復(fù)合材料體外降解過程中長度和直徑的變化(圖6)

圖6　試樣體外降解過程中長度(a)和直徑(b)的變化Fig.6　Length(a) and diameter(b) changes of samples during degradation in vitro

由圖6可以看出，隨著降解時間的延長，3組樣品均呈現(xiàn)出長度增加的趨勢，并且隨著β-TCP含量的增加，長度增加率逐漸減小，30 d后3組樣品的長度增加率分別為32.0%、23.3%和15.0%。3組樣品的長度均在降解第1 d變化最快，而T0和T0.3兩組樣品在第2 d和第3 d長度縮短，之后又繼續(xù)增長。樣品直徑在降解過程中的變化趨勢與樣品長度的變化趨勢相似，但直徑的增加率較長度更大，降解30 d后3組樣品的直徑增加率分別為41.8%、24.7%和16.2%。

降解開始的第1 d樣品尺寸的急劇增加是由于體系內(nèi)親水性強的NVP和PVP的吸水造成的，β-TCP含量高的樣品的伸長率較低，一方面是因為其體系內(nèi)游離的NVP和PVP的含量較低，另一方面是因為無機相的加入對樣品體積起到了一定的穩(wěn)定作用；降解后期樣品長度和直徑的增加主要是由樣品的溶脹造成的。T0和T0.3兩組樣品在降解開始第2 d和第3 d長度和直徑出現(xiàn)了波動，這是由于降解第2 d時NVP和PVP已經(jīng)大量溶出，體系的吸水性急劇下降，造成樣品體積的收縮；T0.6的體積沒有出現(xiàn)波動，也與無機相的穩(wěn)定作用有關(guān)。

2.2.4復(fù)合材料體外降解過程中模擬體液pH值的變化(圖7)

圖7　試樣體外降解過程中pH值的變化Fig.7　pH Value changes of samples during degradation in vitro

從圖7可以看出，隨著降解時間的延長，3組樣品的pH變化值均不斷減小。

從圖2的反應(yīng)式可以看出，模擬體液pH值的降低是由于交聯(lián)產(chǎn)物降解后產(chǎn)生了具有酸性的小分子。由圖7中pH值的變化趨勢不難看出，交聯(lián)產(chǎn)物降解速度在前3 d最快，隨著降解時間的延長，降解速度逐漸減緩。比較3組樣品可以發(fā)現(xiàn)，β-TCP含量高的樣品其模擬體液pH值變化較小，即降解速度更慢，說明無機相的加入可以有效調(diào)節(jié)樣品的降解速度。

2.3　復(fù)合材料體外降解過程中無機物的物相變化(圖8)

圖8試樣體外降解過程中的物相變化

Fig.8Phase changes of samples during degradationinvitro

從圖8可以看出，復(fù)合材料降解前為純β-TCP的物相，從降解1 d到降解30 d，羥基磷灰石(HA)的峰強度越來越高，說明降解過程中有羥基磷灰石產(chǎn)生。

2.4　復(fù)合材料體外降解過程中試樣微觀形貌的變化(圖9)

a1,a2,a3:0 d　b1,b2,b3:1 d　c1,c2,c3:30 d

由圖9可以看出，降解前，樣品表面比較光滑，球形的無機相β-TCP顆粒鑲嵌在有機相UPPE中，顆粒間有輕微的團聚傾向。降解1 d后，樣品表面出現(xiàn)了許多長度約100 nm的米粒狀顆粒，這是羥基磷灰石的典型形貌，說明在樣品表面新生成了羥基磷灰石。降解30 d后，基體形貌與之前差別不大，但米粒狀顆粒消失，試樣表面有許多球狀顆粒物，尺寸與β-TCP顆粒相近，但分布比較均勻，沒有團聚現(xiàn)象，且是附著在UPPE的表面，可能是前期米粒狀羥基磷灰石長大的結(jié)果。

復(fù)合材料降解后1 d和30 d的XRD圖譜和SEM照片均證明了材料表面生成了羥基磷灰石，說明這種復(fù)合材料具有良好的生物相容性。

3結(jié)論

采用溶液聚合的方法制備了主鏈含不飽和雙鍵的聚磷酸酯，以β-磷酸鈣為無機填料制備了可原位固化的聚磷酸酯-β-磷酸鈣骨支架復(fù)合材料。紅外光譜分析表明成功制備出了不飽和聚磷酸酯。復(fù)合材料的體外降解實驗表明其降解速度先快后慢，且前2 d降解速度最快，后期趨于平穩(wěn)；無機相的加入可有效減緩復(fù)合材料的降解速度。XRD圖譜和SEM照片表明降解過程中材料表面有羥基磷灰石生成，說明復(fù)合材料具有良好的生物相容性。

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InVitroDegradation Behavior of A Bone Scaffold Composite Based on Unsaturated Polyphosphoester and Beta-Calcium Phosphate

YUAN Quan,XU Juan-juan,LIU Lu,PENG Zhou,XIA Feng,XIAO Jian-zhong

(StateKeyLaboratoryofMaterialProcessingandMouldTechnology,

CollegeofMaterialsScienceandEngineering,

HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430074,China)

Abstract：A kind of polyphosphoester with unsaturated double bonds in backbone was prepared by solution polymerization method and the composite material was prepared by cross-linking reaction with beta-calcium phosphate(β-TCP) as inorganic filler.The effect of the content of β-TCP on degradation behavior of the composite material in vitro was studied.The phase transformation of the inorganics in the composite was studied by XRD.The surface morphology change of the composite was observed by SEM.The results showed that the degradation rate of the composite was fast at first and slow at last.The addition of β-TCP could slower the degradation rate of the composite material effectively.The appearance of hydroxyapatite on the surface of the composite in the process of degradation demonstrated that this kind of material had good biocompatibility.

Keywords：unsaturated polyphosphoester;beta-calcium phosphate;degradation behavior;biocompatibility

中圖分類號：O 631

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1672-5425(2015)05-0014-06

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2015.05.004

作者簡介：袁泉(1990-)，女，安徽六安人，碩士研究生，研究方向：生物高分子材料及陶瓷材料，E-mail:yuanquan@hust.edu.cn;通訊作者：肖建中，教授，E-mail:jzxiao@126.com。

收稿日期：2015-02-26

基金項目：國家863計劃資助項目(2006AA032443)